MicroRNA Inhibitor产品使用手册
赛默飞世尔TaqMan MicroRNA Assays 简要操作说明说明书
快速参考手册TaqMan MicroRNA Assays简要操作说明（Rev.A.0）本操作说明提供了TaqMan MicroRNA Assays的简要操作指南。
更详细信息，请至赛默飞世尔官方网站下载英文版说明书：https:///content/sfs/manuals/cms_042167.pdf一．配制反转录体系1.准备总RNA（1）注意：应选择适当的提取方法，避免提取过程中丢失microRNA（2）RNA定量2.准备反转录预混液（1）将Taqman MicroRNA反转录试剂盒中的组分放在冰上融化后涡旋混匀。
（2）准备一支无RNA酶的离心管，参照下表，在冰上配制反转录预混液。
组成成分反应体系100mM dNTPs(with dTTP)0.15µl反转录酶 1.00µl10X反转录buffer 1.50µlRNase抑制剂0.19µl无核酸酶H2O 4.16µl总体积7.00µl（3）涡旋混匀，离心。
（4）将反转录预混液放置在冰上备用。
3.配制反转录体系（1）在冰上将5x反转录引物和RNA模板融化。
涡旋混匀。
（2）15µl的反转录体系中，加入1-10ng RNA（5µl），7µl反转录预混液，3µl反转录引物，涡旋混匀，离心。
（3）将反应管放在冰上放置5分钟，然后进行反转录实验。
4.设置反转录步骤将反应管放入PCR仪内，按照下列的反应程序进行设置：模式：标准模式，反应体积：15µl阶段时间温度退火30分钟16°C延伸30分钟42°C失活5分钟85°C∞4°C2二．定量PCR 扩增1.准备定量PCR 反应体系（1）将反应用到的组分放在冰上融化，混匀后放置冰上备用。
（2）按照20µl 反应体系计算所需要的试剂量。
将各组分加入离心管中，涡旋混匀，离心。
罗氏RNA提取试剂盒使用指南说明书
Step 1: Sample Preparation & Nucleic Acid IsolationFor great results, use (click product names to learn more):Roche High Pure RNA Isolation KitRoche High Pure FFPET RNA Isolation KitRoche High Pure miRNA Isolation KitRoche RealTime ready Cell Lysis KitFrom which source (animal, organ, tissue) does the examined material originally come from? Which volume or mass or cell number was used for nucleic acid preparation?My MIQE Guide*Empowering results that matter Sponsored by Roche Applied Science Experiment title:Performed by:Date:Institution:Experimental design: How did you choose and set up your study (number of treated samplesand controls)Handling: Which tools or methods were used to obtain and process the primary samples (e.g., micro-dissection, macrodissection)?Method of processing and preservation: How was the sample treated and stored?If frozen – how and how quickly?If fixed – with what, and how quickly?If stored for longer: how and how long? (especially for FFPE samples)Extraction method:Which kit or instrument was used to extract/isolate the DNA/RNA from the starting material? Roche High Pure RNA Isolation Kit, High Pure FFPET RNA Isolation Kit, High Pure miRNA Isolation Kit, RealTime ready Cell Lysis Kit, or other (Please specify)Was the vendor’s protocol modified (If Yes, when, and how? e.g. by using additives)Did you do a DNAse or RNAse treatment? (If Yes, when?)Did you check for nucleic acid purity and integrity? If Yes: By using which instrument and method? What was the resulting purity (A260/A280)? What was the resulting yield? If No: Why not?Did you check for the presence of PCR inhibitors? If Yes: By using what (e.g. Cq dilutions, spike or other (please specify)If No: Why not?Final storage solution (e.g., buffer, H2O) for the purified total RNA:Storage time and temperature of the purified total RNA before use in RT-qPCR:Step 2:Reverse TranscriptionFor optimal results, use:Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis KitRoche Transcriptor Universal cDNA MasterAmount of RNA and reaction volume:Priming oligonucleotide (if using gene specific primers) and concentration: Reaction temperature and time:Manufacturer of reverse transcription reagent(s) and catalogue number(s): Reverse transcriptase type and used concentration:Storage conditions of cDNA:Step 3:PCR Amplification and AnalysisFor best results, use:LightCycler® 480 Probes MasterFastStart Essential DNA Probes MasterFastStart Universal Probe Master (Rox)Target sequence and amplicon information: Target gene database sequence accession number:Location of amplicon:Amplicon length:Result of in silico specificity