细胞原代培养和传代
原代培养和传代培养
原代培养:即第一次培养，是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。
有几方面含义：●培养物一经接种到培养器皿（瓶）中就不在分割，任其生长繁殖；●原代培养中的“代”并非细胞的“代”数，因为培养过程中细胞经多次分裂已经产生多代子细胞；●原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液，也不等于不更换培养器皿。
正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。
所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。
目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。
此细胞系一直延用至今。
原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。
但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能够传到40～50代，这种传代细胞叫做细胞株。
细胞株的遗传物质没有发生改变,在培养过程中其特征始终保持。
当细胞株传至50代以后又会出现“危机”，不能再传下去。
但是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，有可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系。
原代培养是建立各种细胞系（株）必经的阶段，其是否成功与组织污染与否、供体年龄、培养技术和方法、适宜培养基的选择等多种因素有关。
由于原代培养的细胞转化性极小，对病毒敏感性好，因此适应制备疫苗等生物制品；但也存在有潜在外源因子、不能事先检查标本、且受供体年龄健康状况的影响而导致批间差异大等缺陷。
目前常用的原代细胞培养有鸡胚成纤维细胞及猪肾、猴肾、地鼠肾等原代细胞。
原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养条件下培养等步骤，在所有的操作过程中，都必须保持培养物及生长环境的无菌。
多数情况下，分散的细胞若属于贴壁依赖型细胞，就能黏附、铺展于培养器皿和载体表面生长而形成细胞单层，这种培养方式称为单层细胞培养（monolayer culture），又叫贴壁培养（adherent culture）。
传代培养和原代培养的概念辨析
传代培养和原代培养的概念辨析1．原代培养和传代培养的概念从机体上获取的组织，通过酶或机械方法分散成单个细胞进行培养，在首次传代前的培养一般称为原代培养。
原代培养的最大优点是：组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。
原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养，也就是将细胞按1：2~1：4的比例传代。
但严格说来，不论在进行传代时稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养。
传代代数与细胞的世代（增殖代数）并不是同一个概念。
在细胞培养时，所说的“第10代细胞”，仅指该细胞已经传代10次；细胞传一代后，一般能倍增3~6次，经过三个阶段，即潜伏期、指数生长期和平台期。
当细胞达到平台期时，就需要进行传代培养，否则细胞会中毒，发生形态改变，甚至死亡。
2．关于传代培养在进行传代时，如果是悬浮细胞，只需简单稀释即可，若需完全更换培养液只需低速离心沉淀，再悬浮于合适的培养液中即可。
一般细胞每毫升接种数量为5?104~8?105个，传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。
在培养过程中，培养液会由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。
如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代，多数细胞需用胰蛋白酶处理将细胞从生长物表面分离下来，以促进传代培养。
3．细胞系和细胞株细胞系和细胞株，两者曾一度混用，导致有些文献中概念不清。
下面所指的概念是现在国内外比较通用的，也是绝大多数研究者接受的观点。
原代培养物经首次传代成功即称为细胞系（Cell Line），因此细胞系可泛指一般可能传代的细胞。
其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的称为有限细胞系。
大多数二倍体细胞为有限细胞系。
通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株（Cell Strain），也就是说，细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。
细胞生物学名词解释
细胞生物学名词解释
一
1·原代培养:直接从体内获取的组织或细胞进行的首次培养。
