表达载体
基因表达载体的主要构成原件及作用
表达载体是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等),使目的基因能够表达的载体。
表达载体的主要构成元件及作用为: (1)结构基因:即提取的目的基因核苷酸序列,负责编码目标蛋白。
(2)启动子:位于编码蛋白质结构基因前的一段特殊结构的DNA片段,是RNA聚合酶的识别部位和结合部位。
(3)终止子:位于编码蛋白质结构基因末端一段特殊结构的DNA片段,具有终止基因转录过程的作用。
(4)复制原点:能够自我复制保证目的基因在受体细胞中复制遗传和表达。
(5)遗传标记基因:检测受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
细菌的重组蛋白质表达系统
细菌的重组蛋白质表达系统蛋白质是构成生物体及细胞的重要组成部分，也是细胞功能的核心执行者。
为了研究和应用不同类型的蛋白质，科学家发展出了各种蛋白质表达系统。
其中，细菌的重组蛋白质表达系统是最常用的一种方法之一。
本文将详细介绍细菌重组蛋白质表达系统的原理、优势和应用。
一、原理细菌重组蛋白质表达系统利用细菌作为宿主来表达外源蛋白质。
这个系统主要包括以下几个重要组成部分：表达载体、宿主菌株、诱导系统和纯化方法。
1. 表达载体表达载体是指带有外源蛋白质编码序列的质粒。
这些质粒通常包括启动子、反义密码子和终止子等参与蛋白质表达的元件。
其中，启动子通过结合转录因子来启动蛋白质合成的过程。
反义密码子则能够增强蛋白质的长效稳定性，并促进其在细菌中的高效表达。
2. 宿主菌株宿主菌株在蛋白质表达系统中起到重要的作用，通常选择大肠杆菌作为宿主，主要因为大肠杆菌具有较高的生长速度、易于培养和常用的遗传工具。
此外，大肠杆菌本身产生的内切酶活性较低，有利于保护外源蛋白质的稳定性。
3. 诱导系统诱导系统是细菌重组蛋白质表达系统中的一个重要组成部分。
通常使用化学诱导或者温度诱导来启动表达载体中蛋白质编码序列的转录和翻译。
化学诱导通常通过添加一种诱导剂，如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），来激活载体中的启动子。
温度诱导则是通过改变培养温度来调节蛋白质表达。
4. 纯化方法纯化是细菌重组蛋白质表达系统中最关键的环节之一。
常用的纯化方法包括亲和纯化、碳水化合物基负载层析和凝胶过滤等。
这些方法能够根据蛋白质的特性和亲和性实现高效纯化。
二、优势与其他蛋白质表达系统相比，细菌重组蛋白质表达系统具有以下优势：1. 高效性细菌重组蛋白质表达系统是目前各种表达系统中最高效的一种方法之一。
通过优化表达条件和使用高效的诱导系统，可以实现高产量的蛋白质表达。
此外，细菌本身的生长速度也有助于高效表达。
2. 便捷性相比其他表达系统，细菌重组蛋白质表达系统的操作更为简便。
表达载体的五个基本元件
表达载体的五个基本元件
表达载体是一个完全有效的信息传输系统，它借助五个基本元件（表达者、调节者、受众、时间和地点）来传输和接收信息。
表达载
体的复合体帮助收发信息的正常流程。
首先，表达者一般是消息发布者，它可以是一个个体，也可以是
一个团体。
表达者用自己的力量，通过不同的载体、渠道、工具和设备，把消息发给受众。
其次，调节者负责表达载体中信息的筛选、过滤、加工和编辑，
以便确保消息的内容和形式是恰当的。
调节者的作用是保证信息的传
播和公正性。
第三，受众是该信息最终的目的地，是这种传播行为的接受者。
受众接收传播的信息，对消息的内容做出反应，这可以是肯定、否定，或者介于两者之间。
第四，时间是传播过程中的一个重要元素，涉及到发布消息的时
间和受众接收消息的时间。
时间是形成可控制的环境的重要因素，也
是信息传播的重要因素。
最后，地点决定了受众的接收范围和影响范围，这取决于传播的场所和目的地，以及消息传递的距离和范围。
这反过来又决定着接收者的地理位置，以有效地传播消息，它必须考虑到地点因素。
五个基本元件组成的表达载体可以有效地传播和接收信息，并进行双向交流活动，使一方用以表达思想与意见，另一方便于了解表达者的意思。
传播过程中，受众通过表达者的主观信息，结合表达载体的五个基本元件，理解和了解信息的内容。
由此可见，表达载体的作用是至关重要的。
基因治疗中的表达载体构建与优化方法
基因治疗中的表达载体构建与优化方法基因治疗是一种新兴的治疗方法，通过将修饰过的基因导入患者体内，以实现对疾病基因的修复或替代。
在基因治疗中，表达载体的构建和优化是关键的一步，它决定了基因在患者体内的表达效率和稳定性。
本文将介绍基因治疗中常用的表达载体构建与优化方法。
表达载体是将目标基因导入细胞内进行表达的工具。
常见的表达载体主要包括质粒和病毒载体。
质粒是一种双链DNA分子，它可以自主复制和表达携带的基因。
病毒载体是一种利用病毒基因表达机制的表达工具，常见的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和腱病毒等。
表达载体的选择应根据具体的治疗目标、基因大小和细胞类型等因素进行考虑。
表达载体的构建是基因治疗中的关键一步。
首先，需要将目标基因克隆到合适的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后利用限制性内切酶进行酶切，并将目标基因与表达载体连接。