screen (BLAST, etc.):Information on pseudogenes, retropseudogenes or other homologs: Secondary structure analysis of amplicon:Determined by which method?Location of each primer relative to exons or introns (if applicable): Targeted splice variants:RTPrimerDB Identification Numbers: Manufacturer of oligonucleotides: Purification method:For probe-based assays: Probe type:qPCR reaction conditionsReaction volume and amount of cDNA/DNA per reaction: Primer, (probe), Mg2+ and dNTP concentrations: Polymerase identity:Buffer/kit manufacturer and identity (e.g., catalog number)Manufacturer and catalog number of plates or tubes and catalog number:Complete thermocycling parameters:Reaction setup: Was it manual or robotic? If robotic: Using which robot?Equipment: Which Real-Time PCR instrument was used? (Which Roche LightCycler® System or other (please specify)?)Validation of qPCR runs:Are you running a multiplex assay? If yes, please describe efficiency and limit of detection foreach assay:How did you check for specificity of amplification for each target (e.g., on a gel, by sequencing, melt-ing curve analysis or digest):For SYBR Green I assays: Cq of the non-template control reaction:Standard curve characteristics (slope and y-intercept):How many replicates did you use to establish the standard curve?(xx replicates per standard concentration)What was the lower and the upper limit of the standard curve?PCR efficiency calculated from slope:Confidence interval for PCR efficiency or standard error:r2 of standard curve:Information on linear dynamic range:Cq variation at lower limit: Confidence intervals throughout range:Evidence for limit of detection:How many reactions per run were used for controls? (please specify positive and negative controls, controls without template and No RT controls, e.g. Positive controls: 3 reactions in 5 replicates per 96 well plate)Data analysis:Vendor software: Which software type, version and algorithm provided by the PCR machine supplier was used to analyze the data?Specialist software: Which (if any) additional software was used? Self-developed algorithms,or other (please specify)Normalisation: Which reference gene(s) were used to calculate the relative expression of the studied genes?What was the reason for choosing these particular genes?Which algorithm (e.g., geNorm, bestkeeper, normfinder) was used to normalize for reference gene(s)Which principle was used for Cq calling?What was the number and of biological replicates used?How was their concordance?How many technical replicates were used, and at which step (RT or qPCR)? What was the observed repeatability (intra-assay variation)?What was the observed reproducibility (inter-assay variation, %CV)The MIQE guidelines empower results that truly matter. And so does Roche.Visit to discover all the materials you need for truly remarkable research results.* modified based on the list in the original MIQE guidelines publication with permission of the MIQE authors.For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. LIGHTCYCLER and FASTSTART are trademarks of Roche.All other product names and trademarks are the property of their respective owners. NOTICE: This product may be subject to certain use restrictions. Before using this product, please refer to the Online Technical Support page () and search under the product number or the product name, whether this product is subject to a license disclaimer containing use restrictions.Published byRoche Diagnostics GmbH Sandhofer Straße 116 68305 Mannheim Germany© 2013 Roche Diagnostics. All rights reserved.*********** 1012。
