人类细胞表面IgSF相互作用组揭示蛋白质-蛋白质相互作用的复杂网络

人类细胞表面IgSF相互作用组揭示蛋白质-蛋白质相互作
用的复杂网络
导读
细胞表面蛋白的相互作用（PPIs）对于介导细胞间的通讯、识别和应答具有重要作用。

本研究开发了一套高通量基于ELISA的细胞外相互作用组分析平台并整合自动池化蛋白策略，对564种人细胞表面蛋白和分泌蛋白（大部分为免疫球蛋白超家族（IgSF）蛋白）进行相互作用组分析，检测了所有318,096个PPI组合。

进一步的系统进化同源性分析，发现约380个以前未报告的PPIs，并利用表面等离振子共振和细胞结合实验验证了其中一个子集。

PPIs揭示了生物系统内部和生物系统之间相互作用的复杂庞大的网络，同时确定了与受体以及“孤儿”受体结合的新型PPIs。

这些PPIs包括在多种细胞类型上表达的蛋白质，并参与多种过程（如免疫和神经系统的发育和功能、分化/增殖、代谢、血管生成和增殖），有助于进一步的功能相关性研究和药物靶点的发现。

实验设计如下
结果
1 用于PPI筛选的蛋白质的选择和生产
为鉴定人类IgSF蛋白，研究者利用HUGO基因命名委员会（HGNC）、人蛋白质图谱和UniProt 数据库，通过“诱饵”和“猎物”多聚结构域将感兴趣的458个IgSF和106个非IgSF蛋白的胞外结构域（ECDs）和分泌蛋白聚集到细胞上清中（图1A和1B），并通过Western blot验证其表达。