常用的连接方法有限制性内切酶切和连接、PCR聚合、Ligase连接等。
连接完成后，需要进行质粒或病毒载体的复制，以获得足够多的表达载体。
表达载体的优化是为了提高基因在患者体内的表达效率和稳定性。
优化的方法有很多种，下面将介绍几种常见的方法。
首先，可以通过调整启动子和增强子的选择来提高基因表达效率。
启动子是调控基因转录的序列，它的选择可以影响基因的表达水平。
常用的启动子有CMV启动子、EF1α启动子和PGK启动子等。
增强子可以增加基因的表达水平，常用的增强子有CMV增强子、SV40增强子和EF1α增强子等。
通过合理选择启动子和增强子的组合，可以提高基因在细胞内的表达水平。
其次，可以通过改变表达载体的拓扑结构来提高基因表达效率。
常用的方法有线性化质粒和环形质粒之间的选择。
线性化质粒在导入细胞内后，可更容易与细胞内的转录因子结合，从而促进基因的表达。
环形质粒则具有更好的稳定性，在不进一步构建的情况下，可以长期保持在细胞内。
此外，还可以通过引入信号序列来优化基因的靶向表达。
信号序列是一段具有特定功能的氨基酸序列，能够促使基因产物在细胞中的定位和分泌。
表达载体的基本条件
表达载体的基本条件
表达载体是指用于传达信息的媒介，例如文字、语言、图像等。
它们必须具备一定的基本条件，才能有效地传递信息：
1. 准确性：表达载体所传递的信息必须准确无误，不能有歧义或误导。
2. 清晰度：表达载体的语言、文字、图像等应该清晰易懂，以便读者或听者能够理解。
3. 适当性：表达载体的形式和内容应该与受众的需求和背景相适应，以达到最佳传达效果。
4. 合适性：表达载体的形式和内容应该与信息的性质和目的相匹配，以达到最佳传达效果。
5. 有效性：表达载体应该能够引起读者或听者的兴趣，激发其思考和反应，以达到最佳传达效果。
以上是表达载体的基本条件，只有具备这些条件，才能达到有效的传达效果。
- 1 -。
表达载体的构建注意事项
表达载体的构建注意事项构建载体是一项重要的任务，它决定了信息传递的质量和效果。
在进行载体构建时，我们需要注意以下几点：1. 独特性：确保文章内容的独一性，避免内容重复出现。
这样可以让读者获得新鲜感，并更好地吸引他们的注意力。
2. 结构合理：为了增强阅读流畅性，我们需要合理安排文章的结构。
可以使用适当的标题来划分段落，使内容更加清晰明了。
3. 避免网络地址：在文章中不得插入任何网络地址，以确保文章的纯文本性质。
这样可以避免读者在阅读过程中被打断或分心。
4. 避免数学公式和计算公式：文章中不应包含数学公式或计算公式。
这些公式对于非专业读者来说可能会造成困扰，降低文章的可读性。
5. 避免使用图片链接：不得使用、插入任何形式的图片链接。
这样可以避免读者在阅读过程中需要打开链接或依赖图像来理解文章的内容。
6. 避免依赖图像的语句：避免使用依赖图像的语句，如“如图所示”等字眼。
这样可以避免读者对文章内容的误解或困惑。
7. 避免重复问题：不得在文章中反复提出同一个问题。
这样可以避免读者产生厌烦或对文章内容产生疑惑。
8. 简洁自然：文章应该尽量简洁自然，避免过多的自我介绍。
这样可以让读者更加专注于文章的主题和内容。
9. 流畅表达：文章应刻画明确，句式流畅，并使用丰富多样的词汇来表达。
这样可以增加文章的可读性和吸引力。
10. 中文描述：请尽可能使用准确的中文进行描述，避免使用拗口或错误的词汇和表达方式。
11. 准确无误：确保文章内容的准确无误，严肃认真。
避免使用歧义或误导的信息，以免给读者带来困惑或误解。
通过以上注意事项，我们可以以人类的视角来构建载体，使文章富有情感，并使读者感到仿佛是真人在叙述。
同时，我们也要确保文章的自然度和流畅度，避免让读者感觉像机器生成的内容。
这样可以提高文章的质量和吸引力，让读者更加愿意阅读和理解。
克隆载体与表达载体
分类
结构组成及表达兀件
特点或优点
备注
质 粒 表 达 载 体
原核表达载 体
1启动子、
2转录终止子（防止克隆的外源基因表达干
扰载体的稳定性）
（1）基因组大小；去除非必需区，建立 外源DNA片段的克隆或替换位点（2） 在DNA的非必需区插入选择标记：lacZ基因；基因cl失活（cl基因：溶源 过程控制基因）；Spi筛选（野生型人 噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性E.coli中的生长会受到限制的表型， 称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏 感）
YAC的构建有比在细菌中克隆的一些优点，因为某些真核 细胞的序列，特别是重复序列是难以甚至不可能在细菌中 繁殖的，酵母细胞却具有这样的能力
5
色
体
细菌人工染色体 载体
BAC
是基于大肠杆菌 的F质粒构建 的，高通量低拷 贝的质粒载体
每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标 记，一个来源于大肠杆菌F因子（致育因子） 的严谨型控制的复制子oriS（Shizuya et al.
主要使用EcoR I
ColEl
天然质粒，属松弛型多拷贝型
6.3 kb
大肠杆菌素（colicin） E1和对E1免疫的 基因（immE1）
