线粒体的活体染色
实验二 线粒体和液泡系的活体染色
实验目的：
1. 观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系 的形态、数量与分布； 2. 学习一些细胞器的超活染色技术。
实验原理
活体染色：是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但 对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是 显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和 产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。 应用：活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结 构和生理、病理状态。 分类：根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把 活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。体内活 体染色是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的 胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别 的目的。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植 物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被 选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
2、洋葱内表皮细胞线粒体的超活染色
用吸管吸取 1/5000 詹纳斯绿 B 染液，滴一滴在 干净的载玻片上，然后撕取洋葱鳞茎内表皮 1 小块，置于染液中，染色15-20min。 吸去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮展 平，盖上盖玻片，显微镜观察。 先用低倍镜进行观察，找到细胞后，即可转入 高倍镜继续观察，此时，要注意细胞核位于细 胞的近中部的一侧。在它的周围有致密的原生 质体，在原生质中有被染成蓝绿色的小颗粒。 此即线粒体。
3、蛙胸骨剑突软骨细胞的液泡系活体染色 解剖蛙，剪取胸骨剑突软骨最薄部分一小块， 放入载玻片中央的1/3000中性红染液中，染色 5～10min。然后用吸管吸去染液，滴加1－2 滴Ringer液，盖上盖玻片，用油镜观察。 可见软骨细胞为椭圆形，细胞核及核仁清楚， 在细胞核上方的胞质中，有许多被染成玫瑰红 色的大小液泡，这一特定的区域叫做高尔基区。
实验二液泡系和线粒体的活体染色法
实验二液泡系和线粒体的活体染色法实验二液泡系和线粒体的活体染色法一、液泡系的活体染色液泡系（vacouome）是细胞内一种重要的细胞器，它普遍存在于动植物细胞。
动物细胞液泡系是法国学者M．Parat继Dangeard发现植物细胞液泡系之后于1924年第一次发现的。
在一切动物细胞内皆有。
通常为圆形泡状，数目多少不定。
除少数例外，腺细胞和幼年的细胞，通常有极性，皆集中在核的顶部上方，位于细胞的中央部分。
液泡系和线粒体（mitochondria）组成一个特殊的区域名高尔基区。
液泡是细胞内浓缩产品的重要场所，有十分重要的生理功能。
动物细胞内的液泡因为很小，如果不经过活体染色，就很难显示出来。
在有些细胞（如胰脏细胞）可用相差显微镜观察到液泡系。
根据中性红活体染色的结果，可知液泡系分为大、中、小三种类型的液泡。
小液泡被中性红染成均匀一致的深红色，即为“含浆液泡”（Vacuoles Plasmoccrines）。
经中性红染色后呈橙红色，有的边缘呈深红色新月形或环形，这是中等的“含分泌粒液泡”（Vacuoles rhagiocrines）。
含成熟分泌颗粒的大液泡因已全部蛋白质化，所以不再被中性红染色，只有液泡的残余部分（新月形或环形）被染成红色。
中性红是液泡系特殊的活体染色剂，只将液泡染成红色，在细胞处于生活状态时，细胞质及核绝对不被染色。
如果细胞死亡，细胞质及核才被中性红染成弥散的红色。
此时，液泡染色消失，液泡开始毁坏。
为了保证观察材料处于生活状态，要求一定的细胞环境条件——适宜的温度、渗透压、PH值、营养成分等。
因此观察时室温不要过高或过低，显微镜灯要有必要的滤热装置。
细胞材料要浸泡在生理盐水中。
长期观察还要注意防止因生理盐水蒸发而改变渗透压，并供给所需的养分等。
（一）仪器设备和材料1．复式显微镜（ X10、 X40及油镜头），擦镜纸2．解剖器，载玻片，盖玻片，吸管，吸水纸。
3．实验材料（1）黄豆幼苗根尖（绿豆或水稻也可），把黄豆培育在培养皿中潮湿的滤纸上，使其发芽，直到胚根伸长到一厘米以上。
细胞化学法在线粒体活体染色中的应用
细胞化学法在线粒体活体染色中的应用细胞化学法在线粒体活体染色是研究细胞内结构和功能的重要手段之一。
其利用各种荧光探针，通过特定的染色技术，在不破坏活体细胞的前提下，对细胞中的结构和分子进行直接标记和显微观察，从而实现对细胞内各种生物过程的研究。
下面，我们将从准备、处理、染色、观察等方面详细介绍细胞化学法在线粒体活体染色的应用。
一、准备实验材料及试剂首先，需要准备实验用的细胞培养物。
在细胞培养过程中，需要注意细胞的生长状态，保证细胞摆脱静止状态，并保证细胞状态的均匀性和健康状态。
同时，还需要准备各种荧光染料、生理盐水、PBS、缓冲液、透明质酸、含有氧气的培养液等。
这些试剂可以在实验室的商店或生化试剂商店购买得到。
二、处理细胞接着，需要对细胞进行处理。
在细胞化学法在线粒体活体染色中，需要将细胞固定在未硬化的胶中。
一种较为常见的方法是采用透明质酸凝胶。
在处理细胞前，需要先将透明质酸浸泡在PBS中，使其达到理想的浓度。
细胞在贴壁培养皿中生长至60％ - 80％并提前准备PBS和缓冲液，抽取透明质酸，加1/10体积的PBS调成一定的浓度。