2·传代培养:当原代细胞经增殖达到一定密度后,将细胞分散,
从一个培养器以一定比例移到另一个或几个容器中的扩大培养。
3·细胞培养:是指细胞在体外的培养技术,即无菌条件下,从机体中取出组织或细胞,模拟机体内正常生理状态下生存的基本条件,让它在培养器皿中继续生存、生长和繁殖的方法。
4·分辨率:能够区分相近两点的最小距离。
二
1.单位膜主动运输被动运输简单扩散易化扩散
2.载体蛋白通道蛋白
3.胞吞作用胞吐作用受体介导的胞吞作用
4.细胞被
5.协同作用
三
1.内膜系统:细胞内那些在结构、功能及发生上密切关联的膜性结构细胞器的总称。
2.微粒体:细胞内膜性细胞器破坏后,形成的由单位膜封闭的小泡。
3.多聚核糖体:多个核糖体串连在同一条mRNA分子上,形成多聚核糖体。
4.信号肽:是被合成蛋白多肽链N端的一段特殊氨基酸序列,是指导蛋白质多肽链转移到糙面内质网上进行合成的关键因素。
5.囊泡转运:囊泡以出芽的方式,从一种细胞器膜产生、脱离后又定
向地与另一种细胞器膜相互融合的过程。
6.信号假说:指导蛋白质多肽链转移到糙面内质网上进行合成的关键因素,是被合成蛋白多肽链N端的一段特殊氨基酸序列,即信号肽。
原代细胞和传代细胞名词解释
原代细胞和传代细胞名词解释嘿，你知道吗，在细胞的世界里，有原代细胞和传代细胞这两个重要的角色呢！咱就说，原代细胞啊，那可是直接从生物体组织里分离出来的“小宝贝”呀！就好比是刚从果园里新鲜采摘下来的水果，带着最原始的味道和活力。
比如说，从一只可爱的小老鼠身上取下来的细胞，这就是原代细胞啦！它有着独特的性质和特点呢，就像每个孩子都有自己独一无二的个性一样。
而传代细胞呢，则是原代细胞经过培养后传代培养出来的。
这就好像一棵小树苗，经过不断地培育和繁衍，变成了一片小树林。
想象一下，原代细胞是最初的那颗种子，而传代细胞就是从这颗种子生长出来的众多小树。
它们之间有着密切的联系，但又有着不同之处。
原代细胞很珍贵呀，为啥这么说呢？因为它更接近生物体本身的状态呀，能给我们提供最真实的信息。
就像你要了解一个地方的风土人情，肯定是找当地原汁原味的居民去了解更靠谱呀，对吧？传代细胞呢，虽然可能在培养过程中会有一些变化，但它们也有着自己的用处呀，比如可以进行更大量的实验研究。
你看，这原代细胞和传代细胞是不是很有趣？它们就像细胞世界里的两颗明星，各自闪耀着自己的光芒。
我们研究它们，了解它们，不就是为了能更好地探索生命的奥秘吗？所以呀，可别小瞧了它们哟！我觉得呀，它们真的是太重要啦，对于我们了解生命、攻克疾病等都有着不可替代的作用呢！。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
原代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒原代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
原代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏细胞培养是指将生物体内分离出的细胞种植在培养基中，供其生长和繁殖的实验过程。
细胞培养已成为生命科学和医学研究中不可或缺的基础工具。
在细胞培养中，常见的术语有原代培养、传代培养、冻存和复苏。
原代培养原代培养是将从组织中分离出的细胞直接进行培养，即首次培养。
通常将组织切割成小段或分散成单细胞悬液，加入培养基中，使其中的细胞粘附在培养基表面上生长。
原代培养中所得细胞经常受到组织来源、细胞类型和培养条件等因素的影响，因此可能表现出较高的细胞异质性。
传代培养传代培养是将进行了原代培养的细胞进行维持和扩增的过程。
在细胞生长到足够数量时，将细胞分散到更大容量的培养器中，以继续扩增细胞数量。
传代培养次数过多时可能导致细胞老化并失去功能。
在细胞传代培养过程中，注意以下几点：•选择合适的培养基和培养条件；•周期性检测细胞的形态、生长状态和细胞数目；•保持细胞复合度和细胞同型性。
冻存为了保存细胞株，通常会将细胞用特殊培养基和添加剂冻存。
冻存过程中，细胞首先保护在保护剂中，然后在液氮的温度下迅速冷冻，以避免细胞深受冰晶形成的伤害。
冻存后的细胞可保存数年，并可进行后续的实验研究。
## 复苏冻存后，需要将细胞复苏。
推荐以下步骤：•用生长培养基预热，将细胞移植到生长培养基中，尽量使样品在细胞数目、时间和温度上保持一致；•在细胞培养箱中培养，控制CO2浓度（通常为5％）和口袋气体混合在空气中的湿度；•更换完整的生长培养基，加入所需的辅助剂，如血清或其它所需的生长因子。
如上所述，细胞培养是生物学和医学研究中不可或缺的基础工具。
正确地进行细胞培养和细胞处理很重要，因为不同的操作条件将影响最终培养出的细胞的数量和质量。
在实验中进行细胞培养和处理时，应该遵守正式的安全和操作规程。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
原代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒原代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH 要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