锐博生物_ribobio_miRNA产品使用说明
miRNA产品使用说明RN：R10034.5 产品简介micr ON™ miRNA mimic是miRNA模拟物，化学合成的成熟miRNA双链，即用型；micr OFF™ miRNA inhibitor是miRNA抑制物，化学修饰的成熟miRNA互补单链，即用型；micr ON™ miRNA agomir是特殊化学修饰的miRNA 激动剂，适用于细胞实验、动物实验，即用型；micr OFF™ miRNA antagomir是特殊化学修饰的miRNA 拮抗剂，适用于细胞实验、动物实验，即用型。
运输保存产品以冻干粉的形式，常温运输。
收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。
使用前瞬时离心，用RNase-free HO或灭菌ddH2O，配制成20μM储存液，分装保存，避免反复冻融（不超过5次）。
2表1 20μM储存液的配置参考0.25 0.5 1 2 5 20溶解体积(μl) 12.5 25 50 100 250 1000 注：如需进行高内涵筛选试验，可选择miRNA Library。
使用前须知为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。
实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。
细胞实验方法：为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议：1）转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔；2）接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，且细胞在各孔的表面平均分布。
1. 转染浓度miRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。
锐博生物推荐的miRNA mimic初始浓度为50nM，miRNA inhibitor浓度为100nM，客户可根据实验具体情况优化转染浓度，优化的范围建议为10~200nM。
注：miRNA inhibitor往往需要用到较大的用量才能观察到较好的抑制效果，相当于miRNA mimic的几倍用量，这可能与miRNA inhibitor竞争性抑制的作用机制及作用效率有关。
Agilent Real-time qPCR 检测 操作手册说明书
Real-time qPCR 检测操作手册1/ 6一、实验概述Real-time Quantitative PCR Detecting System ，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR 。
是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR 从定性到定量的飞跃。
二、实验流程三、实验材料： 1.主要试剂试剂名称 试剂来源 Cat.No. Trizol 上海普飞 3101-100 M-MLV promega M1705 dNTPs promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Bulge-LoopTM miRNA广州锐博 详见实验报告 qPCR Primer Set Rnase Inhibitor promega N2115 Primer(R&F) 上海生工 详见实验报告 SYBR Master MixtureTAKARADRR041B2/ 6样本收集Trizol 法抽取RNARNA 反转录获取cDNAReal-time qPCR2.主要器材器材名称来源Cat.NoNanodrop 分光光度计Thermo 2000/2000C稳压电泳仪上海天能EPS-600超细匀浆机FLUKO公司F6/10Real time PCR 仪器Agilent公司MX3000p反转录耗材Axygen四、实验步骤：1.总RNA 抽提（1）收取样品，Trizol 裂解。
细胞样品：收集细胞（6 孔板 80%细胞密度），2000 rpm 离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置 5 min，然后转移至新的 1.5 mL EP 管中；组织样品：将待研磨的组织样品从液氮或者-80℃冰箱中取出，无菌刀片于干冰上将组织样品切割成约 3 mm×3 mm×3 mm 大小，置于装有 1 mL Trizol 裂解液的 1.5mL EP 管中。
血清microrna检测方法
血清microrna 检测方法以BIOG 试剂盒为例，进行介绍产品特点 试剂盒组成 组分 50次 100次 吸附柱和收集管各50个 各100个 溶液E 6mL 12mL 溶液Q 42mL 84mL 裂解液 12 mL 24 mL 析出液 4.5 mL 9 mL 洗涤液 9 mL 18 mL 洗脱液 3mL 6 mL 消化液 1.2 mL 2.4 mL RNA Carrier 0.24 mL 0.48 mL 说明书1份1份操作步骤1. 请自行准备：无水乙醇、1.5mL 离心管、2.0mL 离心管。
2. 取出析出液和洗涤液，按以下操作：a) 析出液：4.5mL 加入25.5mL 无水乙醇；9mL 加入51mL 无水乙醇。
b) 洗涤液：9mL 加入21mL 无水乙醇；18mL 加入42mL 无水乙醇。
c) 配制好的析出液及洗涤液如出现沉淀，可在37℃溶解，摇匀后使用。
3. 取2.0mL 离心管1支，依次加入1mL 血清/血浆样本、100μL 溶液E 、700μL 溶液Q ，上下颠倒混匀，室温/4℃静置20分钟。
4. 12,000 rpm 4℃离心5分钟，弃上清，收集离心管内沉淀。
5. 向沉淀中依次加入200μL 裂解液、4μL RNA Carrier 、及20μL 消化液，漩涡震荡至沉淀完全分散，56℃水浴10 分钟。
6. 加入500μL 析出液，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响RNA 的提取与后续实验。
7. 将吸附柱放入收集管内，将上述溶液转入吸附柱内，静置2 min ，12,000 rpm 4℃离心1 min ，弃收集管内废液。
8. 将吸附柱放回收集管内，加500μL 洗涤液至吸附柱内，12,000 rpm 4℃离心1 min ，弃收集管内废液。
9. 将吸附柱放回收集管内，12,000 rpm 4℃离心2 min ，离去残留的洗涤液。
10. 取出吸附柱，放入新的1.5 mL 离心管内，加入30-50 μL 洗脱液，静置3 min ，12,000 rpm 4℃ 离心2 min ，收集RNA 溶液。
购买指南microRNA加RNAi
0.4 ml
的 Lipo2000，两种都是脂质体类的转 染试剂，转染效率高。但是 siPORT
细胞毒性低，细胞希望率低。
AM4502 siPORT™ Amine Transfection Agent 0.4 ml
多胺类转染试剂
二、 RNA 干扰实验： siRNA+阴性对照+阳性对照+转染试剂（前三缺一无法投诉） 现在主推 Silencer Selected 系列产品，所以对老产品 Silencer 列不做具体介绍，只列出新品的介绍，但对照 新老产品都介绍。
一、
microRNA 功能分析实验：
前体实验：前体分子+阳性对照+阴性对照+转染试剂（前三缺一无法投诉）
产品描述
货号
品名
规格
前体分子 AM17100
Pre-miR™ miRNA Precursor Molecule