将透明质酸糖液滴加到细胞培养物上，并等待其自然流动，直至完全凝固。
这样可以使细胞在固定的胶中扩散，并将其限制在一个区域内。
在细胞凝固后，可以使用小量脱液纸吸去液体，以避免过多的液体干扰观察。
三、进行荧光染色在处理好细胞后，需要进行荧光染色。
通常使用的荧光探针是MitoTrack Green，可以捕捉到在线粒体内的活动和功能变化，可以被在线粒体内的蛋白质吸附。
在进行染色前，需要先洗涤细胞，去除细胞表面的杂质。
然后，使用荧光探针进行染色。
在进行染色的过程中，应严格按照试剂的使用说明进行，避免对细胞的损伤。
四、观察细胞最后，通过显微镜观察细胞并记录图像。
通过观察细胞的形态和内部结构，可以了解在线粒体的分布和形态，以及在线粒体的数量和形态变化等信息。
需要注意的是，在进行观察时，应避免过度的光照和过度的荧光染色，以避免对细胞的损伤和影响。
高中生物 线粒体(Mitochondrion)的活体染色及电镜照片观察 【实验目的】 掌握一 ...
线粒体(Mitochondrion)的活体染色及电镜照片观察【实验目的】掌握一种活体染色方法,了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体基本形态结构。
【实验用品】一、材料和标本兔子一只、线粒体的电镜照片。
二、器材和仪器显微镜、手术器材一套、解剖盘、小平皿、载片、盖片、吸水纸、10ml 注射器、吸管。
三、试剂 l／300詹纳斯绿B染液、Ringer氏液(哺乳类用)。
【实验内容】一、兔肝细胞线粒体的活体染色（一）原理线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。
细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。
活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。
詹纳斯绿 B是线垃体的专一性活体染色剂。
线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。
（二）方法用空气栓塞处死兔子，置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（2～3mm3），放入盛有Ringer氏液的平皿内洗去血液(用镊子轻压)，用吸管吸去Ringer氏液，在平皿内加1／300詹纳斯绿B染液，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。
当组织块边缘染成篮色时即可，一般需要染30分钟。
染色后，将组织块移到载片上，用镊子将组织块拉碎，就会有一些细胞或细胞群从组织块脱离。
将稍大的组织块去掉，使游离的细胞或细胞群留在载片上，加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余水分。
(三)结果显微镜观察，肝细胞质中许多线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状。
二、线粒体的光镜切片观察用詹纳斯绿B染色的兔肝细胞光镜切片，肝细胞中的线粒体呈蓝绿色的颗粒。
三．线粒体的电镜照片观察不同细胞中线粒体的形态和数目不同。
线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。
线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。
实验四线粒体和液泡系的超活染色与观察
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无 毒害的一种染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些 结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何理化变化以 致引起细胞死亡。
要想获得体外活体染色成功，我们应注意： （1）保证所取材料的活性。通过控制温度和加入缓冲
液实现。
（2）保证染色剂的状态。可以通过现用现配和棕色试 剂瓶保存来保证染色剂的化学性质不发生变化；用浓度 较低的染色剂来保证对细胞无毒或伤害较小。
⑵ 用双面刀片把小麦幼苗根尖（约1～2cm长）小心切一 纵切面，放入载玻片上的1/3000中性红染液滴中，染色 5～10min。
⑶ 吸去染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，并用镊子 轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察。
⑷ 在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见 细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡 ，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察 ，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积 增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红 色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分空间，将细胞核挤 到细胞一侧贴近细胞壁处。
（三）材料
人口腔上皮细胞 小麦根尖细胞
四、实验步骤
（一）线粒体的超活染色与观察 1、线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和
数量虽不同物种、不同组织器官和不同的生理 状态而发生变化。 1）人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察 ⑴取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板 上，滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液。