原代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。
细胞培养-原代培养-传代培养
鼠胎组织细胞原代培养
换液：
全量换液和半量换液
换液时机的选择：
培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多， pH值下降，营养液酸化变黄，。 细胞状态
细胞换液
细胞传代
细胞传代方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1.悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
红色表示中性pH 黄色代表酸性pH 紫色表示碱性pH
在一些特殊培养液中不含酚红
酚红
水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml
01
细胞原代培养
02
细胞换液与传代
03
细胞冻存与复苏
三、细胞培养基本技术
取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污
01
碳酸氢钠 2.0 g
02
03
加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。
04
调节pH值至7.2
细胞培养技术的实验原理是
细胞培养技术的实验原理是
细胞培养技术的实验原理是通过提供适宜的培养基、温度、湿度和气氛等条件，将细胞从体内或体外分离出来，然后在无菌环境下培养和繁殖。
细胞培养可以分为原代培养和细胞系培养两种。
原代培养是从体内获取原发细胞，并将其传代培养。
首先，需要从组织或器官中获得细胞，通常通过消化和分散组织，使用酶来降解细胞间的黏连物质，并加入一种细胞培养基，提供细胞所需的氨基酸、维生素、糖类、盐类等营养物质。
培养基中的血清可以提供生长因子、激素等促进细胞生长的成分。
随着时间的推移，细胞会逐渐分裂和繁殖，形成细胞群体。
细胞系培养是从原代细胞中筛选出生长良好的细胞，然后进行传代培养。
传代培养时，细胞需要周期性地移至新的培养器皿中，并提供新的培养基。
细胞系培养的培养基中通常会去除血清，换成类似血清的添加物，例如人血清蛋白或胎牛血清蛋白，以减少细胞培养中传递的疾病风险。
细胞培养的实验原理是为了研究细胞的生物学特性、生长过程、分化、代谢、免疫特征等。
通过细胞培养，可以更好地理解细胞的功能和基本机制，以及开发新的药物和治疗方法。
此外，细胞培养也可用作细胞工程和组织工程的基础，用于器官和组织的再生和修复。
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法1. 引言嘿，大家好！今天咱们聊聊动物细胞的培养，听起来可能有点高大上，但其实就像种花一样，只是“花”是细胞，养护的方法也有讲究。
说白了，细胞也有自己的“家”，咱们得给它们创造个舒适的环境，让它们在里面嗨起来！接下来，我就带你走进这个充满神奇和乐趣的细胞世界。
2. 原代培养2.1 什么是原代培养？原代培养，简单来说，就是从活体动物身上直接提取细胞，然后把它们放在培养皿里，就像把新鲜的花插进水里一样。
你知道吗，这些细胞就像刚从大自然里来的小家伙，特别活泼，适应能力强。
不过，这可不是随便就能搞定的，得有点技术活。
2.2 原代培养的方法首先，咱得准备好一切工具，这可是基础中的基础，不能马虎。
咱们要用到无菌技术，确保培养环境干净得像新洗的碗，不然细胞们就会遭殃。
提取细胞时，通常会用胰酶把它们从组织中“松开”，就像剥开一个大榴莲，里边的果肉才好吃嘛。
然后，把这些细胞放到培养基里。
培养基就像细胞的“快餐”，里面有细胞需要的各种营养物质和生长因子。
要记得，细胞也要“吃好”，才能长得壮壮的，不然就不成气候了。
培养的环境也不能小看，温度、pH值、二氧化碳浓度都得保持稳定。
咱们得把细胞放在适合的温度下，就像给它们开个温暖的“家庭聚会”。
如果环境不合适，细胞就会抗议，甚至罢工！3. 传代培养3.1 什么是传代培养？说到传代培养，那就是把原代培养中的细胞继续繁殖，让它们“生儿育女”。
这就像一个大家庭，越来越壮大，热闹得不得了。
传代培养可以让我们获得更多细胞，方便后续的实验和研究。
3.2 传代培养的方法传代培养的关键在于及时分离细胞，咱不能让细胞们挤在一起，这样容易“打架”。
通常，当细胞长满培养皿后，就需要把它们分离开。
这个过程又得用到胰酶，跟原代培养一样，轻轻松松把它们从皿里“请”出来。
接下来，咱们需要把细胞分到新的培养皿里，再给它们加上新鲜的培养基，确保它们能继续健康成长。
注意，细胞们需要一点时间适应新环境，就像搬家后要习惯新居的味道一样。
细胞的原代培养与传代培养
细胞的原代培养与传代培养原代培养通过组织块直接长出单层细胞或用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。
原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。