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1 （ColE1-），但仍然 表现出对E1免疫型（皿1^1+）
pBR322
兀件来源①复制起点orip
酵母人工染 色体载体YAC细菌人工染 色体载体BAC
P1噬菌体人 工染色体载 体PAC
质粒载体总结
质 粒 载 体
类型
长度
选择标记
克隆位点
pSC101
构建表达载体的一般流程
构建表达载体的一般流程
构建表达载体的一般流程如下：
1. 选择合适的载体：根据需要表达的基因或蛋白质，选择一个合适的表达载体。
常用的载体有质粒、病毒、合成RNA等。
2. 插入目标基因：将需要表达的基因插入到载体的多克隆位点中。
可以通过PCR 扩增目标基因并使用限制性内切酶切割载体和基因，然后进行连接。
3. 连接启动子和终止子：为确保基因在宿主细胞中能够正常表达，需要在基因的上游添加启动子和在基因的下游添加终止子。
这些序列将调控基因的表达方式和水平。
4. 检验构建质量：通过限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法，验证所构建的载体和目标基因的正确性和完整性。
5. 转化宿主细胞：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
常用的转化方法有电穿孔、热激冲击和化学转化等。
6. 筛选和鉴定：通过特定的筛选方法或选择标记，在转化的宿主细胞中筛选和鉴定表达目标基因的阳性克隆。
7. 表达优化：根据需要，可以通过调节培养条件、添加诱导剂或使用特定的宿主菌株等方法，优化目标基因的表达水平和质量。
8. 收获表达产物：经过一段时间的培养后，收获表达的基因产物，如蛋白质，进行后续的纯化、鉴定和应用等。
需要注意的是，具体的构建流程和方法可能会因实验的目的和要求而有所不同。
在实施过程中，需要对不同步骤和条件进行优化和调整，以确保表达载体的构建和表达目标基因的成功。
构建表达载体的实验流程及其注意事项
质粒纯化：
1、PEG纯化
缺点：摇菌液几百毫升，耗时长，步骤繁多 优点：质粒纯度高（不含线状DNA）
浓度大
2、过柱法：
缺点：柱子吸附能力有限，浓度低，纯度差（甚至有RNA） 优点：省时省力
29
质粒的电泳
Marker是酶切片段； 质粒是环形的，还会形成超螺旋结构。
30
质粒验证
1、酶切验证
一般将质粒切成2-3个片段，片段大小是否相符？ 如：连接后酶切的载体片段、目标片段大小与连接前相同？
三、人工化学合成
最后的选择。公司会将合成片段连入克隆载体。需测序验证。
12
汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
13
基因工程所用的酶
限制性内切酶 从商品目录上得到有关信息
EcoR I
Pst I
GAATTC CTTAAG
CTGCAG GACGTC
验证每步产物，设置对照以检查每一反 应的效率，都是可取的良策。而要对上述问题应对自 如，又必须透彻理解每一步实验流程所涉 及的实验原理。
——第一版前言（p11）
《分子克隆实验指南》 第二版 ，1996，科学出版社
2
汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
质粒提取：碱裂解法
收获细菌：含有质粒的DH5α、TOP10等 LB可富集2-3次，Teriffic可2次。
溶液Ⅰ： Tris-HCl, EDTA, 葡萄糖 溶液Ⅱ： NaOH, SDS
冰上3-5min，时间过长会： 质粒断裂；羟基化影响酶切
溶液Ⅲ：乙酸钾，冰乙酸 迅速颠倒3次混匀后，置于冰上
表达载体构建
表达载体构建1. 背景介绍表达载体是在分子生物学领域中广泛使用的工具，用于将目标基因导入宿主细胞中并使其表达。
构建高效的表达载体对于基因功能研究和基因工程应用具有重要意义。
本文将介绍表达载体的构建方法及其在基因表达中的应用。
2. 表达载体的构建方法构建表达载体的一般步骤包括选择合适的载体骨架、选择适当的启动子和终止子、插入目标基因序列以及进行转染或转化等操作。
下面将详细介绍表达载体的构建方法。
2.1 选择合适的载体骨架常用的载体骨架包括质粒和病毒载体。
质粒是可以在细菌中复制的DNA分子，通常由起始位点、选择标记和多个限制酶切位点组成。
病毒载体包括腺病毒、慢病毒等，具有高效转染特性。
选择适合自己研究的载体骨架是表达载体构建的第一步。
2.2 选择适当的启动子和终止子启动子是基因表达的起始信号，终止子是基因表达的终止信号。
启动子的选择应根据目标基因的表达需求和宿主细胞的特性进行。
常用的启动子包括强启动子（如CMV启动子）、组织特异性启动子等。
终止子则可以选择常规的转录终止信号。
2.3 插入目标基因序列选择合适的酶切位点，在载体DNA上进行限制性内切酶切割，并将目标基因序列与载体连接。
连接的方法可以是经典的限制性酶切连接、PCR扩增连接、Ligase连接等。
连接完成后，应进行酶切鉴定和测序验证，确保目标基因序列插入准确。
2.4 进行转染或转化将构建好的表达载体导入宿主细胞中，实现基因表达。
转染方法包括化学转染、电穿孔转染、病毒介导转染等，转化方法包括细菌的电转化、植物的农杆菌介导转化等。
