细胞培养与细胞工程

01
动物细胞培养
动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相 关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白 酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。 基本过程：取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。将材料剪碎， 并用胰蛋白酶（或用胶原蛋白酶）处理（消化），形成分散 的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的 细胞悬浮液。悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为 细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停 止分裂增殖，出现接触抑制。此时需要将出现接触抑制的细 胞重新使用胰蛋白酶处理。再配成一定浓度的细胞悬浮液。 另外，原代培养就是从机体取出后立即进行的细胞、组织培 养。当细胞从动植物中生长迁移出来，形成生长晕并增大以 后，科学家接着进行传代培养，即将原代培养细胞分成若干 份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖。通过一 定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有 特殊性质的细胞称为细胞株。当培养超过50代时，大多数的 细胞已经衰老死亡，但仍有部分细胞发生了遗传物质的改变 出现了无限传代的特性，即癌变。此时的细胞被称为细胞系。
细胞培养与 细胞工程
Hale Waihona Puke Baidu
目录
Contents
01
动物细胞培养
02
植物细胞培养
03
细胞融合与单克隆抗体技术
04
显微操作技术与动物的克隆
细胞培养
细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱 度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的 一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培 养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说， 细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。 细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化 的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的 克隆。细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术，通过细胞 培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成 代谢、细胞的生长增殖等。
04
显微操作技术与 动物的克隆
动物克隆
动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。不经过有性生殖过 程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就 叫做动物克隆。 1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲 上采用“克隆 (Clone)”的术语，发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的 体细胞，经显微手术移植到去掉细胞核的卵母细胞中之后，在适当的条件 下，可以重新发育成正常胚胎。这种胚胎被移植到生殖周期相近的母体之 中，可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的动物，其遗传结构 与细胞核供体完全相同。
真核细胞是由细抱核和细胞质两大部分组成的，为了探明 核质相互作用的机制，科学家们创建了细胞拆合技术。所 谓细胞拆合就是把细胞核与细胞质分离开来，然后把不同 来原的胞质体(cytoplast) 和核体(karyoplast)相互组合,形成 核质杂交细胞。 细胞拆合可以分为物理法和化学法两种类型。物理法就是 用机械方法或短波光把细胞核去掉或使之失话，然后用微 吸管吸取其他细胞的核，注人去核的细胞质中，组成新的 杂交细胞。这种核移植必须用显微操纵仪进行操作。化学 法是用细胞松弛素B (cytochalasinB)处理细胞，细胞出现排 核现象，再结合离心技术，将细胞拆分为核体和胞质体两 部分。显微操作(micromanipulation)技术是早期建立的一 种实验胚胎学技术，即在显微镜下,用显微操作装置对细 胞进行解剖和微量注射(micoinjection) 的技术。现在显微 操作装置的设计愈来愈精密，不仅用于核移植，而且亦可 对细胞核进行解剖和向核内注人基因。
03
细胞融合与单克 隆抗体技术
细胞融合(cell fusion)是指在自发或人工诱导下，两个细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基 本过程包括细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形 成单核的杂种细胞。细胞融合可作为一种实验方法被广泛适用于单克隆抗体的制备，膜蛋白的研 究。 有性繁殖时发生的精卵结合是正常的细胞融合，即由两个配子融合形成一个新的二倍体。而细胞 融合为在自然条件下或用人工方法（生物的、物理的、化学的）使两个或两个以上的细胞合并形 成一个细胞的过程。其中人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于 它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细 胞生物学和医学研究的各个领域。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体；来自不同基 因型的杂交细胞则称为异核体。
细胞拆合、显微注射与现代分子生物学技术相结合使这些 经典的胚胎学技术展现出极大的潜力，它不仅成为核质关 系、细胞内某种mRNA或出白质功能等基础研究的重要手 段，而且在转基因动物、高等动物的克隆方面的理论与实 践研究中取得了重大的突破。
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02
植物细胞培养
植物细胞培养是在离体条件下，将愈伤组织或其他易 分散的组织置于 液体培养基中进行震荡培养，得到分 散成游离 的悬浮细胞，通过继代培养使 细胞增殖，从 而获得大量细胞群体的一种技术。 根据培养对象 ，植物细胞培养主要有单细胞培养，单 倍体培养，原生质体培养等 ；按照培养系统可分为悬 浮培养、液体培养、固体培养、固定化培养等。 离体的植物器官、组织或细胞，在培养了一段时间后， 会通过细胞分裂，形成愈伤组织。由高度分化的植物 器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细 胞的脱分化，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组 织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官， 这个过程叫做再分化。再分化形成的试管苗，栽培壮 苗后移栽到地里，可以发育成完整的植物体。依据的 原理是植物细胞的全能性。