小麦根尖液泡系（1）
小麦根尖液泡系（2）
六．实验中的注意事项
1、詹姆斯绿B溶液现用现配，以保持它的充 分氧 化能力。
2、实验中速度要快，以免组织细胞死亡。
实验二 线粒体超活染色技术及观察
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【实验用品】 实验用品】 材料： 材料： 人口腔上皮细胞、 人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞 器材： 器材： 显微镜、恒温水浴锅、刀片、镊子、载玻片、盖玻片、 显微镜、恒温水浴锅、刀片、镊子、载玻片、盖玻片、牙 吸水纸、 签、吸水纸、洋葱 试剂： ２、试剂： （1）Ringer溶液 ） 溶液 0.85 g 氯化钠 氯化钾 0.25 g 0.03 g 氯化钙 詹纳斯绿Ｂ （2）1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液： ） 詹纳斯绿 溶液： 称取0.5g詹纳斯绿Ｂ溶于 詹纳斯绿Ｂ 溶液中， 称取 詹纳斯绿 溶于5ml Ringer溶液中，稍加热 溶液中 稍加热(3040℃)溶解，用滤纸过滤后，即为 原液。 溶解， 原液。 ℃ 溶解 用滤纸过滤后，即为1%原液 原液加入49mlRinger溶液，即得 溶液， 工作液， 取1ml1%原液加入 原液加入 溶液 即得1/5000工作液， 工作液 将其装入棕色瓶中备用。最好现配现用， 将其装入棕色瓶中备用。最好现配现用，以保持充分的氧 化能力。 化能力。
Байду номын сангаас
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【实验方法】 实验方法】 １、人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察 （1）取载玻片于 ℃恒温水浴： ）取载玻片于37℃恒温水浴： 詹纳斯绿Ｂ （2）1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液 2滴 ） 詹纳斯绿 滴 （3）人口腔上皮细胞黏液 ） 牙签刮取 （4）染色 ～15min，盖上盖玻片，吸去周围染液， ）染色10～ ，盖上盖玻片，吸去周围染液， 显微镜下观察。 显微镜下观察。 个细胞中线粒体数目， （5）计数 个细胞中线粒体数目，得出平均值。 ）计数50个细胞中线粒体数目 得出平均值。 ２、洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色与观察 （1）取载玻片于 ℃恒温水浴： ）取载玻片于37℃恒温水浴： （2）1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液 2滴 ） 詹纳斯绿Ｂ 滴 詹纳斯绿 （3）洋葱鳞茎内表皮 ） 镊子撕取 溶液１ （4）染色 ～15min，吸去染液，加Ringer溶液１ ）染色10～ ，吸去染液， 溶液 盖上盖玻片，显微镜下观察． 滴，盖上盖玻片，显微镜下观察． 个细胞中线粒体数目， （5）计数 个细胞中线粒体数目，得出平均值 ）计数50个细胞中线粒体数目 得出平均值。
实验二 线粒体超活染色技术及观察
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【实验方法】 １、人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察 （1）取载玻片于37℃恒温水浴： （2）1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液 2滴 （3）人口腔上皮细胞黏液 牙签刮取 （4）染色10～15min，盖上盖玻片，吸去周围染液， 显微镜下观察。 （5）计数50个细胞中线粒体数目，得出平均值。 ２、洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色与观察 （1）取载玻片于37℃恒温水浴： （2）1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液 2滴 （3）洋葱鳞茎内表皮 镊子撕取 （4）染色10～15min，吸去染液，加Ringer溶液１ 滴，盖上盖玻片，显微镜下观察． （5）计数50个细胞中线粒体数目，得出平均值。
• 根据所用染色剂的性质和染色方法的不同, 活体染 色可分为体内活染与体外活染两类.体内活染是以 胶体状的染料溶液注入动植物体内,染料的胶粒固 定于细胞内某些特殊结构内以达到易于识别的目的 . 体外活染又称超活染色，是由活的动植物分离出部 分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料因其 “电化学”特性与被染部分相互吸引被选择固定在 活细胞的某种结构中而显色。 • 但不是任何染料都可作为活体染色剂使用,一般应 选择那些无毒或毒性小的碱性染料(易溶于类脂质) 并配成较稀的溶液来使用.詹纳斯绿Ｂ是活体染色 中重要的染料，对线粒体有专一性．詹纳斯绿Ｂ可 专一性地对对线粒体进行活染，这是由于线粒体内 的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化 状态(即有色状态),呈蓝绿色;而线粒体周围的细胞 质中,这些染料被还原为无色的色基。
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【注意事项】 1、显微镜的使用 2、掌握好詹纳斯绿Ｂ染色时间 3、实验结束后，注意清理实验用具 【作业】 1、绘出人口腔上皮细胞和洋葱鳞茎内表皮 细胞示线粒体的形态与分布 • 2、分析染色时间对结果影响。
线粒体超活染色
兔子解剖流程
七、思考题 绘制兔子肝细胞或洋葱鳞茎表皮细胞的线粒体形态及 分布