3. 表达载体的应用表达载体广泛应用于基因功能研究和基因工程应用，具有重要的实验意义和应用前景。
3.1 基因功能研究通过表达载体，可以实现外源基因的高效表达，进而研究基因的功能、调控机制等。
比如可以通过表达载体将目标基因在细胞中过度表达或进行基因敲除等，来研究该基因在细胞或生物体中的功能。
3.2 基因治疗表达载体在基因治疗中具有重要的应用价值。
基因表达载体的构建
02
转化后，目的基因需要在宿主 细胞中复制和表达，这一过程 需要适当的诱导剂和调控元件 。
03
表达产物可以是目的基因的蛋 白质产物，也可以是RNA产物 ，具体取决于目的基因的性质 和实验需求。
表达产物的检测
01 表达产物的检测可以通过免疫学方法、生物化学 方法、分子生物学方法等多种手段进行。
02 检测的目的包括确定目的基因是否成功表达、表 达产物的性质和含量等。
基因表达载体的构建
• 基因表达载体概述 • 基因表达载体构建流程 • 克隆基因的表达 • 基因表达载体的应用与展望
01
基因表达载体概述
基因表达载体的定义
基因表达载体是用于将目的基因导入 细胞并使其表达的载体，通常由质粒 或病毒等构成。
它能够将目的基因带到细胞内，并在 细胞内复制和扩增，从而使目的基因 在细胞内得到表达。
THANKS
感谢观看
01
宿主细胞应具备繁殖快速、容易培养、容易转染等 特性，以便于基因表达产物的生产。
02
宿主细胞应具备低免疫原性，以减少免疫反应对基 因表达产物的影响。
03
宿主细胞应具备对表达产物的加工和分泌能力，以 便于表达产物的纯化和收集。
转化与表达
01
转化是将目的基因导入宿主细 胞中的过程，常用的方法有电 穿孔法、显微注射法、脂质体 法等。
02
基因表达载体构建流程
选择克隆位点
确定目的基因的长度和结构
01
根据基因序列，选择合适的克隆位点，确保目的基因的完整性
和功能性。
考虑载体的大小和性质
02
根据实验需求，选择适合的载体，确保载体能够容纳目的基因
并具有所需的特性。
确定克隆位点的位置
重组蛋白的表达载体和表达方式
什么是重组蛋白？
重组蛋白（recombinant protein）是指应用重组 DNA 或重组 RNA 技术而获得的蛋白质。
重组蛋白工程先应用基因克隆或化学合成技术获得目的基因（gene of interest，GOI），连接到适合的表达载体，导入到特定的宿主细胞，利用宿主细胞的遗传系统，表达出有功能的蛋白质分子。
什么是表达载体？
表达载体（expression vector）是一种可以携带外源基因并在宿主细胞中进行表达的工具，它通常是一种质粒或病毒。
表达载体除了包含外源基因外，还需要包含一些必要的元件，如启动子、终止子、选择标记、筛选标记等。
重组蛋白的表达方式有哪些？
按重组蛋白的表达方式，表达载体大致可分为以下几种：
•单独表达：指目的基因单独编码一个蛋白质，在宿主细胞中以自由形式存在。
这种方式适用于大多数不需要翻译后修饰或结构域相互作用的蛋白质。
•融合表达：指目的基因与其他基因（如伴侣蛋白、纯化标签等）相连接，编码一个含有多个功能区域的融合蛋白，在宿主细胞中
以结合形式存在。
这种方式可以增加目的蛋白的溶解度、稳定性、纯化效率和活性检测等。
•分泌表达：指目的基因与一个信号肽基因相连接，编码一个含有信号肽的前体蛋白，在宿主细胞中经过分泌途径被运输到胞外或胞器内。
这种方式可以避免目的蛋白在胞质中形成包涵体或受到降解酶的作用，也可以实现一些翻译后修饰，如糖基化等。
生物中表达载体的名词解释
生物中表达载体的名词解释生物学领域中，表达载体是指用于转入目标细胞并表达外源基因的一类分子工具。
它们在基因工程和生物技术研究中起着重要的作用，被广泛应用于基因克隆、基因表达和蛋白质表达等领域。
本文将探讨表达载体的起源、结构和应用。
一、表达载体的起源表达载体的概念最早起源于20世纪70年代，当时科学家们迫切需要一种能够稳定传递外源基因并在细胞内进行表达的工具。
最早的表达载体采用的是基于质粒的系统。
质粒是一种环状DNA分子，通常存在于细菌细胞内，具有自主复制和稳定性。
质粒可以经过基因工程技术被改造成表达载体，使其能够载入外源基因并在细胞内进行表达。
随着技术的进步，科学家们还开发了其他类型的表达载体，如病毒载体、人工染色体等。
病毒载体利用病毒的感染能力将外源基因带入细胞，并利用细胞内的机制进行表达。
人工染色体则是一种人工合成的染色体，能够稳定携带大量外源基因。
二、表达载体的结构表达载体的结构包括：启动子、序列标记、选择标记和多个限制性酶切位点等。
1. 启动子：启动子是表达载体中的一个重要元件，用于调控外源基因的转录水平。
它通常与靶基因位点连接，使得靶基因能够被蛋白质转录和翻译。
常用的启动子包括嗜热菌的T7启动子、哺乳动物的CMV启动子等。
2. 序列标记：序列标记是用于辅助表达载体的构建和检验的重要元素。
常见的序列标记有引物序列、激素依赖性增殖元素、克隆位点等。
它们可以帮助科学家们进行基因克隆、DNA测序和表达定量分析等实验。
3. 选择标记：选择标记是表达载体中的另一个重要组成部分，用于筛选和鉴定携带外源基因的细胞。
常见的选择标记有抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
通过将选择标记与外源基因连在一起，可以较为方便地筛选出携带目标基因的细胞。