特别是在细胞培养会合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。
在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。
在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，采用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化等，效果很好。
但应注意，原代培养组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。
即使全为同一类型的细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有异质性，在分析细胞生物学特性时比较困难。
其次，由于供体的个体差异及其他一些原因，细胞群生长效果有时也不一致。
原代培养也是建立各种细胞系（株）必经的阶段。
假如原代培养能够维持几小时甚至更长，即可进行进一步筛选。
有的细胞具有继续增殖能力，有的细胞类型只是存活而不增殖，而另外一些细胞只是在特殊条件下应用而不存活，因而细胞类型的分布将会改变。
在单层培养的情况下，瓶底全部铺满细胞，达到会合以后，对密度有依赖性的细胞则逐渐减少生长，而失去密度依赖敏感性的细胞则生长增加，天然或自发转化的细胞则过度生长。
借助于频繁传代，保持细胞低密度生长，有利于保存细胞的正常表型（如小鼠成纤维细胞）。
而自发转化则倾向于高细胞密度的过度生长。
细胞密度过大，培养基消耗将尽，细胞代谢产物积聚过度，细胞增殖变慢，应进行传代培养。
传代培养原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。
原代培养在首次传代时即为细胞系，能连续培养下去的为连续细胞系；不能连续培养的为有限细胞系。
通常，传代培养是指扩大培养，也就是将一份细胞一分为二或者一分为三进行培养等。
但严格说来，不论稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。
细胞培养的方法及注意事项
细胞培养的方法与注意事项细胞培养是将动物某一器官、组织如肝脏、肺、肾脏等取出，将其分散成单个细胞，在人工条件下，使之存活、生长和增殖的技术。
细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养：第一次培养，将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物，不更换培养物的生长器皿的培养过程。
传代培养：在培养过程中培养物分裂生长，长满培养空间，细胞之间相互接触而发生接触抑制，生长速度减慢甚至停止。
在这种情况下，需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿中，再进行培养一、原代培养的方法：1、取材对于水产动物，取材的方法为：无脊椎动物取材用消毒海水或淡水暂养24小时；用酒精棉消毒体表；解剖需培养的组织和器官，放到消毒液中处理一段时间；取出，用灭菌BSS清洗3次鱼的取材用酒精棉消毒体表；打开腹腔（注意不能碰破肠道）；体表组织，处理方法同无脊椎动物。
原代培养过程技术路线图：①准备工作：实验台面用紫外灯照、70%酒精棉球擦；所用各种器械、培养液无菌；操作者用新洁尔灭和酒精擦手，穿衣、戴帽、口罩；实验动物体表用酒精消毒或放入无菌海水中。
②取材：在无菌条件下取出需要培养的器官或组织；如果是有菌的器官或组织需进行灭菌处理；取材要准确③培养材料的制备：欲培养的器官或组织洗去血污，剔掉多余成分。
剪成1mm3大小，用于外置块培养。
用胰蛋白酶消化，终止消化后，机械法吹打组织块，筛网过滤，过滤液离心1000rpm,10min，用培养液悬浮细胞，计数细胞密度，用于细胞培养。
④接种：外植块：用吸管将小的组织块均等地在培养瓶底排列好；反过培养瓶加入培养基，或5-6h后再加培养基；放入CO2培养箱培养；2-3d更换培养液或颜色变黄时更换；记录、每2-3d观察。
结果：1-3d，细胞从外植块中迁移出来分离细胞：将已分散的细胞悬液加到培养瓶或培养板中，并加少量培养液,细胞浓度为105-106个/ml。
不能少于5000个。
24h后加足培养液（防漂浮）。
细胞培养---原代培养---传代培养
一． 细胞培养基本概念 二． 细胞培养基本要求 三． 细胞培养基本技术
细胞培养定义
定义：
模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其 生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程 等问题的研究。
优点：
1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性； 2．可控制： 各种物理、化学、生物等因素可调控； 3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、
自动双重纯水蒸馏器
纯水仪
