第9章 酶免疫试验 PPT课件

酶和酶作用底物
常用底物
ALP 底物
对-硝基苯 磷酸酯（ pNPP ）
经AP作用后的产物 为黄色对硝基酚， 最大吸收峰波长为 405 nm。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基 酶作用后，生成 β-D半-乳糖 高强度荧光物 ， 苷（ 4MUG ） 用荧光计 测量。
第二节 酶免疫试验的分类
酶
酶免疫组化 组织切片或其它标 本中抗原的定位
化学发光酶免疫试验
荧光酶免疫试验
荧光酶免疫试验
第六节 酶免疫试验的临床应用 及常用商品试剂的方法特点
（一）均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质 的检测。 （二）异相酶免疫 ELISA用于临床血液及其他体液标志物 ELISPOT监测HIV等疫苗研究免疫应答反应、移植研 究、Th0/Th1/Th2细胞转换分析、自身免疫研究、 过敏机制探讨、传染性疾病研究。 （三）发光酶免疫试验用于微量物质的定量检测.
免
疫
均相：不需要分离
试
验 酶免疫测定技术
液体标本中抗原或
固相酶免疫试验 异相
抗体的定性和定量
液相酶免疫试验
一、均相酶免疫试验
用于小分子激素和半抗原（如药
原
物）的测定
理 酶标记物与相应的抗原或抗体结
合后，标记酶的活性会发生改变，
不用分离结合和游离酶标记物，通
过测定标记酶的活性的改变，而确
定抗原或抗体的含量。
胺 (OPD)
(5-ASA )
2,2′-氨基-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 (ABTS)
酶和酶作用底物
HRP的常见底物
OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。
原理及特点
原理： ➢酶标抗体（抗原）与抗原（抗体） 的特异性反应 ➢酶对底物的显色反应 ➢对抗原或抗体进行定位、定性或 定量的测定分析
原理及特点
特点： 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的新方法。
第一节 酶免疫试验的组成要素
二、包被抗原或抗体
包被
coating 将抗原或抗体结合于固相载体
（直接包被、间接包被）
封闭 用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～
block 20%小牛血清消除固相载体表面未 ing 结合的位点，消除非特异性吸附
直接包被
稀释抗原或抗体（用0.05mol/LPH9.6的碳酸
盐缓冲液稀释抗原或抗体到3-10µg/mL）
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
4、加酶标抗体
与特异性抗原结
合，加底物显色
+
捕获法原理
EE E
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
4、加酶标抗体 无抗原结合，
- 加底物不显色
第三节 习 题
1 下列哪一种ELISA最常用于抗原的测定（ ）
4°c过夜 封闭（牛血清白蛋白或小牛血清）
间接包被
亲和素-生物素化抗体（抗原） SPA-抗体（抗原）
间接吸附于固相载体上
三、酶结合物
1.辣根过氧化物酶（HRP） 2.碱性磷酸酶 （ALP) 3.β-半乳糖苷酶 (β-Gal)
四、酶的显色底物与酶促发光底物
常用底物 四甲基联苯胺 TMB
EE E
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
3、加酶作用
EE E
E
的底物不显色
3、加酶作用
或显色弱
的底物显色
+
竞争法测抗原 -
ELISA检测抗体的方法
间接法 方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的
抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。 优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 应用 常测定HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等
间接法测抗体 -
E EE
+
E EE E EE
ELISA检测抗体的方法
双抗原夹心法 ➢原理：类似双抗体夹心法 ➢操作步骤：类似 ➢应用：乙型肝炎表面抗体
ELISA检测抗体的方法 竞争法 原理：类似检测抗原的竞争法 应用：HBcAb和HBeAb的检测
竞争法
非经典竞争法
非经典竞争法
ELISA检测抗体的方法 捕获法 应用：
特点 第七节 影响酶免疫试验的主要因素
酶免疫试验(enzyme immunoassay,EIA)
以酶标记抗体（抗原）作为主要试 剂，将酶高效催化反应的专一性和抗 原抗体反应的特异性相结合的免疫检 测技术。
酶免疫测定技术 酶免疫组织化学技术
原理及特点 抗原抗体反应的特异性
+ 酶高效催化反应的专一性
邻苯二胺 (OPD)
HRP的常见底物 5-氨基水杨酸 (5-ASA )
2,2′-氨基-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 (ABTS)
酶和酶作用底物
HRP的常见底物
OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。
第九章 酶免疫试验
医学技术学院免疫教研室
三大经典标记技术 放 荧酶 射 光免 免 免疫 疫 疫技 技 技术 术术
掌握：酶联免疫吸附试验； 熟悉：酶和酶作用底物、固相载体、酶
免疫测定的应用； 了解：酶标记抗体或抗原、酶免疫技术
的分类；
第一节 酶免疫试验的组成要素 第二节 酶免疫试验的分类 第三节 酶联免疫吸附试验 第四节 酶联免疫斑点试验 第五节 发光酶免疫试验 第六节 酶免疫试验的临床应用及常用商品试剂的方法
酶和酶作用底物
常用酶
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基）
与275nm（主酶） OD ELISA中应用最为广
值之比
泛的标记用酶
酶和酶作用底物
常用酶 碱性磷酸酶（AP） 菌源性AP
A 多用于大分子物质的测定
B 酶标抗原和抗体在固相载体表面形成复合物，作用 于底物显色
C 需要分离结合和游离酶标记物
D 常利用酶标记抗原与抗体结合后的空间位阻降低酶 活性
E 酶标抗原与待测抗原竞争结合抗体，故最终酶活力 的大小与标本中抗原量负相关
2 酶免疫技术是根据何种特性分为均相和异相的（ ） A 抗原特性 B 抗体特性 C 抗原抗体反应后是否需要分离结合和游离酶标记物 D 酶的稳定性 E 载体特性
肠黏膜AP
β–半乳糖苷酶 （β-Gal）
用于均相酶 免疫测定
酶和酶作用底物
HRP的底物
常用底物
HRP
DH2+H2O2→ → → D+2H2O H2O2为受氢体， HRP对受氢体的专一性很高