5 nmol
阳性对照 AM17150
AM17110
阴性对照
AM17111 AM17120
0.4 ml
0.4 ml
老系列产品阳性 对照带标记，只 有老系列的对照 可以带标记，新 系列不能带标记
新系列阴性对 照，和新系列产 品使用浓度相同
新系列上动物阴 性对照
老系列产品阴性 对照带标记，只 有老系列的对照 可以带标记，新 系列不能带标记
阴性对照根据实 验任选其一，但 注意物种和是否
带标记
合并装为 5\nmol 阳性对照+2nmol 阴 性对照
起到的作用相同；AM17120 和 AM17121 的序列和 AM17110 是相同 的，但是分别带了 Cy3 和 FAM 的标
记。
脂质体类转染试剂，类似于 Invitrogen 的 Lipo2000，两种都是脂质体类的转 染试剂，转染效率高。但是 siPORT
miRNA动物实验技术手册
法
antagomir的miRNA动物实验中，大多数采用局部注射给药方式或尾静脉给药方式，给药周期需依据实验内容而定。
Nasal Sinuses Am. J. Respir. Crit. Med. 2011
Heart Circulation 2010
Breast Tumor J. Cancer 2013
进技术，成功开发出国际一流品质miRNA研究工具：micrONTM miRNA agomir和micrOFFTM miRNA antagomir。本产品采
用特殊化学修饰和末端标记技术，增加体内细胞的吸收作用，提高其抵抗RNA酶降解的能力；经高度脱盐处理，降低毒副
作用，使其在动物实验中操作简单，且发挥稳定和高效的作用。
2周
难以控制
转染试剂 需要 需要 不需要
不需要
不需要
人力成本 低 低 低
低
高
模型 细胞 细胞 细胞和动物
细胞和动物
细胞和动物
1
miRNA动物实验方法
动
物
实
验
经过几年的实践检验，锐博生物推出的micrONTM agomir和micrOFFTM antagomir被证明具有良好的动物实验效果，
方
已经应用于脑，鼻窦，骨，附睾，脾脏，肝脏，心脏等各种动物模型的miRNA动物实验。这些采用miRNA agomir和
：
骨
简介
中南大学第二湘雅医院的研究人员发现，miR-2861可通过转录后水平抑制HDAC5的表达而促进小鼠成骨细胞分 化。在BMP2诱导的骨形成模型中，miR-2861由ST2间质细胞表达，并促进BMP2诱导的成骨细胞生成，而抑制miR2861则可削弱这个作用。在正常小鼠及卵巢切除小鼠模型中，利用micrOFFTM antagomir-2861抑制miR-2861的表达， 可引起HDAC5的表达上调和RUNX2的表达下调，并抑制骨形成和减少骨质。人类的miR-2861是保守的，而在两例青少 年患者中发现，pre-miR-2861的突变型纯合子导致的miR-2861表达受阻会引起原发性骨质疏松症，且在这两位患者的 骨样品中，HDAC5和RUNX2的表达水平也有相应的上升或下降。
miRNA腺病毒操作手册-推荐下载
miRNA腺病毒操作手册miRNA简介MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。
MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。
MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。
MiRNAs 来源于具有60-80 个核苷酸茎环结构的microRNA 前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。
MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。
ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。
microRNA前体腺病毒简介重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。
腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。
首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。
第二，病毒滴度高。
第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。
第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。
ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。
E1 基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。
由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。
pMir-microRNA precursor 是基于microRNA 前体表达系统的质粒。
microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。
为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。
非编码RNA产品介绍
非编码RNA相关产品介绍miRNA相关产品MicroRNA (miRNA)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸, miRNA进化保守数量种类丰富，而且不被翻译成蛋白质，但具有调控基因表达的重要功能。
miRNA能特异地结合到信使RNA(mRNA)内的互补区域以促进其降解或抑制翻译，miRNA广泛参与细胞增殖、分化、凋亡及细胞周期调控等过程，在基因实验中起着关键作用。
miRNA的过表达和封闭miRNA的过表达可以使用miRNA的模拟物，或者将pri-mir构建至表达载体上。
构建miRNA的下调即封闭，主要的技术是sponges技术或者miRNA inhibitor (miRNA互补单链的模拟物)来实现。
sponges技术是通过将若干段连续miRNA成熟序列互补序列串联，使之在细胞内表达，吸附目标microRNA，达到下调miRNA的目的。
miRNA靶基因双荧光素酶检测服务荧光素（Luciferase）是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，其中最有代表性的是来自萤火虫体内(Firefly)和海肾(Renilla)体内的两类萤光素酶。
在荧光素酶的催化下，荧光素底物可以高效的转变成氧萤光素，同时发出强烈的光。
鉴于此，研究者利用荧光素酶开发出一套极其灵敏且使用方便的基因报告系统。
目前这一系统被广泛用于miRNA靶基因的验证、转录因子结合位点与启动子活性分析、RNA降解、信号转导、药物筛选、动物活体成像等领域。
技术特点Hanbio能为您提供强大的学术支持团队协助设计科学合理的实验方案、荧光素酶检测报告实验相关的载体构建过程及测序的原始报告、原始数据和数据的整理过程，完整的microRNA靶基因双荧光素酶检测报告以及报告质粒。
LncRNA相关产品长链非编码RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）是一类长度超过200nt的长链非编码RNA分子，是RNA聚合酶II转录的副产物，它可在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达，是遗传学的研究热点。
miRNA产品使用说明
网址： Tel: 400-686-0075
表4 动物实验antagomir用量参考
Reference
al.
miR-122
Nature. 2005
miR-192
Jan Krützfeldt , et al.
Nucleic Acids Research.