4. 限制性酶切位点：限制性酶切位点是表达载体中可控制外源DNA序列进入和退出的位置。
科学家们可以利用限制性酶切位点，通过酶切、连接和合成等操作将目标基因插入载体中，实现基因的转入和表达。
实验十五、、表达载体的构建
在实验过程中，我们对实验条件进行了优化，提高了实验 的效率和成功率，为今后的实验提供了有益的参考。
研究展望
拓展应用领域
未来可以将该表达载体应用于更多的基因治疗和基因功能研究领域， 为相关领域的发展提供有力支持。
改进表达载体
针对本次实验中存在的不足，可以对表达载体进行进一步的优化和 改进，提高其转染效率和稳定性，以适应更多不同类型细胞的需求。
控机制，为基因治疗和基因功能研究提供更加坚实的基础。
03
拓展应用范围
在未来的研究中，可以尝试将该表达载体应用于动物模型和临床试验中，
以验证其在不同生物体内的应用效果和安全性。
THANKS
感谢您的观看
表达载体通常由质粒或病毒DNA改造而来，它们能够将外源基因带入宿主细胞，并 在其中进行复制和表达。
通过构建不同的表达载体，科学家们可以实现基因的异源表达、高表达和定向进化 等目的，为生物制药、农业和工业生产等领域提供有力支持。
02
表达载体的基础知
识
表达载体的定义
表达载体是用于在宿主细胞中复制和 表达外源基因的运载体，它能够将目 的基因导入细胞并使其稳定遗传。
实验十五：表达载体 的构建
目录
CONTENTS
• 引言 • 表达载体的基础知识 • 实验材料与方法 • 实验结果与分析 • 结论与展望
01
引言
实验目的
了解表达载体在基因工程中的应 用。
学会设计并构建基因表达载体。
掌握表达载体构建的基本原理。
01
03 02
实验背景
表达载体构建是基因工程中的关键技术之一，它涉及到将目的基因插入到载体DNA 中，以便在宿主细胞中进行表达。
表达载体是基因工程中的重要工具， 它能够将外源基因在宿主细胞中进行 有效表达，产生所需的蛋白质或代谢 产物。
克隆载体表达载体(课件)PPT课件
组成型表达载体是将基因整合到宿主细胞的染色体上，使基因在任何生长条件下都能稳定表达。这种 表达载体适用于需要持续稳定表达的基因。
组织特异性表达载体
总结词
在特定的组织或器官中，表达载体才能 启动基因的表达。
VS
详细描述
组织特异性表达载体是将基因与特定的组 织或器官相关的调控序列结合，使基因只 在特定的组织或器官中表达。这种表达载 体适用于需要组织特异性表达的基因。
05
克隆载体和表达载体的未来发展
克隆载体和表达载体的新技术和新方法
基因编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对克隆载体和表达载体的精确修饰，提高基 因治疗的效率和安全性。
人工染色体技术
开发人工染色体技术，实现对大型基因组的克隆和表达，为遗传病研究和治疗提供新的 工具。
克隆载体和表达载体的新应用和新领域
04
克隆载体和表达载体的应用
克隆载体在基因工程中的应用
基因克隆
克隆载体可以将目的基因插入到质粒 或病毒载体中，实现基因的复制和扩 增，为基因工程提供大量目的基因。
基因保存
基因突变
通过将目的基因插入到克隆载体中， 进行定点突变或随机突变，研究基因 功能和蛋白质活性。
克隆载体可以保存和传递目的基因， 为基因工程提供长期稳定的基因来源。
01
02
03
基因治疗
利用克隆载体和表达载体， 开发新型基因治疗策略， 针对遗传性疾病、肿瘤等 进行有效治疗。
生物制药
通过克隆载体和表达载体， 实现高效、大规模的蛋白 质药物生产，推动生物制 药产业的发展。
农业育种
利用克隆载体和表达载体， 培育抗逆、抗病、高产的 农作物新品种，提高农业 生产效益。
第5章 表达载体
2）终止子：依赖于ρ 因子或不依赖于ρ 因子（遇茎环结构
而终止）。
3）核糖体结合位点(ribosome binding side, RBS)：
Shine-Dalgarno (SD)序列，ATG与RBS之间的距离很重要， 一般3-11bp。
2、表达形式 完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。 融合蛋白(fusion protein)：多个基因的编码区的串联体，
但构成一个整体的单一ORF，如果融合标签蛋白有利于蛋白 的定向、纯化，如果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达 了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶 连两个或多个相关基因的表达。
西南大学生物技术专业 基因工程
2
3、表达的控制
诱导表达系统：IPTG 防渗漏表达系统：lacIq PL启动子受cⅠ的调控，低温(30℃)下阻抑转录， 高温(40-45℃)下解除抑制。 二、利用T7噬菌体启动子的表达载体 pET系列，表达能力强，可控性好，只受T7噬 菌体RNA聚合酶识别，不受大肠杆菌RNA聚 合酶识别，可用IPTG诱导表达。
西南大学生物技术专业 基因工程
22
2 ） 植 物 Ac-Ds 转 座 子 双 因 子 插 入 突 变 ： 玉 米 Ac (activator) 因子是一个转座子，含有完整的转 座酶， Ds (dissociation) 是 Ac 缺失转座酶基因 的缺失体，但具两端的反向重复序列。