六、实验步骤 1、兔子肝细胞线粒体的超活染色观察 （1）用空气注射法处死兔子，置于解剖盘中，迅速打开腹部， 取肝脏边液 （2）、取另一干净的表面皿，滴加1/5000詹纳斯绿B溶液， 再将肝组织块移入染液，但不可将组织块完全浸没，要让组 织上面部分裸露在外面，这样细胞内的线粒体酶系可充分得 到氧化，易被染色，当组织块边缘被染成蓝绿色即可（一般 为20min） （3）、吸去染液，滴加Ringer溶液，用剪刀将组织块着色部 分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后，用吸管吸去分离出的 细胞悬液，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片在低倍镜下选择 不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察
实验五 线粒体超活染色 与显微观察
一、实验目的 掌握动、植物细胞活体染色的原理和相关的技术 二、实验原理 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织着色但又无害 的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内某些结构，而 不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起 细胞的死亡。 詹纳斯绿B（Janus green B）是毒性较小的碱性染料， 可专一地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞 色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状 态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还 原为无色的色基（即无色状态）
2、洋葱鳞茎表皮细胞线粒体超活染色观察 （1）、用吸管吸取1/5000詹纳斯绿B染液，滴一滴于干净 的载玻片上，然后，撕去一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染 液中，染色10min。 （2）、用吸管吸取染液，加一滴Ringer溶液，注意使内表 皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。 （3）、在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所 占据，细胞核被挤至一侧贴细胞壁处。仔细观察细胞质中 线粒体的形态与分布
液泡系和线粒体的活体染色及观察
2）植物细胞线粒体的活体染色与观察（洋葱鳞茎内表皮 细胞）
⑴用吸管吸取1/5000詹纳斯绿B染液，滴一滴在干净的载波片上， 然后用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块，置于染液中，染色10～ 15mห้องสมุดไป่ตู้n。
⑵吸去染液，加一滴Ringer 液，注意使洋葱内表皮展平，盖上盖 片，显微镜观察。
⑶在高倍镜下，可见表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤 至旁边，在其周围有线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状或线条状。 仔细观察细胞质中线粒体的形态、数目和分布。
⑷ 在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大 小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点 向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大， 数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的 绝大部分空间，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。
六．实验中的注意事项
1、詹姆斯绿B溶液现用现配，以保持它的充分氧化能力。 2、实验中速度要快，以免组织细胞死亡。
称取0.5中性红溶于50ml Ringer溶液，稍加热（30~40度）使之很快溶 解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于
暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。
临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29ml
Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。
3．1%、1/5000詹姆斯绿B溶液
称取50mg詹姆斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加
二、实验原理
• 线粒体是细胞内重要的细胞器，线粒体内膜上分布有细胞色素 氧化酶，该酶能使詹姆斯绿B保持在氧化状态，呈现蓝绿色从而 使线粒体显色，而细胞质中的染料被还原成无色。
• 液泡是细胞内浓缩产物的主要场所，有十分重要的功能。中性 红是液泡的特殊染色剂，将液泡染成红色。在活细胞中，细胞 质和细胞核不着色。如果细胞死亡，染料会弥散开来，使核着 色。
线粒体超活染色
滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液
↓ 用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞
↓
刮下的粘液状物放到载玻片的染液滴中 ↓ 染色10~l5min（注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液） ↓ 盖上盖玻片，显微镜下观察
２、洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的
超活染色与观察
