核酸探针与羧基微球偶联的实验方案

核酸探针与羧基微球偶联

根据Bio-Plex公司的羧基微球偶联探针方案，选取适当编号的羧基微球，用EDC将合成的氨基修饰探针分别偶联到不同标号的羧基微球上制备核酸探针微球，偶联方法如下:

1.将选定编号的梭基微球及2瓶未开封EDC粉末(10mg/瓶)置室温平衡60min。

2.将待偶联的带C12连接臂的氨基修饰核酸探针提前用灭菌ddH2O溶解，至

终浓度为0.1 nmol/μl，高速震荡混匀。

3.羧基微球用涡旋震荡仪高速震荡30秒，然后置超声仪中超声震荡2次，每

次各15秒。

4.用移液器移取100μl微球(Bio-PlexTM 羧基微球）加入1.5ml Eppendorf管中。

5.14000xg离心4min使微球沉淀。

6.小心移除上清液，在每管中加入加入8.5μl 0.1M MES (pH4.5)，涡旋震荡混

匀。

7.每种核酸探针各取1μl(0.1 nmol/μl)加入到对应编号的羧基微球管中。

8.在10 mg/瓶的EDC粉末瓶中加入1 ml 灭菌ddH2O，充分溶解EDC粉末，

新鲜制备浓度为10 mg/ml 的EDC溶液，向每种羧基微球管中加入0.5μl EDC 溶液，立即涡旋震荡混匀。

9.各羧基微球管用铝箔包盖避光，置试管震荡器上缓和震荡(约500rpm )室温孵

育30min。

10.向每管中重复加入0.5μl新鲜制备的10mg/ml浓度的EDC溶液，避光缓和震

荡孵育30min 。

11.向每管中加入1 ml 0.02% Tween 20涡旋震荡混匀。

12.14000xg离心4min。

13.小心移除上清液，再向每管中加入l ml 0.1% SDS，涡旋震荡混匀。

14.16000xg离心4min。

15.小心移除上清液，加入20TE （pH8.0）涡旋震荡混匀。

16.微球计数:用血球计数仪对完成偶联的微球悬液进行计数，每μl微球数不少

于4×104个为宜。

17.偶联完成的微球悬液避光储存于2~10℃，备与验证序列杂交确认偶联反应的

质量。

杂交验证

偶联完成的微球，需通过与验证序列杂交来鉴定偶联反应的质量。

1准备工作微球混合液

对偶联完成的核酸探针微球进行杂交验证时需准备约30个反应孔的工作微球混合液。

1.1选择合适的核酸探针偶联微球组，将每种核酸探针偶联微球混合物在涡旋震荡仪上高速震荡混匀40秒，然后按照下述步骤准备工作微球混合液:

在1.5ml离心管中加入660μl 1.5x TMAC杂交缓冲液(微球稀释液)。

b.对每种核酸探针偶联微球各取150000个微球加入到混合液离心管中。按V=150000/B （B=微球浓度，V=需加入每种微球混和物的体积)的计算公式计算每种微球混和物所需加入的体积。

1.2用双蒸水稀释至终体积为990μl。

1.3置冰上暂存。(勿冷冻)

2准备验证序列混合液

准备一份新鲜的验证序列稀释液，每种验证序列稀释至终浓度为10fmol/

操作步骤如下:

2.1从1 nmol/μl (1mM)的贮存液开始，在996μl TE (pH8.0)溶液中加入验证序列(1:250稀释)，彻底混和均匀。得到每种验证序列的浓度为4pmol/μl溶液。

2.2取2.5μl上述稀释液加入到997μl TE (pH8.0)中(1:400稀释)，彻底混和均匀。得到每种验证序列的浓度为10fmol/μl的溶液。

2.3储存在冰中待用。

3杂交

3.1震荡30秒混匀工作微球混合液。

3.2在一块标准PCR板中每孔加入33μl 工作微球混合液待用。

3.3按照下列表格所示在每排的3个孔中加入验证序列混合液和TE:

A.17μl TE 0

B.0.5μl Oligo Mix and 16.5μl TE.......(5 fmol)

C.1μl Oligo Mix and 16μl TE............(10 fmol)

D.2μl Oligo Mix and 15μl T

E............(20 fmol)

E.5μl Oligo Mix and 12μl TE............(50 fmol)

F.10μl Oligo Mix and 7μl TE.............(100 fmol)

G 20μl Oligo Mix..............................(200 fmol)

3.4轻轻上下吹打几次混匀反应孔。

3.5用胶盖盖上反应板以防蒸发，在95-100℃下孵育5分钟。

3.6置于摇床孵育箱中以适当的杂交温度下孵育15分钟。

3.7在3 ml 1 x TMAC溶液中加入9μl streptavidin-R-phycoerythrin (SA-PE) (1 mg/ml)新鲜制备终浓度为3μg /ml SA-PE的报告混合，漩涡混合均匀。

3.8在恒温箱中将过滤板预热至退火温度

3.9将样品转移到已预热的过滤板。在1-2 inches Hg(25-50毫米汞柱)真空下快速移去杂交缓冲液。

3.10从真空泵上移出并在每孔中加入100μl报告混合液。轻轻上下吹打混匀(或密封板后轻轻摇动)。

3.11室温下孵育反应板5分钟。

3.12取50μl在Bio-Plex 200悬液芯片检测系统按相应操作步骤进行检测分析。

参考文献

[1] 陈沁. 一种基于悬液芯片的呼吸道病毒多重检测方法[D]. 复旦大学, 2013.