本研究及其它团队都已证明基于ELISA的细胞外相互作用组测定（ECIA）和其他基于ELISA的结合实验均能在蛋白量表达很低的情况下检测到PPIs。

因此认为无论是否检测到蛋白质，所有诱饵和猎物都包括在筛选中。

2 自动汇集猎物ECIA平台的开发
ECIA和其他基于ELISA的检测方法允许直接从培养基中检测诱饵和猎物蛋白的结合（图1B），对每孔的猎物-诱饵对进行分析。

为增加通量，研究者池化三组猎物，并在筛选后对阳性孔去卷积化以鉴定PPIs（图1B）。

用一组已知的PPIs进行池化实验显示，猎物经过3倍稀
释后也能与PPIs结合（图1C）。

由于对诱饵-猎物进行双向测试，相反方向的阳性结果可以“弥补”池化蛋白策略所导致的假阴性。

因此认为，池化的优势（减少结合反应的数量）远远超过了假阴性的潜在增长。

为了进一步提高通量，研究者优化384孔的格式，并利用液体处理机器人开发了自动化工作流程。

apECIA平台可实现每周测试55,296对诱饵-猎物组合。

PPI筛选揭示了复杂的PPIs网络。

筛选后，对阳性孔进行去卷积化（图1B），并排除非特异性PPIs 后，发现495个阳性孔中包含了426个独特PPIs。

在每种情况下，三个去卷积的猎物中只有一个能够产生阳性信号。

为了证实其相互结合，将阳性猎物针对其同源诱饵一分为三再次测试。

约81%的PPIs（345/426）在IgSF蛋白之间，其余19％的PPIs存在于 IgSF与筛选体系中的其他蛋白质之间。

检测的蛋白质中有一半与PPIs有关（254 / 564，45％），不参与PPIs的蛋白质可能会被错误折叠。

研究者同时证实了此平台的灵敏度，许多以极低水平表达的诱饵或猎物蛋白仍与一种或两种PPIs结合，但对于表达量极低的猎物蛋白，可能存在假阴性的结果。

在426个PPIs中，有345个（81％）以前未报道过。

大多数PPIs（408/426）形成一个包含226种蛋白质的复杂网络（图1D）。

只有涉及18个PPIs的28种蛋白质未连接到此网络（网络的不同区域如图2所示）。

98个蛋白质（39％）具有1个PPI，113个蛋白质（44％）具有2至5个PPIs，43个蛋白质（17％）具有5个以上 PPIs（图1E）。

由于45％的蛋白质表现出结合力，因此研究者计算了每种蛋白质结合x-16个PPIs的预期频率，并比较预期频率和实际观察到的频率（图1F）。

实际观察到的结合伴侣数量显著大于随机预测而得的PPIs数量。

PPIs经常发生在亚家族内部和亚家族之间的系统发育相关蛋白之间。

研究者进行多个序列比对以鉴定亚家族成员并形成了系统发育树。

利用apECIA-PHA的组合方法沿着系统发育树分析所筛选的数据，以预测在筛选中可能遗漏的亚家族成员间的PPIs。

研究者选择筛选和PHA
预测的一个PPIs子集进行SPR验证。

理想的PPIs可通过SPR高度敏感地观察到明显的结合和解离。

PPIs的特征性结合谱表现出高于背景的清晰共振信号（阴性对照配体和受体）和浓度依赖性结合曲线，被认为是特异性配体-分析物PPI的标志。

非特异性PPIs通常表现出一定的偏差，如高背景和非线性浓度响应。

利用SPR检测了在筛选中得到的24个新型PPIs，存在23个特定的配体-分析物相互作用。

研究者另外测试了35种PHA预测的PPIs，观察到 33个特定的相互作用。

在小鼠和跨物种（人类-小鼠）的同源蛋白之间还观察到了另外三个PPIs。

总之，本研究利用SPR共验证了59个新型PPIs。

4 apECIA-PHA组合方法揭示多种DCC亚家族间PPIs
轴突导向因子-1受体DCC在神经系统中的功能较为明确，且DCC作为依赖性受体，与结直肠癌和其他癌症密切相关，但在癌症中的作用尚不清楚。

研究者发现DCC与胰岛素样生长因子结合蛋白1（IGFBPL1）结合，但不与胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）结合（图2I和3A）。

系统发育进化树显示，IGFBPL1和IGFBP7在同一簇中，并且在各亚家族成员之间具有最高的氨基酸序列相似性（55％）。

SPR检测分析显示，DCC均能与IGFBPL1和IGFBP7结合（图3C）。

PHA显示 DCC聚集的四种蛋白质：PUNC、PUNC e11、再生蛋白（NEO1）和原蛋白（PRTG）（图3A）。

这些蛋白质共同作用于多种生理过程，包括神经系统发育、肌生成和血管生成、炎症和组织再生、白细胞迁移、神经管和乳腺形成、骨骼和结缔组织发育以及干细胞分化。

PUNC 是神经系统发育过程中所表达的“孤儿”受体。

PUNC e11和PRTG结合细胞间粘附分子5（ICAM5）（图3A），该蛋白质在大脑中特异性表达，在突触形成、稳定和细化中起作用。

裂解的ICAM5 ECD通过细胞因子发挥免疫抑制功能，并调节脑组织炎症反应。

SPR实验证实PUNC e11和PRTG 可与ICAM5结合，尽管在筛选中未检测到其余DCC亚家族成员中与ICAM5作用的PPIs（图3C）。

在本筛选体系中观察到一个或多个DCC亚家族成员还与WFIKKN2（一种分泌的蛋白质，可与转化生长因子-β亚家族成员结合并调节其呈递给细胞的状态）、乳运铁蛋白（ LTF，一种具有抗菌活性的铁结合蛋白）、白细胞介素6受体亚基α（IL-6Rα，一种细胞因子受体）和ISLR2 / LINX（在神经系统发育中起作用）。