载玻片于37℃恒温水浴： 1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液 洋葱鳞茎内表皮
实验六 线粒体和液泡系的超活染色与观察
一、实验目的
１、观察动植物活细胞内线粒体、液泡系 的形态数量与分布； ２、学习一些细胞器的超活染色技术。
二、实验原理
细胞的各项活动所需要的能量，主要通过线粒
体呼吸作用来提供。
活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实
地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生 命活动的一种染色方法。
１滴 镊子撕取
染色10－15min，吸去染液，加Ringer溶液１
滴，盖上盖玻片，显微镜下观察。
染过色但没有染上的细胞
染色的细胞
线粒体
未染色细胞
洋葱鳞茎细胞线粒体
死亡的染色细 胞
3、植物细胞液泡系的超活染色与观察
取豆芽的根尖
↓用刀片纵切根尖
放入中性红染液滴中，染色5~10min
↓
吸去染液，滴一滴Ringer液 ↓ 盖上盖玻片进行镜检（镊子轻轻地下压盖玻片，使 根尖压扁利于观察）
处。
பைடு நூலகம்
作
业
1. 绘口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布，并简要分析
2. 绘示绿豆根尖液泡系的形态与分布
3、什么是活体染色？要想获得体外活体染色成功，我们应 注意哪些问题？
实验一 线粒体的超活染色
实验一线粒体的活体染色与观察一、实验目的1．观察动物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。
2．学习一些细胞器的活体染色技术。
二、实验原理活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。
它的目的是显示活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。
活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。
体内活染是将胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。
体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部位，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。
碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子的，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。
但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。
一般是以碱性染料最为适用，可能因为它们具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。
线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。
詹纳斯绿B（Janus green B）是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。
三、实验仪器、材料和试剂1．仪器：显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、载玻片、。
实验三 线粒体活体染色
线粒体活体染色
活体染色：是使生活有机体的细胞或组织特异性着色， 但对该样本又没有毒害作用的一种染色方法。 目的：既显示活体细胞内的某些结构，又不影响细胞 的生命活动和产生任何物理和化学变化以致细胞的死亡。 应用：活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形 态结构和细胞生理、病理状态
线粒体活体染色
3. 加至5ml低渗液，吹打后将离心管置37℃水浴中低渗 20min。
染色体标本制备
4. 1000r／min离心8min。，弃上清液。 5. 固定：加入新配制的甲醇：冰醋酸(3：1)固定液5ml，
立即用吸管将细胞轻轻吸打均匀，静置固定20min。 （如此反复固定2～3次，每次20min。） 6. 滴片：固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，加入
油镜下小鼠骨髓细胞染色体
油镜下观察
染色体标本观察
线粒体活体染色
线粒体活体染色
线粒体电镜观察
A
C
M
C
N
M
线粒体电镜观察
C C C
N M
MV L
线粒体电镜观察
B M
M
N L
MV
MV
N
L
N
染色体标本制备
实验仪器、用具
天平 离心机 温箱 显微镜 酒精灯
注射器 解剖盘 解剖剪 刀片 离心管 吸管 烧杯 冰冻载玻片
骨髓细胞染色体标本制备
1. 秋水仙素处理动物：按4μg/g体重的剂量经腹腔注 射秋水仙素，3～4h后杀死动物。
2. 取骨髓取出动物后肢的股骨，剪去两端骨骺。 用注射器吸取2ml 0.075M KCl溶液注入骨髓腔，将 骨髓细胞冲入离心管中，用吸管反复吸打骨髓细胞， 使细胞团块分散。
线粒体的活体染色
不同细胞中线粒体的形态和数目不同; 在电子显微镜下 ;线粒体的外形多样;如圆形 椭圆形 哑铃形和杆状; 线粒体 的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关;线粒体多聚集 在细胞生理功能旺盛的区域;
线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的; 一般与线粒 体长轴垂直排列;但也可见到与线粒体长轴平行排列的脊; 脊的横切面呈囊状或管状; 脊的数量与细胞呼吸机能的强 度有很大关系;
2 在干净的平皿中;滴加1/5000詹纳斯绿B溶液;再将肝组织 块移入染液;注意不可将组织块完全淹没;要使组织块上面 部分半露在染液外;这样细胞内的线粒体酶系可充分得到 氧化;易被染色; 当组织块边缘被染成蓝绿色即成一般需染 20～30min;