酶标仪
微孔板震荡器
培养器皿
Culture flask
Culture Plate
常用玻璃器皿清洗
浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干
清洁液的配制
细胞培养基
干粉培养基和液体培养基
干粉培养基需使用者自己配制并灭 菌，其优点是价格便宜。缺点是配 制过程繁琐，质量不易控制
对数生长期：
细胞数随间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性
二、细胞培养基本要求
常用仪器设备 培养器皿 培养基 血清 其他细胞培养试剂
培养细胞生长的条件
1 细胞的营养需要
原代培养与细胞系
原代培养
（primary culture） 从动物机体取出的进 行培养的细胞群。生 长缓慢，繁殖一定的 代数后（一般10代以 内）停止生长。
细胞株
（cell strain） 从原代培养细 胞群中筛选出 的具有特定性 质或标志的细 胞群，能够繁 殖50代左右， 在培养过程中 其特征始终保 持。
基础细胞实验报告
实验名称：细胞原代培养与传代培养实验日期：2023年4月10日实验目的：1. 熟悉哺乳动物细胞原代培养和传代培养的基本操作流程。
2. 掌握细胞培养技术的基本原理和注意事项。
3. 了解细胞生长和增殖的基本规律。
实验原理：细胞培养技术是一种在人工条件下模拟细胞生长环境的实验方法。
通过细胞培养，我们可以直接观察活细胞，研究细胞的生长、分化、代谢和功能等生物学特性。
细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养是指直接从生物体中取出组织或细胞进行培养，而传代培养则是指将原代培养的细胞增殖到一定密度后，将其分散到新的培养容器中进行培养。
实验材料：1. 哺乳动物组织（如小鼠胚胎成纤维细胞）2. DMEM培养基3. 胎牛血清4. 0.25%胰蛋白酶5. 75%酒精6. 灭菌棉签7. 培养皿8. 培养箱9. 显微镜实验步骤：一、原代培养：1. 取出组织，用无菌手术剪将其剪成小块。
2. 将组织块放入含有胎牛血清的DMEM培养基中，用无菌手术剪轻轻搅拌，使组织块分散成细胞。
3. 将分散好的细胞悬液用无菌吸管转移至培养皿中。
4. 将培养皿放入培养箱中，在37℃、5%CO2条件下培养。
二、传代培养：1. 当原代培养的细胞长满培养皿时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞。
2. 将消化好的细胞悬液用无菌吸管转移至新的培养皿中。
3. 将培养皿放入培养箱中，在37℃、5%CO2条件下培养。
三、观察与记录：1. 使用显微镜观察细胞的生长情况，记录细胞的形态、数量和生长速度。
2. 每天观察并记录细胞生长情况，直至实验结束。
实验结果：1. 原代培养过程中，细胞从组织块中分离出来，逐渐增殖，形成单层细胞。
2. 传代培养过程中，细胞继续增殖，细胞数量逐渐增加。
3. 细胞在培养过程中呈现典型的成纤维细胞形态，细胞核呈椭圆形，细胞质丰富。
实验结论：1. 成功进行了哺乳动物细胞的原代培养和传代培养。
2. 掌握了细胞培养技术的基本原理和操作流程。
3. 了解细胞生长和增殖的基本规律。
原代细胞培养和传代培养的方法
原代细胞培养和传代培养的方法原代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏1实验原理细胞培养可分为原代培养和传代培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
2实验方法一：材料小鼠，生理盐水，100ml灭菌烧杯，15ml离心管，培养皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网，泡沫板，大头针，酒精灯，培养瓶，培养液，PBS，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜，显微镜，计数板，离心机，恒温水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮罐，冻存管，冻存液，废液缸等。
二：方法（1）原代培养：1.取出小鼠后沥干酒精，放入超净台内，固定在泡沫板上。
2.用镊子提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤一个横切口，将皮肤向上撕开，然后剪开肌肉等，暴露出腹腔，在左侧找到脾脏，用弯头眼科镊取出脾脏，置于无菌培养皿中。
3.用生理盐水将取出的脾脏清洗多次，并剔除多余无用的组织。
4.将筛网置于平皿中，脾脏置于筛网上，用弯头镊镊住，轻轻在筛网上进行碾磨，同时不停滴加不含血清的培养液冲洗。
5.将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中，离心(1000rpm,5min)，吸去上清（去除血液等）。
6.加入10ml培养液，吹打混匀，取样计数。
7.将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，轻轻摇晃混匀，在培养瓶上。
