细菌学检验-4-细菌的分型及其检测技术

意义
①可预测抗菌治疗的效果， “敏感”治疗可 能有效； “耐药” 肯定失败；
②指导医生选择使用抗生素，AST的结果为 “耐药”，即应更换药物；
③提供所选择药物的依据； ④监测耐药性，分析耐药菌变迁，掌握耐药
菌感染病流行病学，控制和预防耐药菌感 染发生和流行。
常用方法：
纸片扩散法 稀释法 E-TEST法 联合药敏试验 自动化检测法 分子生物学方法
测MIC（最小抑菌浓度）：某抗菌药物抑制待测
菌生长的最低浓度。
测MBC （最小杀菌浓度）：是指能杀灭99．9％
以上测试菌量的最低药物浓度。
微量液体稀释法 (microdilution test)
原理：
聚乙烯板内含有各种稀释度的抗菌药物，实验时加入 100μl浓度为105 CFU/ml的菌液，盖上盖板，35℃16～20h 观察结果。孔底部清晰不出现细菌沉淀的最低抗菌药物浓 度即为该抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度，通过CLSI标准 判断其敏感和耐药。
7.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于 M-H琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各 抗菌纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内 缘应大于15mm。
8.经过35℃16～24h孵育。
9.量取抑菌环直径（mm)， 根据CLSI（clinical and
laboratory standards
5.盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放 置3~10分钟干燥后贴上标准抗生素纸片。
6.根据选择的菌株挑选相应的抗菌纸片。
肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/他唑 巴坦、头孢噻肟、环丙沙星、亚胺培南、氨曲南、 庆大霉素； 铜绿假单胞菌：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、 阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南； 葡萄球菌属：头孢西丁、青霉素、红霉素、万古霉 素、环丙沙星、庆大霉素、利福平 ；
二、纸片扩散法（Kirby-Bauer法）
原理：
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼 脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解 后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸 片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而 形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度， 并与该药对测试菌的MIC（最小抑菌浓度）呈负相 关。
形态学检查 生化试验
血清学试验 动物试验 药敏试验
第一节 细菌噬菌体分型技术
噬菌体是一类能感染细菌、放线菌、真菌、 螺旋体的病毒。
噬菌体的感染具有高度特异性，一种噬菌 体只能裂解一种或与该种相近的细菌，故 可用于细菌的分类鉴定。
具种的特异性和型的特异性。
在液体培养基中，噬菌体和相应细菌混合培 养，可使浑浊的菌液变为澄清。
institute ）标准，报
告细菌对该抗生素： 敏感(susceptible,S)、 注：NCCLS是美国临床实验室标
准化委员会的英文缩写，推荐的
耐药(resistant,R)、 抗微生物药物敏感性试验操作方 中介(intermediate,I)。法和判断标准被世界上许多国家
和地区所采用。
2005年该委员会更名为临床实验 室标准化协会 CLSI
敏感（susceptible, S）：表示测试菌能被测定药物常 规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。
中介（intermediate, I）：指最小抑菌浓度（MIC）接 近药物的血液浓度或组织浓度，疗效低于敏感菌。中 介还可作为敏感和耐药的缓冲区，以减少实验条件的 失控而导致较大的错误结果。对于K-B纸片法结果表 现为“中介”的药物，应做定量药敏试验来确证其敏 感性。
操作方法 ：
1.将在约56℃恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为 90mm的平板，其厚度 4mm。
2.无菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5个菌落。
3.待检菌置于无菌生理盐水中，校正其浊度 （菌液浓度）至0.5麦氏比浊标准（McFarland standard） 。
4.涂布接种：用无菌棉 签浸入细菌悬液中，将 拭子在试管上壁轻轻挤 压以挤去过多的菌液。 棉签在三个方向均匀抹 琼脂表面（每次转60°） 使菌液均匀分布，最后 沿平板内缘涂抹一周。
耐药（resistant, R）：表示测试菌不能被测定药物常 规给药后在体内能够达到的浓度所抑制。
质量控制
培养基 菌液浓度 含药纸片 采用标准菌株作对照。
三、稀释法
是体外定量测定抗菌药物抑制待检菌生长活 性的方法。将抗菌药物在液体或固体培养基 中稀释。
肉汤稀释法 琼Baidu Nhomakorabea稀释法
通过观察是否形成抑菌斑（抑菌区 域），对实验菌进一步分型鉴定。
第三节 细菌的药物敏感性试 验与分型
一、概述
细菌的药物敏感试验(drug susceptibility test)：
是指在体外测定抗菌药物抑制或杀死细菌的能 力试验，简称药敏试验。
抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和 化学合成药物。前者是真菌、放线菌、细菌等 的代谢物，后者是经化学改造的半合成抗生素 和化学合成药物。
第四章
细菌的分型及其检测技术
细菌噬菌体分型技术 细菌素分型技术 细菌的药物敏感试验与分型 分子生物学分型技术（略） 色谱和质谱技术在细菌学检验中的应用
（略） 细菌的自动化鉴定技术
致病菌的检验程序
标本
直接涂片检查 分离培养 分子生物学技术 其它
(并非所有标本)
（核酸杂交、PCR） (HPLC)
噬菌斑(plaque) ：在固体培养基上，噬菌体
对宿主菌细胞的裂解作用可使菌落溶解，导 致在带菌琼脂平板上产空斑，易于观察。 不同噬菌体产生噬菌斑的形状、大小和透亮 度不同，依此将同一种细菌分为不同的噬菌 体型。
噬菌斑
噬菌体分型的优缺点
优点
特异性强 方法简单快速 结果直观、容易判断 重复性好 对细菌性传染病的流
行病学研究具有重要 意义。
缺点
假阳性现象 要求操作标准化
第二节 细菌素分型
细菌素是某些细菌产生的蛋白质类抗菌物 质，抗菌范围很窄，只对产生菌亲缘关系 近的细菌有作用。
根据敏感谱或产生谱可进行细菌分型和流 行病学调查。
其作用的特异性不如噬菌体严格。
对某细菌素敏感的细菌，遇细菌素时， 在平板上的生长会受到抑制。