500µl (400µl+50µl+50µl)
500µl (400µl+50µl+50µl)
12-well
1mL (800µl+100µl+100µl)
1mL (800µl+100µl+100µl)
1mL (800µl+100µl+100µl)
1mL (800µl+100µl+100µl)
1mL (800µl+100µl+100µl)
miR-16
2007
Alessandra Care, et al. Nature Medicine. 2007
miR-133
Animals 6-week-old
mice
6-week-old mice
8-week-old mice
Laura Fontana, et al. PLoS ONE. 2008
miR-206
HeLa,
50 nM
N/A
MDA-231,MCF-7
R Luthra1, et al. Oncogene,2008
miR-196a
Breast cancer
40 nM
N/A
Hua Zhua, et al. Biochem Pharmacol. 2008
GenePharma microRNA过表达载体使用说明书
上海吉玛制药技术有限公司 地址：上海浦东张江高科技园区哈雷路1011号 电话： 传真：苏州吉玛基因股份有限公司 地址：苏州工业园区东平街199号 电话：传真：电 话 ： 苏 州 工 业 园 区 东 平 街 199 号电 话 ：GenePharma microRNA 过表达载体使用说明书GenePharma MicroRNA 载体简介GenePharma MicroRNA-neg-control 实验设计在使用载体法针对某一MicroRNA 进行过表达研究过程中，通常会遇到如下几个问题：实验对照组的确立、细胞转染条件的确定、基因表达效率的检测。
1、 实验对照组的确立在一个完善的MicroRNA 表达实验设计中，必须考虑设立正确合理的实验对照组。
通常，这些对照组包括载体阴性对照组、转染试剂对照组。
载体阴性对照可以有两种，一种是采用通用的阴性对照组，在本试剂盒中包括了该对照所需的载体（microRNA ），可以表达与目的基因序列无同源性的microRNA 片段；另一种是将目的microRNA 的序列打乱后重新组合所得的阴性对照（scrambled ）。
对照组的设立对于MicroRNA 表达研究是很有必要的，您可以利用载体对照来确认microRNA 实验中转染、RNA 提取和基因表达检测方法的可靠性。
本试剂盒中包括GenePharma MicroRNA-NC 过表达载体的对照，该载体在导入细胞中后，可以有效反应载体转染难易以及作为基因表达、RNA 提取、基因检测等系统参考。
2、 细胞转染条件的确定使用MicroRNA 载体转染细胞时，为了选择合适的转染方法和确定转染效率，通常采用报告基因来检测DNA 的导入情况。
最常用的报告基因是绿色荧光蛋白。
上海吉玛公司提供的MicroRNA 表达载体包含绿色荧光蛋白的表达框架，转入细胞后可以表达绿色荧光蛋白，用荧光显微镜或流式细胞仪可以很容易的确定转染效率。
3、 MicroRNA 表达的检测通常用两大类方法来检测MicroRNA 表达效率，一类方法是直接检测MicroRNA 的变化水平，常用的方法如northern 杂交、芯片（microarrays ）以及核糖核酸酶保护分析，但这些传统的方法都需要用到标记探针与纯化的RNA 进行杂交，由于成熟的miRNAs 及其前体共享一段共同的靶序列，而且目前的这些方法有无法通过大小将其分开，因此很难专一识别成熟的MicroRNA ，导致较高的背景信号。
inhibitorandmimics转染使用说明方法学
mmu-miR-125a-5p研究策略Standa rd 报价Standa rd 报价2ng 350 RMB 5ng 600 RMBmicrON™mmu-miR-125a-5pmimic2ng 300 RMB 5ng 500 RMBmicrOF F™mmu-miR-125a-5pinhibi tor,转染mmu-miR-125a-5p mimic(24孔板为例)1．联系锐博公司合成mmu-miR-125a-5p mimic和mmu-miR-125a-5pinhibi tor;2．合成的2ng mmu-miR-125a-5p mimic用1000u l RNase-free water配制成20u M的储存液,分装成5ul每管放-30或-80冻箱冻存(mimic的工作浓度为50nM);3．转染前一天，胰酶消化细胞并计数1X105 c-kit-，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中;4．对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释1.25ul mmu-miR-125a-5p mimic存储液;5．对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ无血清培养基稀释1μlLIPOFE CTAMI NE 2000试剂。
Lipofe ctami ne 2000稀释后室温5分钟（在30分钟内同稀释的R NA混合。
室温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipo fecta mine2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为L ipofe ctami ne 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合6．混合稀释的R NA（第4步）和稀释的Li pofec tamin e 2000（第5步）。
miRNA操作手册(2013版)
上海艾博思生物技术有限公司
IBS—全面生物技术解决方案
Shanghai Integrated Biotech Solutions Co., Ltd.