面做好标志，注明细胞、组别及日期。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项1.组织获得:收集组织样本，并用无菌技术分离细胞。
组织样本可以通过活体组织采样、细胞培养物或冻存细胞获得。
2.细胞分离:使用酶或机械方法，将组织分解为单个细胞。
酶消化可以使用胰蛋白酶、胶原酶等，机械方法可以使用刮刀或组织切割器。
3.细胞培养:将细胞转移到含有适当营养物质和细胞因子的培养基中。
常用的培养基包括DMEM、RPMI-1640、MEM等。
4.培养条件:细胞应保持在适当的培养条件下，包括温度、湿度、CO2和O2浓度以及pH值等。
传代培养的方法：1.剥离细胞:轻轻地将细胞从培养底物上剥离。
可以使用胰蛋白酶或EDTA来辅助细胞剥离。
2.细胞计数:使用显微镜和细胞计数板，计算细胞的数量。
3.细胞传代:将细胞转移到新的培养底物中。
选择适当的培养底物和培养条件，以确保细胞的正常生长和增殖。
4.细胞恢复:细胞传代后，需要一段时间来恢复和适应新的培养条件。
在这段时间内，细胞可能会出现一定程度的生长停滞或损伤。
注意事项：1.无菌操作:在进行细胞培养时，必须保持严格的无菌操作，以防止细胞污染和细菌、真菌、病毒等微生物的污染。
2.培养基配方:不同类型的细胞对培养基中的成分和细胞因子的需求有所不同，因此必须使用适当的培养基。
3.培养条件控制:细胞对培养条件非常敏感，包括温度、CO2浓度、湿度等。
必须确保这些条件处于合适的范围内。
4.细胞密度控制:细胞密度对细胞生长和增殖有重要影响。
过高的细胞密度可能导致细胞死亡，而过低的细胞密度可能导致细胞转分化。
5.传代次数限制:细胞在传代培养中会出现累积的突变和基因改变，因此应限制传代的次数，以确保细胞的稳定性和一致性。
6.细胞检测和验证:在进行细胞传代培养之前和之后，应对细胞进行检测和验证，以确保细胞的纯度和正常生长。
细胞培养是一项复杂的技术，需要细致的操作和严格的条件控制，以确保细胞的正常生长和稳定性。
遵循适当的方法和注意事项，将有助于提高细胞培养的成功率和可靠性。
原代培养和传代培养名词解释
原代培养和传代培养名词解释咱今儿个就来讲讲原代培养和传代培养这俩词儿。
你说这原代培养啊，就好像是盖房子打地基。
咱从生物体里把那些个细胞啊，组织啊，小心翼翼地取出来，就跟宝贝似的，给它们找个合适的地儿安置下来，让它们能好好地生长发育。
这就好比是给小树苗找了块肥沃的土地，让它能扎根发芽。
这原代培养可不简单呐，得精心呵护着，给它们提供适宜的环境，温度啦、营养啦，一个都不能少，就盼着它们能茁壮成长呢！你想想，要是没弄好，那不就白费功夫啦！再来说说这传代培养，它就像是小树苗长大了，要分枝散叶啦！原代培养出来的细胞长到一定程度，咱就得给它们来个分家，把它们分到新的培养器皿里去，让它们继续繁衍后代。
这就好像家里孩子多了，得给他们分房间住一样，不然挤在一起可不行。
这传代培养也有讲究呢，得把握好时机，不能太早也不能太晚。
太早了，它们还没准备好；太晚了，又怕它们长得太挤了不舒服。
你说这细胞培养是不是挺有意思的？就跟养孩子似的，得时刻操心着。
有时候还真得有点耐心和细心，不然一不小心就前功尽弃啦！咱做实验的不就盼着能培养出好的细胞来，得出好的数据嘛。
原代培养和传代培养，它们可是细胞培养里的重要环节啊！少了谁都不行。
没有原代培养，哪来的细胞可以传代呢？没有传代培养，细胞怎么能大量繁殖呢？这就好比是做饭，原代培养是准备食材，传代培养就是烹饪的过程，只有两者都做好了，才能做出美味的佳肴来。
咱再想想，如果没有这两项技术，那好多医学研究、药物研发可怎么办呢？那岂不是像没了翅膀的鸟儿，想飞也飞不起来啦！所以说啊，原代培养和传代培养可真是太重要啦！它们为科学研究提供了坚实的基础，让我们能更深入地了解细胞的奥秘，为人类的健康事业做出贡献呢！总之，原代培养和传代培养是细胞培养中不可或缺的两个部分，它们相互配合，共同推动着科学的进步。
咱可得好好重视它们，让它们发挥出最大的作用呀！。
原代培养和传代培养的理解
一、原代培养和传代培养1、原代培养定义：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、化学试剂或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
注意：人体是复杂的，一般从器官取出的组织都是很多类型细胞混合组成的（规范的说是多克隆，定义见下一条），也就是有很多种类型的细胞，基本上是不可能提取出来一种类型的细胞（单克隆）的，那个概率太小了。
TIPS：克隆在细胞培养中的定义：是原代培养开始时，揪出来的那一坨组织中的细胞类型数，有一种类型就是单克隆，两种类型就是两个克隆，很多类型就是多克隆（比如你肌肉组织，里面不但有肌肉细胞还有神经细胞，于是就是双克隆）2、传代培养定义：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
记住：神经细胞等终末分化细胞是没有传代培养的，因为它们无法复制注意：十代之前为原代，十代之后为传代的说法是完全可以的，但这是一个经验规律（一般细胞培养十代长满培养基），不具有普适性，但做题的时候用的基本上都是这个，不要杠精，特殊说明除外。