供氢体DH2习惯上被称为底物， 底物有多种
酶和酶作用底物
常用底物 四甲基联苯胺 TMB
邻苯二
HRP的常见底物 5-氨基水杨酸
包被有待测细胞因子抗体的微孔板
基
+
分泌相应细胞因子的待测细胞
本
有或无刺激物培养
原 细胞因子被板上的特异性抗体捕获
理
后续的反应如同ELISA
一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜
色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关
酶联免疫斑点试验(ELISPOT)
第五节 发光酶免疫试验（LEIA）
原理：参与催化某一发光反应的酶来标记抗 体（或抗原），在抗原-抗体反应后加入发光 物，酶催化和分解底物发光，由光检测仪检 测发光强度，最后通过标准曲线计算出被测 物的含量。
E ELISA间接法
5 关于ELISA竞争法，下列叙述正确的是（ ）
A 用于检测抗原
B 被测物与酶标记物的免疫活性各不相同
C 被测物多则标记物被结合的机会少
D 待测管的颜色比对照管的浅则表示被测物量少
E 结合于固相的酶标记抗原量与被测抗原量成正比
第四节 酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot)
A 双抗体夹心法ELISA B 间接法ELISA
C 竞争法ELISA D 捕获法ELISA E 补体结合法
2 捕获法主要用于何种物质的测定（ ）
A IgG B IgA C IgM
D IgD
E IgE
3 下列关于双抗体夹心法原理，不正确的是（ ）
A 使用分别针对抗原不同决定簇的两种单克隆抗体作 为酶标记物
三、方法类型及反应原理 三个必要试剂
固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物）
酶反应的底物
ELISA检测抗原的方法 双抗体夹心法 方法：用已知抗体包被，加入待检血清 ，再加酶标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗 原 测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、 HCG等
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E EE
E
E
E
E EE
第三节 酶联免疫吸附试验
一、基本原理
原理 1
包被
反应加入待测抗
体或抗原和酶标
2
抗原或抗体
3 洗涤使结合在
固相上的抗原 抗体复合物与 未结合的分离
底物显色
4 定性或定量 的分析
二、ELISA方法建立的基本步骤
（一）ELISA方法类型的建立 1 初步确定方法类型 2.工作条件的优化 3.ELISA检测结果测定 （二）对建立的方法进行评价
小结
酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标 记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法， 在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底 物的作用进一步提高敏感性。
均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的 测定，异相酶免疫测定根据是否使用固相支持物， 又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。
标记酶的要求：
均相酶免疫测定 最具代表性的两种技术：
酶放大免疫分析技术EMIT enzyme-mutiplied
immunoassay technique
克隆酶供体免疫分析 CEDIA cloned enzyme donor immunoassay
酶放大免疫分析技术EMIT示意图
常用酶：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和溶菌酶
1.纯度高,活性强,催化反应效率高。
2.易与抗体或抗原结合标记后酶活 性稳定，不影响抗原抗体反应性。
3.作用专一，且酶活性不受样品其 他成分影响。
标记酶的要求：
4.酶催化底物后产生的产物易于判 断或测量，方法敏感，重复性好，简 单易行。
5.酶、辅助因子及其底物对人体和 环境无害，易于配制、保存，价廉易 得。
B 一种单克隆抗体作为固相抗体，另一种作为酶标抗 体
C 可使标本和酶标抗体同时加入成为一步法
D 用于检测二价或二价以上的抗原
E 采用高亲和力的单克隆抗体可提高检测的灵敏度和 特异性
4 下列何种方法用一种标记物可检测多种被测物（ ）
A ELISA双抗体夹心法 B ELISA竞争法
C 放射免疫法 D ELISA捕获法
酶放大免疫分析技术EMIT示意图
克隆酶供体免疫分析 （CEDIA）示意图
与均相 二、异相酶免疫试验
不同之处
需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联 免疫吸附试验（ELISA） 是目前最为常用 的固相酶免疫测定
第二节 习 题
1 关于均相酶免疫测定，下列哪项正确（ ）
+
双抗体夹心法测抗原 -
ELISA检测抗原的方法
竞争法 方法：用已知抗体包被，同时加入待测血清 和酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被 物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半 抗原（药物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
第七节 影响酶免疫试验的主要因素
一、试剂盒原材料因素 二、标本因素 三、实验室环境因素 四、操作因素
抗原抗体选择
抗原要求纯度高，抗原性完整
抗体需要特异性好、效价高、亲合力 强以及比活性较高，能批量生产，易 纯化。
思考题
1．酶免疫技术的要点？ 2．酶联免疫吸附试验的原理? 3．常用的底物有哪几类？特点？ 4．常用的酶有哪几类？特点？
一、固 相 载 体
➢固相抗体或抗原就是把抗体或抗原 结合到固相载体的表面
➢固相抗体或抗原是非均相酶免疫 技术中将游离和结合的酶标记物 迅速分离的最常用方法
固相载体
要求
•结合抗体或抗原的容量大 •抗体或抗原牢固地固定在其表面 •不影响免疫反应性
•利于反应充分进行
种类
•固相方法简便易行，快速经济 •微孔板 •磁微粒 •膜载体
病原体急性感染诊断中的IgM型抗 体
甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体
原理：
捕获法
抗人IgMμ链抗体包被
捕获待测标本中IgM类 抗体
加入特异性抗原和酶 标记特异性抗原的抗 体
底物显色
EE
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合