SPR实验证实所有DCC亚家族成员均能与这些蛋白质以及筛选得到的其他蛋白质结合（图3C，3D和3F）。

这些结果表明使用apECIA-PHA方法对于确定筛选体系外的PPIs具有重要意义，阐释更加完整的蛋白质-蛋白质互作网络（图3F）。

IIA型酪氨酸磷酸酶受体（LAR-PTPR）的LAR家族包括PTPRF（也称LAR），PTPRD和PTPRS （图4A和4B）。

LAR-PTPR在突触组织和功能中起重要作用。

突触前的LAR-PTPR与多个突触后配体通过PPIs介导跨突触粘附。

LAR-PTPRs及其配体突变的小鼠表现出突触结构和功能的缺陷。

以往研究已经发现特定LAR-PTPR和SALM2 / 3/5之间的多种PPIs（图4A）。

在本筛选体系中观察到上述已知和其它尚未明确的PPIs（图2D, 4A和4C）。

进一步利用SPR检测
LAR-PTPR与所有SALM的相互作用。

除PTPRF-SALM4外，所有LAR-PTPR均与SALM家族结合（图4E）。

但PTPR-SALM对在最大响应单位（RU）方面存在差异，提示LAR-PTPR和SALM之间的亲和力具有一定的范围（图4F）。

5.2 LAR-PTRR亚家族与白细胞介素1受体辅助蛋白（IL1APs）间具有PPIs
LAR-PTPR与IL1RAP和IL1RAPL1间跨突出的相互作用，可诱导突触前和突触后双向分化。

以往研究认为IL1RAP与所有LAR-PTPRs和带有PTPRD的IL1RAPL1相互作用，此外，研究者还观察到IL1RAPL1与PTPRS的结合（图2D）。

IL1RAPL1与IL1RAPL2具有79％的序列相似性，IL1RAPL2作为脑中表达的孤儿受体，生物学功能尚不明确。

在本筛选体系中，研究者观察到
IL1RAPL2与PTPRD和PTPRS结合（图2D）。

此外，筛选体系以及SPR实验均表明 IL1RAPL2
可与成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）相互作用。

5.3 IIB型PTPR与DSCAMs具有PPIs
IIB型PTPR在大多数组织中表达，并调节多种过程(细胞生长、迁移和分化、免疫细胞发育等）。

IIB型亚家族由PTPRK，PTPRM和PTPRT组成（图4A和4B），并且多个配体已经明确。

研究者在此发现所有IIB型PTPR与唐氏综合症细胞粘附分子（DSCAM）和唐氏综合症细胞粘附分子样-1（DSCAML1）结合（图4A和4C）。

DSCAMs的ECD区包含9个Ig样区域，紧随 4个FN3域，1个Ig样域和2个FN3域（图4B）。

N端与同种抗原结合，并介导与netrin-1和split-1的结合，尚为证实C端ECD区域的结合配体。

此外，研究者观察到两个DSCAM（DSCAM-CT和DSCAML1-CT）和所有IIA型PTPR的C端结合（图4C）。

SPR实验也进一步证实了DSCAM-CT和DSCAML1-CT与PTPRT和PTPRM的结合（尽管PTPRK表达水平较低）（图4D）。

研究人员在免疫系统蛋白质以及孤儿受体发现了新的PPI（图2B）。

检测到孤儿粒细胞受体CEACAM4的两个PPI，分别为血管内皮生长因子受体3（VEGFR3）和程序性细胞死亡1配体2（PD-L2）。

CEACAM4是在免疫系统，上皮和内皮细胞以及大脑中表达的癌胚抗原相关细胞粘附分子亚家族的成员。

此外，研究者还观察到CEACAM1与免疫检查点受体PD-1（程序性细胞死亡蛋白1）结合。

PD-1及其配体PD-L1和PD-L2的相互作用抑制T细胞增殖、细胞因子生成和细胞毒性。

PD-L2与PD-L1竞争结合PD-1，并且在肿瘤细胞中表达，提示PD-L2可能在肿瘤逃逸中发挥作用。

SPR实验证实了PD-L1和PD-L2之间的已知PPIs，并观察到PD-L1的同系结合（既往未知的PPIs）。

通过对PD-L1与PD-1结合（在约400 nM时接近饱和）的比较，推断PD-L1同源结合的亲和力低于与PD-1的结合。

这也解释了在既往PD-1 / PD-L1研究中未发现此PPIs的原因，暗示多聚蛋白对低亲和力PPIs的检测具有重要价值。

6.1 嗜同性和嗜异性Siglec亚家族PPIs
在此筛选体系中具有最多PPIs的蛋白质中有八个是Siglec亚家族的成员，该蛋白质高度受限于免疫系统，对Toll样受体（TLR）信号具有免疫调节作用，并在自我和异己识别中具有重要作用。