TIPS:癌细胞是一种特殊的细胞，它不具有贴壁生长特性，还不具有接触抑制作用，所以临床上常说癌细胞具有扩散性细胞系：直译就是细胞的集合，实际意义是进行传代培养后（这是前提！！！），对原代培养所使用的那一坨组织的称呼。
二、分离：酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶1、胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水解作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开。
为什么不用胃蛋白酶？因为胃蛋白酶最适PH值2.0左右，而且胃蛋白酶很生猛，消化完不但细胞之间连接没了，细胞也没了。
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细胞原代培养和传代
二、细胞培养基本要求
❖ 常用仪器设备 ❖ 培养器皿 ❖ 培养基 ❖ 血清 ❖ 其他细胞培养试剂
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培养细胞生长的条件
❖ 1 细胞的营养需要
❖ 2 细胞的生存环境
❖ 温度: 37 ℃
❖ O2
❖ CO2: 5%
CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3-
于各种造血系统肿瘤细胞
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每代贴附生长细胞的生长过程
❖ 游离期 ❖ 贴壁期 ❖ 潜伏期 ❖ 对数生长期 ❖ 停止期（平台期）
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❖ 游离期： ❖ 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此
时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
❖ 10分钟一4小时
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❖ 贴壁期：
❖ 培养皿和培养板等表面消毒
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超净台
超净工作台的工作 ❖ 原理是利用鼓风机
驱动空气遁过高效 滤器除去空气中的 尘埃颗粒，使空气 得到净化。净化空 气徐徐通过工作台 面，使工作台内构 成无菌环境。
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滤器
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CO2培养箱
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细胞系资源
• The American Type Culture Collection (ATCC) • The European Collection of Animal Cell Culture (ECACC) • National Institute of Health (NIH), USA • National Cancer Institute (NCI), USA
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原代培养与细胞系
原代培养
（primary culture） 从动物机体取出的进 行培养的细胞群。生 长缓慢，繁殖一定的 代数后（一般10代以 内）停止生长。
细胞株
细胞系
（cell strain） 从原代培养细 胞群中筛选出 的具有特定性 质或标志的细 胞群，能够繁 殖50代左右， 在培养过程中 其特征始终保 持。
❖ 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时 贴壁。
❖ 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等
❖ 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白 （生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底 物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。
❖ 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）
（cell line） 从肿瘤组织 培养建立的 细胞群或培 养过程中发 生突变或转 化的细胞， 在培养条件 下可无限繁 殖
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克隆
（clone）亦称无 性繁殖系或无性 系。对细胞来说， 克隆是指由同一 个祖先细胞通过 有丝分裂产生的 遗传性状一致的