Hale Waihona Puke Ⅱ. 艾博思 miRNA oligos 产品特性
A. 哺乳动物 miRNA mimics(模拟物)和 inhibitors 抑制物设计
1.SiMi Transfection Reagents
z 低浓度条件下的 miRNA 转染，最大程度避免脱靶效应 z 难转染细胞适用 z miRNA 模拟物和抑制剂的高效转染 z miRNA 高效转染 z 在含血清培养基中也能表现高转染效率 z 适用细胞广泛；即用型试剂，可在含有抗生素的完全培养基中转染，操作格外简单方便
蛋白分析
Western blot
报告系统分析
荧光素酶报告系统
大规模 miRNA 质粒
慢病毒
C. MiRNA 实验所需试剂
试剂种类
试剂用途
miRNA oligo
miRNA 模拟物上调 miRNA 丰度
miRNA 抑制剂下调 miRNA 的丰度
转染试剂
如脂质体法，电穿孔法等
实验对照
miRNA 模拟物阴性对照
于一个 21 bp 的 miRNA oligo，有如下简单关系：1 OD duplex＝3.0 nmols＝40 ug 3. 1 OD 的 miRNA 欲溶解为 20 uM 的样品，可用 150 uL DEPC H2O 去重悬 1 OD 的 miRNA，溶解后为 20 uM 的样品。 4. 由于 Oligo RNA 呈很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以打开管 子前先离心，然后再慢慢打开管盖，溶解时请加足量 DEPC 水后盖上管盖， 振荡溶解 5. 荧光标记的 RNA，如 FAM、HEX、TAMRA 等标记的 Oligo 因为对光敏感， 必须避光保存。 miRNA inhibitors 抑制物 1. miRNA inhibitors(抑制物)的一般的平均分子量 6,660。 2. miRNA oligo 的 OD、nmol 和质量间有相应的公式可以计算；一般情况下，对 于一个 21 bp 的 miRNA oligo，有如下简单关系：1 OD duplex＝5.0 nmols＝33 ug 3. 1 OD 的 miRNA 抑制物欲溶解为 20 uM 的样品，可用 250 uL DEPC H2O 去重 悬 1 OD 的 miRNA，溶解后为 20 uM 的样品。 4. 由于 Oligo RNA 呈很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以打开管 子前先离心，然后再慢慢打开管盖，溶解时请加足量 DEPC 水后盖上管盖， 振荡溶解 5. 荧光标记的 RNA，如 FAM、HEX、TAMRA 等标记的 Oligo 因为对光敏感， 必须避光保存。
RNase Inhibitor （RNA酶抑制剂） 说明书
RNase Inhibitor （RNA 酶抑制剂）储存条件：-20℃保存产品内容RNase Inhibitor 产品编号C10201A 包装规格 50 µl (40 U/µl)■ 产品概述：本产品是通过基因重组技术克隆表达的猪源 RNase Inhibitor 。
其能有效地抑制真核生物中RNaseA 、RNaseB 和RNaseC 的活性，但不会抑制RNase H 、S1核酸酶、T7、SP6及T3 RNA 聚合酶、M-MLV 及AMV 反转录酶和DNA 聚合酶等的活性。
因此广泛地应用于cDNA 的合成、体外转录及翻译等需要预防潜在RNase 污染的实验中。
■ 来源：大肠杆菌重组表达纯化。
■ 活性单位：抑制5 ng RNase A 活性的50%所需的酶量定义为1个活性单位（U ）。
■ 纯度（品质检测）：以考马斯染色SDS －PAGE 胶检测纯度大于95%，经鉴定无核酸酶污染。
■ 产品特点：1. 有效抑制真核生物中RNase A 、RNase B 和RNase C 的活性。
2. 能在高至50℃的条件下抑制RNase 的活性。
3. 缓冲体系要有DTT 的存在，活性pH 范围广。
4. 能快速、有效地保护RNA ，不影响RNA 转录、反转录及其蛋白翻译过程。
5. 40 U 的RNase Inhibitor 能有效抑制高达80 ng 的RNase A 的活性。
■ 产品应用：主要应用于cDNA 合成、体外转录、体外表达、mRNA 的分离纯化等有潜在RNase 污染的实验中。
■ 储存缓冲液：20mM HEPES-KOH （pH7.6 @ 25℃）、50mM KCl 、8mM DTT 、50% Glycerol 。
GeneCopoeia Inc. 19520 Amaranth Drive Germantown, Maryland 20874USA Tel: 301-515-6982; 1-866-360-9531Fax: 301-515-6983Web: GeneCopoeia TMExpressway to Discovery图例：40U RNase Inhibitor 能有效地抑制RNase A 多至80ng 。
microRNA快速提取试剂盒使用手册
1、组织处理：将组织于液氮内研磨，每50-100mg加1mL裂解液MRL后匀浆，组织样品容积不能超过MRL的10%；2、将匀浆剧烈混匀，在15-30℃条件下孵育5min，是核蛋白体完全分解；3、可选步骤：4℃的条件下12000rpm离心10min，小心取上清转入一个新的RNase free的离心管中。
4、每1ML加0.2ml氯仿。
剧烈震荡15s，并将其在室温下孵育3min；5、于4℃12000rpm离心10分钟，样品会分3层，上层为水相，RNA存在于水相中，水相层的容量大约为锁甲MRL体积的60%，把水相转移到新管仲，进行下一步操作；6、加入0.6倍体积70%乙醇，混匀，转移至RA中；7、（10000rpm离心45秒，收集下滤液，准确估计下滤液的体积，加入2/3倍体积的无水乙醇，混匀，将混合液倒入RB中，每次最多700ul,10000rpm离心30秒弃掉废液。
