细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

细胞迁移侵袭实验操作步骤 (Transwell)
洗 1 次 ; 每孔加入 100ul 细胞悬液 ; 下腔室中加入 600ul 无血清 条件培养基 ; 37 ℃ 培 养 箱 中 , 孵 育 20-24h ; 取 出 transwell 用 PBS 洗 2 遍 , 5% 戊 二 醛 固 定 , 4 ℃ ;PBS 洗 2 遍, 加入结晶紫 ( 0、 1% ) 染色 , 室温 0 、5h , PBS 洗 2 遍 , 用棉球 擦去上表面细胞 , 显微镜下观察 transwell 小室就是否可以重复利用 , 该怎样消毒 用棉签轻轻擦去胶与反面细胞 , 清水冲洗 , 超声清洗 , 低挡 ,30min, 清水 3×5min, 蒸馏水 3×5min, 室温凉干 , 用前紫外线小室正面 3h, 反面 6h, 微波 , 低火 10min×2, 效果很好。
细胞侵袭实验 (cell invasion assay)
细胞迁移侵袭实验操作步骤 (Transwell)
实验材料
(1)Matrigel (BD 5mg/ml),-20 (2) 其余材料同迁移实验
℃保存
操作步骤
(1)Matrigel 在 4℃过夜融化 ; (2) 用 4℃预冷的无血清培养基稀释 Matrigel 至终浓度 1mg/ml, 冰上操作 ; (3) 在 chamber上室底部中央垂直加入 100μ l 稀释后的 Matrigel,37 ℃温育 4－5
常会有气泡产生 , 一旦产生气泡 ,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了 特别留心 ,一旦出现气泡 ,要将小室提起 ,去除气泡 ,再将小室放进培养板。
, 在种板的时候要
③培养细胞 :常规培养 12 － 48h( 主要依癌细胞侵袭能力而定 )。 24h 较常见 ,时间点的选择除
了要考虑到细胞细胞侵袭力外 ,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
0、 1% 结晶紫染色 20 min, 用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞 ,用 PBS 洗 3 遍。
400 倍 显微镜下随即五个视野观察细胞 ,记数。
实验材料
(1)Transwell chamber: 24-well, 8
、 0- μm pore membranes (Corning)
(2) 细胞培养相关试剂 : 无血清培养基 ,10 ％血清培养基 ,PBS,0 、02％EDTA
(5) 细胞悬液加入膜中央 , 尽量保证液面水平 ; (6) 固定染色擦洗时动作小心 , 避免擦去膜底面的细胞。 但一定要充分擦净膜表面
上未迁移的细胞 , 以免影响读数。尤其就是膜周边上可用细牙签或小镊子缠 上湿棉花擦洗 , 但要小心避免将膜戳破 ; (7)Chamber 与膜上都无法标记 , 操作时应小心避免混淆实验组与对照组 ; (8) 充分晾干 , 避免残留水分导致镜下聚焦不一致。
12 －24h, 进一步去除血清的影响。但这一步并不
就是必须的。
②消化细胞 ,终止消化后离心弃去培养液 ,(用 PBS 洗 1－ 2 遍 ), 用含 BSA 的无血清培养基重
悬。调整细胞密度至 5×105/ml 。
2、 3 接种细胞 ①取细胞悬液 100μl 加入 Transwell 小室。 ②24 孔板下室一般加入 600μl 含 20%FBS 的培养基 ,特别注意的就是 ,下层培养液与小室间
配套 ,BD 公司的 Matrigel, 无血清 DMEM,(1% 胎牛血清 )DMEM 与 1640 培养基 ,DMEM 完全
培养基 ,1640 完全培养基 (也可加到 20% 血清 ),无菌 PBS, 棉签 ,胰酶 ,4% 多聚甲醛固定液或者
甲醇 ,结晶紫染液 (0 、 1%(g/ml)PBS 结晶紫 )
2 步骤与流程 2、 1 基质胶铺板 : 用 BD 公司的 Matrigel 1:8( 根据细胞产生 mmp 的量来决定 )稀释 ,包被 Transwell 小室底部膜
的上室面 ,置 37℃ 30min 使 Matrigel 聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。
2、 2 制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿
注意事项
(1) 根据待测细胞体积大小选择合适孔径的 chamber。常用的为 8、0- μm孔径 ( 如 AGS细胞 ), 如果细胞体积较大可以考虑用 10- μ m孔径 ;
(2) 根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数与迁移时间。 常规 24-well chamber 接种细胞数约为 2≈5×104/well, 迁移时间 12≈36 小时 ;
室温固定 30 分钟 ; (5) 取出 chamber, 吸干上室固定液 , 移到预先加入约 800μl Giemsa染液的孔中 ,
室温染色 15－30 分钟 ; (6) 轻轻用清水冲洗浸泡数次 , 取出 chamber, 吸去上室液体 , 用湿棉棒小心擦去
上室底部膜表面上的细胞 ; (7) 用小镊子小心揭下膜 , 底面朝上晾干 , 移至载玻片上用中性树胶封片 ; (8) 显微镜下取 Fra Baidu bibliotek 个随机视野计数 , 统计结果。