分别构建含Ac 和Ds 的质粒载体载体并分别转化植物， 转基因植株杂交 (Ac×Ds) 后代中会发生转座事件 而产生突变体。 利用Ac-Ds序列作探针或引物克隆目标基因。
西南大学生物技术专业 基因工程 6
3 、内含肽表达载体：如 NEB 公司的 Impact-Twin 系 统，将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽 (intein)中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白 酶消解、只需要调节pH值等条件就将标签蛋白切 除。 4 、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙， 可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠， 或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。 信号肽(signal peptide) 有碱性磷酸酶信号肽、蛋 白质 A 信号肽（如 Amersham 公司的 pEZZ18 系统）。
基因工程表达载体
第四节 表达载体
克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建 立DNA和cDNA，其上有复制子即可；
表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细 胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启 动子；
穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中 复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
腺病毒载体的应用：
基因治疗 表达真核基因 研制疫苗
二、病毒表达载体
(三)反转录病毒载体
反转录病毒RNA基因组的6个区域： 5’-LTR, psi序列，gag，pol，env， 3’-LTR
反转录病毒载体的优点： 具有很强的穿透细胞的能力 无严格的组织特异性 可长期存放，重排较少 可包装10kb外援基因
启动子 P lac P trp P tac P traA P lL P recA
第四节 表达载体
启动子
-35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA TAGACA TTGACA TTGATA
-10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT TAAT G T GATACT TATAAT
信号肽，可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。
一、质粒表达载体
(二)酵母表达载体 原核生物和真核生物存在翻译后修饰反应机制的差异，
真核基因在原核表达系统中难以获得有活性的蛋白。 酵母是真核表达的首选系统 酵母表达载体是一种穿梭表达载体：既能在大肠杆菌中
繁殖，又能在酵母中复制、表达和选择。
一、质粒表达载体
⑴ 载体能够独立复制，具有复制起点。 ⑵ 应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆
表达载体
一、大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体都是质粒载体。
作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求，即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中。
在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表达载体。
各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异。
1．表达融合蛋白的表达载体当蛋白质表达以后，有效的分离纯化或分泌就成为获得目标蛋白的关键因素。
通过以融合蛋白的形式表达，并利用载体编码的蛋白或多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。
用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽（Tag），常用的有谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferase, GST）、六聚组氨酸肽（polyHis-6）、蛋白质 A（protein A）和纤维素结合位点（cellulose binding domain）等。
1.1 表达 LacZ 融合蛋白的载体如 pEX1/2/3 载体（图 3-31），P R 受 cIts857 控制，宿主 M5219 含缺陷性原噬菌体，编码 cIts857 和 N 蛋白。
cIts857 强烈抑制基因转录。