3 吸去染液;滴加Ringer 溶液;用眼科剪将组织块着色部分 剪碎;使细胞或细胞群散出; 然后;用吸管吸取分离出的细 胞悬液;滴一滴在载玻片上;盖上盖玻片进行观察;
二 线粒体的活体染色与观察
1 人口腔上皮细胞线粒体的超活染色观察 1取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上;滴两滴
1/5000詹纳斯绿B染液;
2实验者用牙签宽头在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮 细胞;将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中;染色 10—15分钟注意不可使染液干燥;必要时可再加滴染液; 盖上盖玻片;用吸水纸吸去四周溢出的染液;置显微镜下 观察;
实验二 线粒体的活体染色
一 实验目的：
1 观察动物活细胞内线粒体的形态 数量与分 布;
2 掌握线粒体的活体染色原理及方法; 3 小鼠肝脏细胞线粒体染色及观察;
二 实验原理：
线粒体是细胞内一种重要细胞器;是细胞进行呼吸作用 的场所; 细胞的各项活动所需要的能量;主要是通过线粒体 呼吸作用来提供的; 活体染色是应用无毒或毒性较小的染 色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命 活动的一种染色方法; 詹纳斯绿 BJanus green B是线粒体 的专一性活体染色剂; 线粒体中细胞色素氧化酶系使染料 保持氧化状态呈蓝绿色;而在周围的细胞质中染料被还原; 成为无色状态;
小鼠肝脏细胞线粒体活体染色
姓名系年级2011级临八组别同组者科目细胞生物学实验题目小鼠肝细胞线粒体染色学号【实验目的】1、掌握细胞器活体荧光标记技术。
2、观察和了解活细胞内线粒体等的形态与分布特点。
【实验原理】对细胞的结构及功能的研究历来是细胞生物学的主要内容。
活体染色是指使生活有机体的细胞或组织着色但对其又无毒害作用的一种染色方法。
它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的的生命活动。
根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染和体外活染两类。
体内活染是将胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，使这些特殊结构易于识别。
体外活染又称超活染色，它是将活的动植物的分离出部分细胞或组织小块，用染料溶液浸染。
染料被选择性的固定在活细胞的某种结构上面显色。
随着细胞生物学的实验研究技术发展，对细胞的研究正经历着从简单到复杂，静态到动态，从单维度到多维度的发展。
其中，细胞器的活体荧光标记技术是现代细胞生物学研究常用的重要试验技术。
这种技术可以从分子水平上动态的研究活细胞中的各种生理活动，极大地增强了人们对细胞的认识能力。
这种技术能够用来分析细胞的信号转导、物质运输、能量代谢和膜电位的变化等。
现在。
已经有许多细胞器的特异的商业化荧光染料。
本节课所需的线粒体特异活体染色剂是詹纳斯绿B（Janus green B）。
由于线粒体内细胞色素氧化酶系的作用，是该染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色。
【实验材料】人口腔黏膜上皮细胞、小鼠干细胞、Ringer液、0.02%詹纳斯绿B水溶液【实验步骤】1、人口腔黏膜上皮细胞线粒体的活体染色与观察（1）取干净的的载玻片，滴加两滴0.02%詹纳斯绿B染液。
（2）用干净的牙签在自己的口腔粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放放入载玻片上的染液中，染色10~15敏，盖上盖玻片，用吸水纸吸去周围溢出的染液，在于光学显微镜下观察。
2、小白鼠肝细胞线粒体的活体染色与观察（1）用脊椎脱臼法处死小鼠，至于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织块（0.5cm2 ），放入小烧杯中。
线粒体的超活染色与观察
姓名系年级13级生科3班组别同组者科目细胞生物学实验题目线粒体的超活染色与观察学号【实验目的】掌握动物细胞活体染色的原理和相关的技术。
【实验原理】活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。
它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。
活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。
体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。
体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部位，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。
碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子的，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。
但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。
一般是以碱性染料最为适用，可能因为它们具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。
詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。
线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。
詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。