细胞群。
原代培养细胞的生命归宿
❖ 原代培养期 ❖ 传代期 ❖ 衰退期
细胞原代培养和传代
❖ 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广
❖ 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃
❖ 器皿消毒
❖ 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、
❖ 酶液等均采用滤过法除菌
❖ 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境
❖ 外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料
细胞传代次数（Passage Number）
• 体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一 定的界限，称为“ Hayflick极限”。
• 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次； 龟寿命200年，传代140次。
• 传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼 年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。
目录
一． 细胞培养基本概念 二． 细胞培养基本要求 三． 细胞培养基本技术
细胞原代培养和传代
细胞培养定义
定义：
模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其 生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程 等问题的研究。
优点：
1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性； 2．可控制： 各种物理、化学、生物等因素可调控； 3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、
细胞原代培养和传代
细胞原代培养和传代
细胞原代培养和传代
❖ 潜伏期
❖ 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期 一般为6～24小时。
细胞原代培养和传代
❖ 对数生长期：
❖ 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
细胞原代培养和传代
❖ 停止期（平台期）：
❖ 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 ❖ 机制：接触抑制、密度依赖性
❖ pH: 7.2-7.4
❖ 渗透压
❖ 3 无污染
❖ 4 无毒
细胞原代培养和传代
常用仪器设备
❖ 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 ❖ CO2培养箱 ❖ 倒置显微镜 ❖ 酶标仪、微孔板震荡器 ❖ 液氮罐 ❖ 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 ❖ 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管
细胞原代培养和传代
❖ 有限细胞系，无限细胞系 ❖ 细胞系 cell line ❖ 细胞株 cell strain
细胞原代培养和传代
培养细胞的特性
❖ 培养细胞的生长方式
❖ 贴附生长： ❖ 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 ❖ 悬浮生长： ❖ 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见
免疫组织化学、原位杂交、同位素标记； 4．应用广： 不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）；
缺点：
➢ 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同； ➢ 当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，
必然发生变化。
细胞原代培养和传代
细胞培养的基本概念
❖ 传代： ❖ 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到
新的培养器皿中。 ❖ 原代培养 ❖ 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在
传代之前称为原代培养。
❖
细胞原代培养和传代
接触抑制（Contact inhibition）
❖ 细胞相互接触时，将停 止增长；
❖ 细胞停留在细胞周期的 G0期；
❖ 转化的细胞却可以继续 生长导致细胞重叠堆积 生长。
细胞原代培养和传代