N 基因可使 RNA polymerase 跨过基因内部潜在终止位点。
一般采用 42-45 ℃灭活 cIts857 阻遏物，此处采用40℃ 以减少热激蛋白的诱导并使细菌能继续生长。
因为温度转换不仅可诱导 PL/PR 启动子，也可诱导热激基因，而后者有些可编码蛋白酶。
1.2 表达 GST 融合蛋白的表达载体GST 表达载体在启动子tac 和多克隆位点之间加入了两个与分离纯化有关的编码序列，其一是谷胱甘肽转移酶基因，其二是凝血蛋白酶（Thrombin）切割位点的编码序列。
当外源基因插入到多克隆位点后，可表达出由三部分序列组成的融合蛋白。
GST 是来源于血吸虫的小分子酶（ 26kDa），在E.coli 易表达，在融合蛋白状态下保持酶学活性，对谷胱甘肽有很强的结合能力。
将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱时，融合蛋白将吸附在树脂内，其它细胞蛋白就被洗脱出来。
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表达载体
第一节 大肠杆菌表达载体 第二节 穿梭载体 第三节 整合载体
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表达载体构建的一般原则
1、阅读框架 要使目的基因得以表达，最重要的因素是外源目的 基因本身必须置于正确的阅读框架之中。
用人工接头可以调节阅读框架，选择适当的人工接
头，就可使外源基因处于正确的阅读框架中。
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2、启动子（关键因素）
E.Coli （CE6）
T7 启动子
目的基因
这种方式可以使本底转录 降到很低的水平，尤其适用于 表达对大肠杆菌宿主有毒性的 重组蛋白质。
T7 RNA 聚合酶
热诱导 PL 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
cI857
双质粒系统
ColE1 ori AmpR
一 个 质 粒 带 有 T7 RNA 聚合酶基因，另一个质粒带 有 T7 启动子和目的基因
措施： （1）除去衰减子 （2）插入抗转录终止序列 （3）强转录终止序列
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4、有效的翻译起始（关键因素） 原核：SD序列，能帮助从起始AUG处开始翻译。
真核：kozak（科扎克）序列，核糖体能够识别 mRNA上的这段序列，并把它作为翻译起始位点。
5、翻译终止密码选择 在原核生物中，翻译的终止由两个释放因子所控 制，RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA和UGA。 由于UAA为两个释放因子所识别，因此在基因工程 中，一般采用UAA作为终止码。
转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会 影响细胞的生长。 解决办法 在表达系统中低水平表达 T7 溶菌酶基因，能与T7 RNA 聚合酶结合抑制其转录的活性。通过共转化质粒 导入表达系统，它能明显降低本底转录。
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3、表达的控制
诱导表达系统：IPTG
防渗漏表达系统：lacIq，一种能产生过量的 LacI 阻 遏蛋白（阻遏转录过程）的 lacI 基因的突变体。
PL启动子受cⅠ基因（阻遏溶菌周期基因表达）产物 的抑制，在λ噬菌体溶原的大肠杆菌中表达。 cⅠ基因的温度敏感突变体cI857（ts）：低温(30℃)下 阻抑转录，高温(40-45℃)下解除抑制。 T7噬菌体启动子：较复杂
择性地应用上述原则，删除降低外源基因表达的 一些元件，插入提高外源基因表达的一些必需元 件。
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第一节 大肠杆菌表达载体
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA(美国食品药物管理局)批准为安全的基因工
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1、表达元件(expression elements)
1）启动子(promoter)：三类，即 lac启动子、trp启动子和它们的杂合启动子tac或 trc，都受IPTG诱导。 T7噬菌体启动子 λ噬菌体的PL启动子。 2）终止子：依赖于ρ 因子或不依赖于ρ 因子（遇茎环 结构而终止）。
3）核糖体结合位点(ribosome binding side, RBS)： 是mRNA上的特异性序列，核糖体可以识别并结合这 一序列来启动翻译过程。
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二、利用T7噬菌体启动子的表达载体
大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强 的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建 的表达系统称为 T7 表达系统。