Siglecs在细胞上差异表达，特异性识别健康细胞、发炎或恶性细胞以及病原体上存在的唾液酸多聚糖。

此外，研究者观察到Siglecs之间的同质和异质性PPIs网络（图2H）以及与远距离蛋白间的PPIs。

6.2 免疫和神经系统蛋白质间的PPIs
信号转导的淋巴细胞激活分子亚家族（SLAM）表达于大多数免疫细胞中，SLAMs在先天和适应性免疫中起共刺激和共抑制分子的作用，并且对于自身免疫性疾病不可或缺。

SLAMF9作为孤儿受体，研究者观察到其与杀菌通透性增加蛋白（BPI）和IGSF10结合（图2C）。

BPI是中性粒细胞衍生的抗生素蛋白，通过其高度阳离子化的N端结构域发挥杀菌作用。

BPI的C端结构域没有杀菌活性，能够与其他蛋白质相互作用，并在不同的过程中发挥作用。

IgSF10也是一种孤儿受体，参与促性腺激素释放激素表达（GnRH）神经元的迁移。

IgSF10在免疫系统中功能未知，而SLAMF9在神经系统中的功能尚不清楚，因此本研究揭示了来自不同生物系统的两个孤儿受体之间的PPIs。

6.3 妊娠特异性糖蛋白（PSG）间的PPIs
妊娠期间，PSG是母体血液中最丰富的滋养层蛋白，可作为滋养层质量和胚胎存活力的标志，但其作用机制尚不清楚。

研究表明PSG还具有免疫调节、促血管生成和抗血小板聚集功能。

研究者观察到几种PSG结合配体，包括血小板衍生的生长因子受体α（PDGFRA）、成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）、C型凝集素结构域家族4成员A（CLEC4A）、DCC和DSCAM（图2I 和3B）。

但PSG与这些配体的结合具有一定的选择性和差异（图2I）。

SPR实验证实了DCC
和DSCAM与PSG7和PSG9的结合（图3E）。

这些PPIs为研究PSG在妊娠、免疫调节和血管生成中的作用提供了新的候选受体。

6.4 LILR亚家族与BTNL8和髓鞘蛋白间的PPIs
白细胞免疫球蛋白样受体（LILRs）是激活性（LILRA）和抑制性（LILRB）受体的一个亚家族，在炎症、免疫耐受和分化中表现出免疫调节活性和功能。

多个激活和抑制性LILR与butyrophilin-8（BTNL8）的结合（图2F）。

BTNL是扩展的B7分子家族成员，可作为 T细胞活化的共刺激或共抑制信号。

此外，LILRs也表达在神经元上，并在发育、突触可塑性和轴突再生的调节中发挥作用。

髓磷脂是轴突周围的保护性绝缘层，可抑制脊髓损伤后的神经元再生。

已知三种髓磷脂蛋白Nogo，MAG和OMgp与小鼠中的PirB（两种小鼠LILRB直系同源物中的一种）相互作用。

同时，观察到多个LILRs与两个其他髓磷脂蛋白结合，即髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白（MOG）和髓磷脂蛋白P0（MPZ）（图2F）。

这些PPIs提示MOLI和MPZ与LILR的结合可作为神经元再生研究的新靶点。

6.5 PVR选择性与杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）相互作用
多基因杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）是在自然杀伤（NK）细胞上表达的激活和抑制蛋白的高度多态性亚家族，可调节细胞发育、成熟和激活。

NK细胞最初会随机表达KIRs，在成熟过程中对其进行优化以调整杀伤反应阈值，并确保从健康细胞中区分靶细胞。

本研究观察到KIR2DL5与脊髓灰质炎病毒受体（PVR）结合（图2C和5A）。

ECIA滴定分析和SPR同样证实KIR2DL5与PVR的结合（图5C和5D）。

为验证在细胞表面的结合，将PVR-Fc和KIR2DL5-Fc 的荧光四聚体（ECD-Fc：SA-647）分别与转染全长KIR2DL5-或 PVR的细胞共孵育。

流式细胞仪分析显示两种配体与表达同源全长受体细胞的结合具有浓度依赖性（图5E）。

PVR-Fc四聚体不结合经全长KIR2DL4和KIR2DL1转染的细胞，全长KIR2DL4和KIR2DL1与KIR2DL5分别具有87％和69％的序列相似性（图5B和5F）。

