植物组织中可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质的系列测定

实验四植物组织中可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质的系列测定
一、目的
从一份植物样品中系统分离和测定可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质等多种成分，不仅对研究植物体内碳、氮代谢，了解植物的生长发育状况有重要意义，亦可以作为鉴定其品质的重要指标，而且也有助于训练基本操作技能。

二、原理
（一）分离提取原理
在80-85%的乙醇中，植物组织中的还原糖、蔗糖以及游离氨基酸和叶绿素等溶解，而淀粉及蛋白质沉淀，再用9.2 mol/L高氯酸溶解淀粉（蛋白质沉淀），最后用0.1 mol/L氢氧化钠溶解蛋白质，然后选用适当的方法测定各个提取液中相应物质的含量。

（二）测定原理
1.蒽酮比色法——可溶性糖含量测定
碳水化合物及其衍生物经浓硫酸处理，生成糠醛，再与蒽酮脱水缩合而生成蓝绿色化合物，在一定范围内其颜色深浅与碳水化合物含量成线性关系。

蒽酮反应的颜色深浅，随温度条件和加热时间而变化，葡萄糖显色高峰在100℃时，加热10 min后出现，而核糖在相同温度下，加热3 min后出现。

此法灵敏度高，糖含量达30 μg即可测定。

2.茚三酮比色法——氨基酸含量测定
氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，产生二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，在570 nm下有最大光吸收。

在一定范围内，其颜色深浅与氨基酸的含量呈正比。

3.考马斯亮蓝G-250结合法——蛋白质含量测定
考马斯亮蓝在游离状态时呈红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，后者最大光吸收在595 nm，在一定范围内（0-1000 μg /mL），其颜色深浅与蛋白质的含量呈正比。

此法快速灵敏，反应在2 min内即达到平衡，室温1h内颜色稳定，而且干扰物也少。

三、实验用品
（一）实验材料：植物样品。

（二）器皿：
1. 25 mL刻度试管⨯8 ，15 mL试管⨯20；
2. 10 mL离心管⨯2；
3. 容量瓶：50 mL⨯1 ，25 mL⨯1；
4. 移液管：5 mL⨯2，2 mL⨯4，1 mL⨯2，0.1 mL⨯2；
5. 恒温水浴锅；
6. 离心机；
7. 电子天平；
8. 分光光度计。

（三）试剂：
1. 样品分离提取
（1）80%乙醇；
（2）9.2 mol/L 高氯酸，4.6 mol/L 高氯酸；
（3）0.1 mol/L 氢氧化钠；
2. 可溶性糖及淀粉测定
（1）葡萄糖标准液（100 μg/mL）：0.1 g无水葡萄糖溶于蒸馏水中，定容至1000 mL；（2）硫酸-蒽酮试剂：0.2 g蒽酮，1 g硫脲（阻氧化剂），缓缓加入100 mL浓硫酸，边加边搅拌，溶解后呈黄色透明溶液，贮于棕色瓶中，4℃冰箱保存；
3. 氨基酸测定
（1）60%乙醇；
（2）水合茚三酮：1.2 g茚三酮，加入30 mL正丙醇，搅拌使其溶解，再加入60 mL正丁醇和120 mL乙二醇，最后加入18 mL pH 5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液混匀，贮于棕色瓶，4℃冰箱保存；
（3）乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.4):乙酸钠54.4 g，加入100 mL蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至原体积的一半，冷却后加30 mL冰乙酸，用蒸馏水稀释至100 mL；
（4）标准氨基酸（5 μg/mL）：取80℃下烘干的亮氨酸11.7 mg，溶解在10%的异丙醇中，并用10%异丙醇稀释至25 mL，取5 mL，用蒸馏水稀释至50 mL；
（5）0.1%抗坏血酸：50 mg抗坏血酸溶于50 mL蒸馏水中。

现用现配；
4. 蛋白质含量测定
（1）牛血清蛋白标准液（1000 μg/ml）：100 mg牛血清蛋白溶于100 mg蒸馏水中，贮于4℃冰箱；
（2）考马斯亮蓝G-250溶液：100 mg考马斯亮蓝G-250溶解于50 mL95%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100mL，用蒸馏水定容至1000 mL。

四、操作步骤
（一）分离提取（每次离心转速3000-3500rpm）
沉淀弃去
（二）测定
1. 可溶性糖及淀粉的测定
加入硫酸-蒽酮试剂时，最好将各管放在冷水中，沿管壁缓缓加入，全部加完后再混匀。

将以上各管在100℃水浴中加热10 min ，取出后用自来水冷却，620 nm 比色测定。

（2）样品测定
分别取可溶性糖提取液、淀粉提取液各1mL+1mL 蒸馏水（根据含量而定），显色与标准曲线相同。

（3）计算
2. 淀粉测定
吸取上述淀粉提取液2 mL （或1 mL+1 mL 水）于大试管中，用测定可溶性糖的方法测定。

3. 游离氨基酸含量测定
加完试剂后混匀，置沸水浴加热15 min ，然后取出放在冷水中迅速冷却并摇动，使加热时形成的红色逐渐被氧化而褪色，直至溶液呈紫色时，用60%的乙醇定容至10 mL ，混匀，570 nm 比色测定， （2）样品测定
样品液总体积(mL )
显色用样液体积
×稀释倍数
查标准曲线数（μg ）×
样品重（mg ）×1000 ×100
可溶性糖%= 查标准曲线数（μg ）× 样品重（mg ）×1000
×100
淀粉%=
样品液总体积(mL )
显色用样液体积
×稀释倍数
0.9×
吸取上述样品提取液2mL （或1mL+1mL 水），显色与标准曲线相同。

（3）计算
4. 蛋白质含量测定
混匀后，分别准确吸取各管0.1mL 至另外6个试管中，加5 mL 考马斯亮蓝G-250试剂，混匀，放置2 min 后595 nm 比色测定。

（2）样品测定
准确吸取蛋白质提取液0.1 mL ，显色与标准曲线相同。

（3）计算
五、思考题
从植物样品中进行系列提取和测定应注意哪些问题？
样品液总体积(mL )
显色用样液体积
×稀释倍数 查标准曲线数（μg ）× 样品重（mg ）×1000
氨基态氮量(mg/100g 干样品)=
×100
样品液总体积(mL )
显色用样液体积 查标准曲线数（μg ）×
样品重（mg ）×1000
×100
蛋白质%=。