细胞工程
细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说，它是应用细胞生物学和 分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗 传操作及进行大规模的细胞和组织培养。当前细胞工程所涉及的主要技术 领域有细胞培养、细胞融合、细胞拆合、染色体操作及基因转移等方面。 通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生 新的物种或品系。其核心技术是细胞培养与繁殖。目的为获得新性状、新 个体、新物质或产品。 细胞工程与基因工程一起代表着生物技术最新的发展前沿，伴随着试管植 物、试管动物、转基因生物反应器等相继问世，细胞工程在生命科学、农 业、医药、食品、环境保护等领域发挥着越来越重要的作用。
根据培养方式可分为：贴壁细胞培养，半悬浮细胞培养，悬浮细胞培养 贴壁细胞培养：是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁 上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培 养表面，并形成致密的细胞单层。 半悬浮细胞培养：非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。 悬浮细胞培养：非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。指的是一种在受到不断搅动或摇动的液体培养 基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系统，是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。某些贴壁依 赖性细胞经过适应和选择也可用此方法培养。
根据细胞种类可分为：原代细胞培养， 传代细胞培养 原代细胞：将动物各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA) 或机械方法 处理，分散成单细胞，在合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培 养。培养的细胞为正常的动物细胞，一般培养10代后不再增殖，死亡。 传代细胞：传代培养是细胞培养常规保种方法之一，也是所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培 养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长，这一过程就叫传代。传代培养可获 得大量供实验所需细胞。细胞传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细地无菌操作。 培养的细胞为癌变或人为癌化的细胞，理论上可以无限增殖。癌化的方式有很多：进行癌基因突变， 感染病毒，从癌症供体体内分离，物理或化学方法（如紫外，化学试剂）等。
组织培养：诱发产生愈伤组织，如果条件适宜，可培养出再生植 株。用于研究植物的生长发育、分化和遗传变异；进行无性繁殖； 制取代谢产物。 悬浮细胞培养：在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养 技术。适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。 原生质体培养：脱壁后的植物细胞称为原生质体（protoplast）， 其特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便于进 行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍 可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株： 单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株，经人为加 倍后可得到完全纯合的个体。
细胞融合其意义： 理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利 用具有深远的意义。 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有 效途径。 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶 绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。
细胞融合方法
仙台病毒法融合：1.两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞 膜上。并使两细胞相互凝聚；2.在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需 要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；3.细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP； 4.融合成巨大细胞，仍需ATP。 聚乙二醇（PEG）法：聚乙二醇（PEG）结构为：HOH2C（CH20CH2)nCH2OH，分子量大于200小 于6000者均可用作细胞融合剂。PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。一般选用分子量为 4,000，常用浓度为50%，pH8.0～pH8.2（用10%NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差， 又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。 电融合法：在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发 生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。 优点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小；装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观 察融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。 离心振动：物理方法之一，使用离心机等机器实现细胞之间的融合。
单克隆抗体技术：一种免疫学技术，将产生抗体 的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞进行细胞融合， 获得既能产生抗体， 又能无限增殖的杂种细胞， 并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出 来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多 种类型的细胞制造出来的一种抗体。 特点： 一是特异性，针对特定的单一抗原表位，它具有 高度的特异性，抗肿瘤抗体药物的研究表明，其 特异性主要表现为特异性结合、选择性杀伤靶细 胞、体内靶向性分布以及具有更强的疗效。 二是多样性，主要表现在靶抗原的多样性、抗体 结构的多样性、作用机制的多样性等方面。 三是定向性，抗体药物可以定向制造，就是根据 需要制备具有不同治疗作用的抗体药物。基于这 些特点，我们可以用来制成“生物导弹”运送药 物至病害部位，主要是癌细胞，从而达到治疗效 果。