2、 4 结果统计 直接计数法 , “贴壁 ”细胞计数 ,这里所谓的 “贴壁 ”就是指细胞穿过膜后 而不会掉到下室里面去 ,通过给细胞染色 ,可在镜下计数细胞。
,可以附着在膜的下室侧
取出 Transwell 小室 ,弃去孔中培养液 ,用无钙的 PBS 洗 2 遍 ,甲醇固定 30 分钟 ,将小室适当风 干。
(3) 由于 Corning 公司的 24-Transwell 内含 12 个独立的 chamber, 为了避免操作 污染 , 每次实验可预先另准备一块 24 孔普通培养板 (Corning);
(4) 如果细胞迁移能力较弱 , 下室液体可用 3T3 细胞无血清培养 24 小时获得的上 清加 50μg/ml FN(Fibronectin), 具体可查阅相关文献 ;
中的成分可以影响到上室内的细胞 ,应用不同孔径与经过不同处理的聚碳酸酯膜 行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
,就可以进
实验步骤 :
1 材料准备 : 可拍照显微镜 ,Transwell 小室 ,孔径 8μm,没包被胶的 (Coster 与 Corning 公司的也较常 用),Transwell 迁移实验的细胞培养板 24 孔板。细胞培养板应当与购买的 Transwell 小室相
用无血清培养基悬浮细胞 , 计数 , 调整浓度为 2×105 /ml; (3) 在下室 ( 即 24 孔板底部 ) 加入 600－800μl 含 10％血清的培养基 , 上室加入
100－150μl 细胞悬液 , 继续在孵箱培养 24 小时 ; (4) 用镊子小心取出 chamber, 吸干上室液体 , 移到预先加入约 800μl 甲醇的孔中 ,
小时使其干成胶状 ; (4) 后续步骤同迁移实验 (1-8) 。
注意事项
(1)Matrigel 在过高或过低的温度均易凝固 , 因此操作所需枪头与离心管应提前
在 4℃预冷 ;
(2) 铺胶时保证液面水平 , 胶的厚度均匀一致 , 切勿产生气泡 ;
(3) 其她注意事项同迁移试验。
其她
Transwell 做肿瘤侵袭实验的具体步骤 (1) 基质胶准备 :将冻存于－ 80 度冰箱的 BD matrigel 4 度过夜 ( 24h ), 变成液态 ; (2) 取 300ul 无血清培养基 , 加入 60ul ( 或 50ug/ 每室 ) Matrigel , 混匀 ,( 4℃操作 ,最好在 冰浴上 ),加入上室各 100ul ( 3 个室 ); 放入 37 ℃培养箱中 ,孵育 4-5h ( >5h ); 此间经常观察 , 当出现 “白色层 ”时 , 说明已经变为固态。 注释 :无血清培养基与基质胶按 1: 5 稀释 , 每孔加 50ul , 在 37℃培养箱中 1-2h 。 (3) 消化细胞 , 无血清培养基洗 3 次, 计数 , 配成细胞悬液 ; (4) 用无血清培养基洗 Matrigel 洗 1 次; 每孔加入 100ul 细胞悬液 ; (5) 下腔室中加入 500ul 含有 20 ％FBS 条件培养基 ; (6) 37℃培养箱中 ,孵育 20-24h ; (7) 取出 transwell 用 PBS 洗 2 遍 , 5%戊二醛固定 , 4℃ ; (8) 加入结晶紫 ( 0、 1% ) 染色或 Giemsa 染色 ( 5 －10min ), 室温 0、 5h , PBS 洗 2 遍 , 用 棉球擦去上表面细胞 , 显微镜下观察。 迁移实验 transwell 在 24 孔板中浸泡 1 小时 ; 消化细胞 , 无血清培养基 洗 2 次 , 计数 , 配成 细胞 悬液 , 每孔加入 100ul 细胞悬液 ; 加药刺激 ; 下腔室中加入条件培养基或其她刺激因 子 ; 37 ℃培养箱中 ,孵育 20-24h ; 取出 transwell 用 PBS 洗 2 遍 , 5% 戊二醛固定 , 4℃;PBS 洗 2 遍, 加入结晶紫 ( 0、1% ) 染色 , 室温 0、5h , PBS 洗 2 遍 , 用棉球擦去上表 面细胞 , 显微镜下观察计数 10 照相 , 记录。 侵袭实验 取 300ul 无血清培养基 , 加入 30ul ( 或 50ug/ 每室 ) Matrigel , 混匀 ,( 4 ℃ 操作 ,最 好在冰浴上 ),加入上室各 100ul ( 3 个室 ); 放入 37 ℃ 培养箱中 ,孵育 4-5h ( >5h ); 消化细胞 , 无血清培养基洗 3 次 , 计数 , 配成 细胞悬液 ; 用无血清培养基洗 Matrigel
细胞迁移侵袭实验操作步骤 (Transwell)
迁移实验 (cell migration assay)
实验介绍
细胞迁移与侵袭实验将 Transwell 小室放入培养板中 , 小室内称上室 ,培养板内称下室 ,上下层
培养液以 聚碳酸酯膜 相隔 , 将研究的细胞种在上室内 , 由于聚碳酸酯膜有通透性 , 下层培养液
细胞迁移侵袭实验操作步骤 (Transwell)
(3) 固定液 : 甲醇 (4) 染色液 :Giemsa 染液 (5) 封片剂 : 中性树胶 (6) 其她 : 小镊子 , 棉棒 , 载玻片 , 盖玻片
操作步骤
(1) 所有细胞培养试剂与 Transwell chamber 放在 37℃温育 ; (2) 待测细胞培养至对数生长期 , 消化细胞 , 用 PBS与无血清培养基先后洗涤一次 ,