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T7 表达系统
T7噬菌体基因1编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活 T7噬菌体启动子的转录。
T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大肠 杆菌 RNA 聚合酶快 5 倍左右。并可以转录某些不能被 大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。
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T7 表达系统转录调控的机理
T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。 化学诱导型 温度诱导型 双质粒系统
T7 RNA 聚合酶 T7 启动子 目的基因
？启动子
T7 RNA 聚合酶基因 16
化学诱导型
噬菌体 DE3 是 λ 噬菌体 的衍生株，一段含有 lacI 启 动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其中。
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2、表达形式
完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。 融合蛋白(fusion protein)：多个基因的编 码区的串联体，但构成一个整体的单一ORF， 如果融合标签蛋白有利于蛋白的定向、纯化，如 果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达了一个 多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可 以偶连两个或多个相关基因的表达。
有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞
中高效表达的关键步骤之一。
因此，选择强的启动子及其相关的调控序列
，是构建一个高效表达载体首先要考虑的问题。
3
3、转录的有效延伸和终止 外源基因的转录一旦被起始，接下来的问题是如何 保证mRNA有效地延伸、终止。 转录衰减和非特异性终止可诱发转录提前终止。
程受体生物
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大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能
缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统
内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
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一、大肠杆菌表达载体的结构
原核表达载体：适用于在原核细胞中表达 外源基因的载体。 均是质粒载体，首先必然满足克隆载体的 基本要求，然后增加表达元件。
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6、外源蛋白的稳定性
可采取以下措施避免克隆的蛋白被选择性降解：
（1）构建融合基因，产生融合蛋白，使外源蛋白不被 选择性降解 （2）构建成可分泌的蛋白：不是所有的外源蛋白都可 以通过基因操作成为可分泌蛋白。 （3）使外源蛋白在宿主细胞中以包涵体的形式表达
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总之，构建表达载体应根据表达体系的特性，选
E.Coli （DE3）
T7 启动子
目的基因
用噬菌体 DE3 的溶源菌作 为表达载体的宿主菌，调控方 式为化学诱导型，类似于 Lac 表达系统。
T7 RNA 聚合酶
IPTG 诱导 lac 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
温度诱导型
PL 启动子控制 T7 RNA 聚
合酶基因，通过热诱导方式激 发T7 噬菌体启动子的转录。
热诱导
T7 启动子
目的基因
T7 RNA 聚合酶
两个质粒的复制子和抗 性标记不能相同，调控方式 为控制 T7 RNA 聚合酶的启 动子调控类型
PL 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
cI857
p15ห้องสมุดไป่ตู้ ori
KanR
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T7 表达系统存在的问题
T7 表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达
系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底