表达载体

措施： （1）除去衰减子 （2）插入抗转录终止序列 （3）强转录终止序列
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4、有效的翻译起始（关键因素） 原核：SD序列，能帮助从起始AUG处开始翻译。
真核：kozak（科扎克）序列，核糖体能够识别 mRNA上的这段序列，并把它作为翻译起始位点。
5、翻译终止密码选择 在原核生物中，翻译的终止由两个释放因子所控 制，RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA和UGA。 由于UAA为两个释放因子所识别，因此在基因工程 中，一般采用UAA作为终止码。
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T7 表达系统转录调控的机理
T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。 化学诱导型 温度诱导型 双质粒系统
T7 RNA 聚合酶 T7 启动子 目的基因
？启动子
T7 RNA 聚合酶基因 16
化学诱导型
噬菌体 DE3 是 λ 噬菌体 的衍生株，一段含有 lacI 启 动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其中。
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6、外源蛋白的稳定性
可采取以下措施避免克隆的蛋白被选择性降解：
（1）构建融合基因，产生融合蛋白，使外源蛋白不被 选择性降解 （2）构建成可分泌的蛋白：不是所有的外源蛋白都可 以通过基因操作成为可分泌蛋白。 （3）使外源蛋白在宿主细胞中以包涵体的形式表达
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总之，构建表达载体应根据表达体系的特性，选
择性地应用上述原则，删除降低外源基因表达的 一些元件，插入提高外源基因表达的一些必需元 件。
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第一节 大肠杆菌表达载体
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA(美国食品药物管理局)批准为安全的基因工
第五章
表达载体
第一节 大肠杆菌表达载体 第二节 穿梭载体 第三节 整合载体
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表达载体构建的一般原则
1、阅读框架 要使目的基因得以表达，最重要的因素是外源目的 基因本身必须置于正确的阅读框架之中。
用人工接头可以调节阅读框架，选择适当的人工接
头，就可使外源基因处于正确的阅读框架中。
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2、启动子（关键因素）
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2、表达形式
完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。 融合蛋白(fusion protein)：多个基因的编 码区的串联体，但构成一个整体的单一ORF， 如果融合标签蛋白有利于蛋白的定向、纯化，如 果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达了一个 多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可 以偶连两个或多个相关基因的表达。
有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞
中高效表达的关键步骤之一。
因此，选择强的启动子及其相关的调控序列
，是构建一个高效表达载体首先要考虑的问题。
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3、转录的有效延伸和终止 外源基因的转录一旦被起始，接下来的问题是如何 保证mRNA有效地延伸、终止。 转录衰减和非特异性终止可诱发转录提前终止。
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3、表达的控制
诱导表达系统：IPTG
防渗漏表达系统：lacIq，一种能产生过量的 LacI 阻 遏蛋白（阻遏转录过程）的 lacI 基因的突变体。
PL启动子受cⅠ基因（阻遏溶菌周期基因表达）产物 的抑制，在λ噬菌体溶原的大肠杆菌中表达。 cⅠ基因的温度敏感突变体cI857（ts）：低温(30℃)下 阻抑转录，高温(40-45℃)下解除抑制。 T7噬菌体启动子：较复杂
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二、利用T7噬菌体启动子的表达载体
大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强 的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建 的表达系统称为 T7 表达系统。
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T7 表达系统
T7噬菌体基因1编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活 T7噬菌体启动子的转录。
T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大肠 杆菌 RNA 聚合酶快 5 倍左右。并可以转录某些不能被 大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。
பைடு நூலகம்
E.Coli （CE6）
T7 启动子
目的基因
这种方式可以使本底转录 降到很低的水平，尤其适用于 表达对大肠杆菌宿主有毒性的 重组蛋白质。
T7 RNA 聚合酶
热诱导 PL 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
cI857
双质粒系统
ColE1 ori AmpR
一 个 质 粒 带 有 T7 RNA 聚合酶基因，另一个质粒带 有 T7 启动子和目的基因
程受体生物
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大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能
缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统
内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
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一、大肠杆菌表达载体的结构
原核表达载体：适用于在原核细胞中表达 外源基因的载体。 均是质粒载体，首先必然满足克隆载体的 基本要求，然后增加表达元件。
热诱导
T7 启动子
目的基因
T7 RNA 聚合酶
两个质粒的复制子和抗 性标记不能相同，调控方式 为控制 T7 RNA 聚合酶的启 动子调控类型
PL 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
cI857
p15A ori
KanR
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T7 表达系统存在的问题
T7 表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达
系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底
转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会 影响细胞的生长。 解决办法 在表达系统中低水平表达 T7 溶菌酶基因，能与T7 RNA 聚合酶结合抑制其转录的活性。通过共转化质粒 导入表达系统，它能明显降低本底转录。
E.Coli （DE3）
T7 启动子
目的基因
用噬菌体 DE3 的溶源菌作 为表达载体的宿主菌，调控方 式为化学诱导型，类似于 Lac 表达系统。
T7 RNA 聚合酶
IPTG 诱导 lac 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
温度诱导型
PL 启动子控制 T7 RNA 聚
合酶基因，通过热诱导方式激 发T7 噬菌体启动子的转录。
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1、表达元件(expression elements)
1）启动子(promoter)：三类，即 lac启动子、trp启动子和它们的杂合启动子tac或 trc，都受IPTG诱导。 T7噬菌体启动子 λ噬菌体的PL启动子。 2）终止子：依赖于ρ 因子或不依赖于ρ 因子（遇茎环 结构而终止）。
3）核糖体结合位点(ribosome binding side, RBS)： 是mRNA上的特异性序列，核糖体可以识别并结合这 一序列来启动翻译过程。