吞噬细胞吞噬功能的检测

吞噬细胞吞噬功能的检测
一、小吞噬细胞的吞噬作用
(一) 体内法
［材料］
(1)动物:豚鼠。

(2)菌种:金黄色葡萄球菌菌液。

(3)无菌注射器及针头、无菌肉汤、玻片、瑞氏染液。

[方法]
(１)第１天注射无菌肉汤10 ml 于豚鼠腹腔,隔24h同法注射肉汤5 ｍl。

2０mｉn 后,再注射金黄色葡萄球菌菌液Iml 于上述部位。

(2) 注射完毕,每隔20 mｉn 用注射器抽取腹腔液,并做推片,待其自千后,用瑞氏染色法染色,镜检时见金黄色葡萄球菌被小吞噬细胞吞入胞浆时为宜。

(3)瑞氏染色方法如下: 将瑞氏染液滴加数滴于涂片上。

加入等量的蒸馏水,轻轻混匀,染5 -10 min。

用蒸馏水(或自来水) 冲洗。

待干或轻轻用吸水纸将涂片吸干,油镜检查。

[结果］
染色后,可见小吞噬细胞的核及被吞噬的细菌呈深紫蓝色,而小吞噬细胞的胞浆为紫色。

(二) 体外法
[目的]
1.熟悉检测白细胞吞噬作用的原理与实验方法。

２、通过吞噬细胞的吞噬功能检测了解机体的非特异性免疫功能。

3.掌握显微镜、油浸镜的使用与保护方法。

[原理]
中性粒细胞具有在噬杀菌功能,当与颗粒物质(如金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌等)混合后,孵育一定时间,颗粒物质被中性粒细胞吞噬。

根据吞噬率与吞噬指数可反映该细胞的吞噬功能,但不能反映其杀伤功能。

[材料]
(1) 3.8% 枸橼酸钠。

(2)碘伏、无菌注射器及针头、吸管、试管、载玻片、温箱等。

(3)瑞氏染液
(4) 葡萄球菌悬液: 取白色葡萄球菌在琼脂斜面上生长24 h的培养物,用无菌生理盐水刮洗下菌苔,用PBS洗涤2次,最后用比浊法将菌液调整至5x107ml 悬液,10０℃加热15ｍiｎ,置4℃冰箱备用。

［方法]
(1) 自静脉采血0、2 m,放于含3.8% 枸橼酸钠０.２ｍl的小试管中,混匀,防止凝血(或由一人抽血１０ｍl抗凝,供全小班使用)。

(2) 取葡萄球菌悬液0、２ml,加于上述血液中混匀。

(３) ３7 C温箱孵育30ｍｉn,每１０mｉn取出振摇1次,再继续静置孵育,于３0mｉn 时取出。

(4)用毛细管从白细胞层(即沉淀红细胞的表层) 吸取白细胞1滴,滴在载玻片上,推成薄片,自然干燥。

注意: 推制厚薄适宜的血膜片,血膜应呈舌状,头、体、尾清晰可分; 推制好的血膜应在空气中晃动,以促进快干; 天气寒冷或潮湿时,应于37 Ｃ温箱中保温促干,以免细胞变形缩小。

(5) 瑞氏染液染色可用30s快速单一染色法: 将染液铺满血膜,30ｓ以后用自来水冲洗。

切勿先将染液倾去再冲洗,以免染液中的细小颗粒附着于玻片上使标本观察不清晰。

(6) 干燥后油镜检查,寻找白细胞,计数。

［注意]
应选择涂片的体尾交界处染色良好的区域进行计数,由血膜边缘向中央依次上、
下呈曲线运动,以免重复计数(图２-2)。

[结果］
染色正确时,可见细胞核及被吞噬的细菌染成紫色,而白细胞的细胞浆则染成红色。

计数200个中性粒细胞,记下吞噬细菌的细胞数,以及每个中性粒细胞吞入的细菌数,分别求出吞噬百分率以及吞噬指数。

其计算公式为:
200个中性粒细胞中吞噬细菌的细胞数
吞噬率(%)= ×100%
200
200个中性粒细胞吞噬细菌的总数
吞噬指数(%)=×100%
200
二、大吞噬细胞的吞噬作用
[材料］
(1)动物: 豚鼠。

(2)10%鸡红细胞悬液、２% 无菌可溶性淀粉溶液。

(３)无菌注射器及针头、玻片、瑞氏染液。

[方法]
(1) 注射２% 可溶性淀粉液10ｍ于豚鼠腹腔内。

(２) 次日重复腹腔注入２%可溶性淀粉溶液５ｍｌ,1h后再腹腔注人１0% 鸡红细胞悬液３ml。

(３) 鸡红细胞悬液注入后,每隔20mn用空注射器抽取豚鼠腹腔液至1h,并做推片,待其自干(或用甲醇固定了3min,水洗),用瑞氏染色法染色(其方法同前),镜检见鸡红细胞被大吞噬细胞吞噬入胞浆内为宜。

［思考题]
影响吞噬细胞吞噬的实验因素有哪些?。