为进一步验证PVR对KIR2DL5的特异性，研究者利用11个KIRs进行了ECIA，PVR与KIR2DL5特异性结合（图5G）。

由于KIR2DL5与病毒易感性以及抗病毒治疗的低应答有关，本研究观察到的特异性结合暗示KIR2DL5在免疫应答中具有一定作用。

高亲和力神经生长因子受体（NTRK1）也称为TrkA，在神经系统中具有的功能较为明确，然而其在免疫系统中的作用尚未明确。

TrkA在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、静息和活化的B细胞、嗜中性粒细胞和成红细胞中均有表达。

研究者在筛选体系中观察到TrkA与酪氨酸蛋白激酶受体TIE1结合，但不与TIE2结合（图2A和6A）。

SPR实验同样表明TrkA与TIE1结合，但不与TIE2结合（图6B）。

接下来，研究者探讨TrkA是否可以同时结合NGF和TIE1，利用NGF对TrkA预处理，并通过SPR实验比较TrkA±NGF与TIE1的结合（图6B）。

与单独的TrkA相比，TrkA：NGF与TIE1的结合其最大相应单位（RU）升高，表明与NGF结合的TrkA 可以与TIE1相互作用。

此外，研究者检测TrkA-Fc四聚体与转染全长TIE1细胞的结合，观察到与转染TIE1细胞的结合具有浓度依赖性（图6C）。

这些数据表明TrkA与TIE1的相互作用可能在血管生成和/或其他生物学过程中发挥作用。

7 瘦素与ISLR2相互作用
瘦素是一种主要由小肠中的脂肪细胞和肠上皮细胞分泌的细胞因子，是维持能量稳态和体重所必需的。

瘦素通过与下丘脑神经元亚型中的瘦素受体（LEPR）结合而发挥上述功能。

瘦素缺乏会导致各种代谢异常和罕见的遗传缺陷。

然而许多其他类型的细胞也分泌瘦素，且LEPR 在其他神经元亚型和非神经元细胞中均表达，表明瘦素在其他过程中同样发挥作用。

本研究观察到瘦蛋白与神经元表达的ISLR2结合（图2A），ISLR2的ECD区包含七个LRR，其后是三个Ig样结构域（图6D）。

为了绘制与瘦素结合的ISLR2区域，研究者利用两个包含LRR1-7和
Ig1-3的ECD截短域，经ECIA测量其瘦素的结合，结果发现瘦蛋白可等效地结合到整个ECD
和LRR1-7，但并不与Ig1-3的结合（图6E）。

同样，研究者检测瘦素-Fc四聚体与转染全长ISLR2细胞的结合，观察到与转染ISLR2细胞的结合具有浓度依赖性（图6F）。

Lep-/-小鼠是进行肥胖症研究的经典模型，因此本研究通过ECIA检测人瘦素与小鼠Islr2的结合（图6G）。

之后利用SPR检测单体型人和小鼠瘦素与人ISLR2和小鼠Islr2结合的亲和力（图6I）。

在对照组中，人和小鼠的瘦蛋白结合其同源的LEPR和Lepr。

为了研究瘦蛋白是否可以同时结合ISLR2和LEPR，研究者利用LEPR对瘦蛋白进行预处理，并通过SPR实验比较瘦蛋白±LEPR与ISLR2的结合。

与单独的瘦蛋白组相比，瘦素：LEPR并不与 ISLR2结合，表明瘦蛋白不能同时结合LEPR和ISLR2（图6H）。

为了评估瘦素与ISLR2结合的减少是否具有LEPR浓度依赖性，利用梯度浓度增加的LEPR对瘦蛋白预处理，结果显示瘦蛋白与ISLR2的结合随着LEPR浓度的增加而降低（图6H）。

ISLR2与瘦素间的相互作用为未来研究瘦素在调节脂肪储存或其他生理过程以及瘦素缺乏症中的功能提供新思路。

结论
本研究系统绘制了细胞外PPIs图谱，对研究细胞表面PPIs在健康和疾病组织中的作用具有重要的参考价值，对蛋白间PPIs的同源性、功能性、系统表达性以及信号转导功能的探索，为未来的疾病相关研究和治疗干预手段的开发提供新的方向。