）滤出小RNA.8、加入700ul漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液（下液）；9、加入500ul漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液（下液）；10、空液离心2min，1200rpm；11、取出吸附柱RB，放入RNase free离心管中，根据预期RNA产量，在吸附膜中间部位加入60-80ul，RNase free water事先在65-70℃水浴加热，室温放置2min，12000rpm 离心1min，收集得到microRNA,保存于-20摄氏度或更低。
1、组织+裂解液每50-100mg加1mL 15-30℃条件下孵育5min2、每1ML加0.2ml氯仿剧烈震荡15s，并将其在室温下孵育3min 4℃12000rpm离心10分钟3、把水相转移到新管仲加入0.6倍体积70%乙醇，混匀，转移至RA中4、（10000rpm离心45秒，收集下滤液，准确估计下滤液的体积，加入2/3倍体积的无水乙醇，混匀，将混合液倒入RB中，每次最多700ul,10000rpm离心30秒弃掉废液。
miRNA 靶基因3’UTR 质粒载体使用说明
miRNA 靶基因3’UTR 质粒载体使用说明RN ：R10032.3产品简介miRNA 是一类具有调控功能的非编码小RNA ，主要通过与靶基因mRNA 3’UTR 完全或不完全互补配对而调控靶基因的表达。
pmiR-RB-Report ™载体是专门用来检测miRNA 作用的检测工具，将基因的3’UTR 区克隆至载体海肾荧光素酶基因(hRluc )下游位点，以海肾荧光素酶基因作为报告基因，以萤火虫荧光素酶基因(hLuc )作为内参基因，通过检测海肾荧光素酶活性的相对变化情况来鉴定miRNA 对该基因是否有调控作用。
载体图谱hRluc ：海肾荧光素酶基因，为报告基因； hLuc+：萤火虫荧光素酶基因，为内参基因； 3’UTR Region ：多克隆位点，基因3’UTR 连接位点； Amp r ：氨苄青霉素抗性，用于大肠杆菌筛选。
体积每管含量总含量pmiR-RB-Report™ Species-GeneName~100 ng/μl~50μl ~5μg ~10μg注：质粒可以直接用来实验，甘油菌可以进行质粒扩大提取。
运输保存产品一般以液体的形式常温运输。
收到产品后，请将载体及甘油菌于-20℃以下保存。
质粒可以直接用于实验，甘油菌可直接进行质粒扩大提取。
实验方法图2 pmiR-RB-Report TM 质粒载体使用方法图1 pmiR-RB-Report TM 载体图谱简图细胞转染为了降低由于细胞密度、转染效率、试剂用量等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议：a.转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔；b.接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。
1. 细胞类型与转染试剂：由于实验需要同时转染小分子RNA和质粒载体两种物质，因此，细胞类型、细胞状态和转染试剂是决定实验成败的关键因素，建议选择转染效率较高的细胞系进行实验，如293T，Hela，A549，而转染效率较低的细胞系不适合进行本实验的检测。
血清血浆microRNA提取试剂盒操作方法及步骤说明书
杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://Serum/Plasma microRNA Kit血清/血浆microRNA快速提取试剂盒目录号：RN46适用范围：适用于从动物及人体血浆和血清中纯化包括miRNA的无细胞总RNA。
试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存50次(RN4601)Lysis buffer 4°C避光50 mlWash Solution 1 室温12 ml第一次使用前加入28ml无水乙醇Wash Solution 2/3 室温10 ml第一次使用前加入42ml无水乙醇RNase-free H2O 室温10 mlRNase-free吸附柱RA和收集管室温50套本试剂盒在室温储存6个月不影响使用效果。
储存事项：1.所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
2.不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。
3.Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用就可以。
4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：近年来对RNA干扰和调节性小RNA的广泛研究迫切需要一种能有效提取15-30核苷酸左右大小RNA（包括siRNA和miRNA）的试剂盒。
但是传统的RNA提取方法如硅胶膜不能有效吸附回收，酚/胍抽提和异丙醇或者乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA，对于血清血浆样本更是由于其自身特点更难提取。
本试剂盒采用独特的裂解液迅速直接裂解血清血浆RNA酶，强烈有机抽提去除蛋白和DNA，RNA包括微小分子RNA在高浓度乙醇下吸附于离心柱内特殊硅基质膜，再通过一系列特殊漂洗液快速的漂洗－离心的步骤，漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质进一步去除，最后低盐的洗脱液将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
miRNA产品使用说明
N/A
N/A
carcinoma-derived
*: 部分文献报道antagomir不用转染试剂
Antagomir* N/A N/A N/A N/A N/A 50nM
20~50 nM N/A 100nM
10~30nM 1µM