【实验用品】1、材料：小白鼠肝脏、睾丸2、试剂：Ringer溶液：NaCl 0.85g + KCl 0.25g + CaCl2 0.03g + 蒸馏水100ml；1%、1/5000詹纳斯绿B溶液：称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，30-40℃加热，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。
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不同细胞中线粒体的形态和数目不同。在电子显微镜 下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状 。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒 体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。
线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。一般与线 粒体长轴垂直排列，但也可见到与线粒体长轴平行排列的 脊。脊的横切面呈囊状或管状。脊的数量与细胞呼吸机能 的强度有很大关系。
实验二、线粒体的活体染色
线粒体的活体染色
一、实验目的：
1、观察动物活细胞内线粒体的形态、数量与 分布。
2、掌握线粒体的活体染色原理及方法。 3、小鼠肝脏细胞线粒体染色及观察。
线粒体胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作 用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线 粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小 的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞 生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B（Janus green B ）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化 酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中 染料被还原，成为无色状态。
线粒体的活体染色
三、实验用品
1. 器材： 显微镜、手术器械、载玻片、盖玻片、吸管、牙
签、吸水纸、小平皿。 2. 试剂：
Ringer液、1/5000詹纳斯绿B、1%甲苯胺兰。 3. 材料：人口腔上皮细胞、小白鼠肝细胞。
线粒体的活体染色
四、实验方法
（一）人口腔上皮细胞的制备与观察
• 用牙签刮取口腔上皮细胞均匀地涂在载片上(不可反复涂沫)，滴一 滴甲苯胺兰染液，染色5分钟，盖上盖片，吸去多余染液。显微镜 下观察可见覆盖口腔表面的上皮细胞为扁平椭圆形，中央有椭圆形 核，染成蓝色。
线粒体的活体染色
3) 吸去染液，滴加Ringer 溶液，用眼科剪将组织块着色部 分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后，用吸管吸取分离出 的细胞悬液，滴一滴在载玻片上，盖上盖玻片进行观察。
4) 在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜下观察，可 见具有l～2 个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的 线粒体，注意其形态和分布状况。
线粒体的活体染色
五、作业：
1、绘口腔上皮细胞形态结构。
线粒体的活体染色
口腔上皮细胞 的线粒体分布
线粒体的活体染色
洋葱线粒内体的表活体皮染色细胞的线粒体分布
线粒体的活体染色
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3）在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜进 行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布 着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是 线粒体。
线粒体的活体染色
2、小白鼠肝细胞线粒体的活体染色观察 1) 用脊椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔， 取小白鼠肝边缘较薄的肝组织块，放入表面皿内。用吸管 吸取Ringer 液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。 2) 在干净的平皿中，滴加1/5000詹纳斯绿B溶液，再将肝 组织块移入染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织 块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充 分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即成 (一般需染20～30min)。
线粒体的活体染色
（二）、线粒体的活体染色与观察 1、人口腔上皮细胞线粒体的超活染色观察 1）取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴两 滴1/5000詹纳斯绿B染液。
线粒体的活体染色
2）实验者用牙签宽头在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取上 皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中， 染色10—15分钟（注意不可使染液干燥，必要时可再 加滴染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的 染液，置显微镜下观察。