50~250nM 100nM 100 µM
广州市锐博生物科技有限公司 E-mail: support@
100µl (50µl+25µl+25µl)
100µl (50µl+25µl+25µl)
100µl (50µl+25µl+25µl)
100µl (50µl+25µl+25µl)
24-well
500µl (400µl+50µl+50µl)
*
500µl (400µl+50µl+50µl)
500µl (400µl+50µl+50µl)
100nM
N/A
Alla Musiyenko , et al. J Mol Med. 2008
miR-126,miR-126*
LNCaP
10~30nM
N/A
Jia Yu, et al.PNAS, 2008
miR-184, miR-205
HeLa, HEKs
10nM
N/A
Federica Felicetti , et al. Cancer Research, 2008
表 1 20µM 存储液的溶解体积
miRNA(nmol)
0.25
0.5
1
2
5
20
溶解体积(µl)
12.5
miRNA及其inhibitor转染方法
m i R N A及其i n h i b i t o r转染方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1miRNA及其inhibitor转染方法1 对mimics、mimics control、inhibitor、inhibitor control进行稀释和分装（终浓度为100 nmol/μl）。
（1）Mimics加入250 μl DEPC处理的水；（2）Mimics control加入125 μl DEPC处理的水；（3）inhibitor加入250 μl DEPC处理的水；（4）inhibitor control加入125 μl DEPC处理的水；对以上进行分装：mimics 20 μl每管，mimics control 10 μl每管，inhibitor 20 μl每管，inhibitor control 10 μl每管。
分装后于－80 ℃保存。
2经过调整，细胞状态较好。
晚上铺细胞，4个60 mm培养皿，每皿×105细胞。
做好标记，（1）为mimics（2）为mimics control（3）为inhibitor（4）为inhibitor control。
3 上午八点对昨天晚上的细胞进行转染。
（1）a 用500 μl opti-MEM稀释20 μl mimics，作用5 minb 用500 μl opti-MEM稀释20 μl mimics control，作用5 minc 用500 μl opti-MEM稀释20 μl inhibitor，作用5 mind 用500 μl opti-MEM稀释20 μl inhibitor control，作用5 min（2）a 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 minb用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 minc 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 mind 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 min（3）分别将（1）、（2）对应的a、b、c、d混合，轻轻吹打均匀后室温作用20 min。
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MicroRNA Inhibitor产品使用手册
规格:5nmol*2(对照为2.5nmol*4)
纯化方式:HPLC 纯化
产品形式：干粉
贮存条件：在-20℃或者-80℃
保存期：1 年，在-20℃或者-80℃
质量控制：PAGE 检测确定产品是准确分子量大小的单链的MicroRNA Inhibitor HPLC 纯化并分析单链的MicroRNA Inhibitor 纯度>95%
●注意事项
RNA inhibitors 在操作过程，如果有外源的核酸酶存在，RNA inhibitors容易发生降解。
在进行相关试验中，请带手套进行操作，尽量用无RNAase污染的试剂，试管，移液枪和枪头。
收到产品后尽快贮存在–20°C 或–80°C环境中。
●MicroRNA Inhibitor的重悬
在最大转速为4,000 X g 的低速条件下离心EP 管，让MicroRNA Inhibitor 聚集在试管的底部。
1.轻轻的打开管盖.
2. 5nmol加入DEPC水250 ul,配成20uM的储备液
3.柔和的用移液枪吹打储备液5 次
4.根据具体用量情况分装，避免多次冻融
5.在重新贮存的时候注意密封好EP 管
6.贮存在-80°C，以备使用
●转染程序
转染效率对不同的细胞株和不同的转染试剂是不同的。
我们建议miRNA inhibitor 的终浓度为15-100nM最优化的转染浓度最终还是需要通过试验来确定。
我们发现典型的试验中最佳的浓度范围是15-100nM，但是优化的浓度范围我们设定在1-100nM 之间。
A：转染试剂的推荐量，根据您订购的试剂不同应做适当的调整
B：所显示的添加量是miRNA inhibitor 终浓度为30nM 的量。
由于最大miRNA inhibitor 活性的量在不同的细胞类型是有差异的，所以推荐您自行优化。
C 对细胞密度只是推荐值，不同的细胞株有一定的变化，主要看细胞的大小和生长的状况，
一般来说我们推荐细胞融合度在30-70％为佳。
转染优化
优化转染效率是使得miRNA inhibitor 活性最大化的的最关键的一个因素之一，对每种转染试剂而言，首先要确定一款最合适的转染试剂，主要看从以下几点着手处理：
转染试剂的量
MicroRNA inhibitor 的量
转染时的细胞密度
转染时候的操作顺序
细胞与转染试剂/siRNA 复合物的接触时间。