生物技术制药青蒿素

生物技术制药PPT讲稿

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2011年23日国际医学大奖——美国拉斯克奖临床研究奖授予中国中医科学院终身研究员屠呦呦，以表彰她“发现了青蒿素——一种治疗疟疾的药物，在全球特别是发展中国家挽救了数百万人的生命”。

疟疾是经按蚊叮咬或输入带疟原虫者的血液而感染疟原虫所引起的虫媒传染病。寄生于人体的疟原虫共有四种，即间日疟原虫，三日疟原虫，恶性疟原虫和卵形疟原虫。在我国主要是间日疟原虫和恶性疟原虫。

青蒿素是从植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯药物。也是中国发现的第一个被国际公认的天然药物。青蒿素类药物毒性低、抗虐性强，被WTO批准为世界范围内治疗脑型疟疾和恶性疟疾的首选药物。

黄花蒿（Artemisia annua Linn）又叫黄蒿，是菊科蒿属的一年生草本植物，广泛分布在国内各省。为中国传统中草药。其有效成分—青蒿素在抗疟方面与传统的奎宁类抗疟药物具有不同的作用机理。“青蒿一握，水一升渍，绞取汁尽服之”。《肘后备急方》

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80年代以来，青蒿素的化学合成、生物合成及组织培养相继成功，但由于受率低、成本高而难以投入工业化生产，目前青蒿素来源主要是从青蒿中直接提取得到；或提取青蒿中含量较高的青蒿酸，然后半合成得到。然而青蒿素含量随产地不同差异极大。除中国重庆东部、福建、广西、海南部分地区外，世界绝大多数地区生产的青蒿中的青蒿素含量都很低，无利用价值。据国家有关部门调查，在全球范围内，只有中国重庆酉阳地区武睦山脉生长的青蒿素才具有工业提炼价值。

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MV A、MEP途径合成萜类MV A甲戊二羟酸FPP法尼基焦磷酸

紫穗槐-4-11-二烯合酶（ADS）该酶是将倍半萜通用前体FPP 引导至青蒿素生物合成下游途径的关键酶。

在青蒿或非青蒿植物中, 存在着多个能氧化紫穗槐-4, 11-二烯的酶2006年,美国和加拿大的两个实验室室先后从青蒿腺毛中克隆得到了紫穗槐-4, 11-二烯氧化酶基因CYP71A V1,在氨基酸序列上存在差异, 发现这两个蛋白都能将紫穗槐-4, 11-二烯连续催化形成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸, 是多功能酶。

CYP71A V1是一种P450氧化酶, 其不能单独发挥作用, 必须由电子配偶体的配合。

2006年, Keasling实验室在克隆得到CYP71A V1后, 从青蒿中将CYP71A V1的电子配偶体——细胞色素P450还原酶基因（CPR）也克隆了出来。

Dbr2在腺毛中表达最高, 特异性地作用于青蒿醛, 生成11R-二氢青蒿醛, 对青蒿酸、青蒿醇、artemisitene和arteannuin B均无活性。

09年科学家从青蒿中分离得到1个醛脱氢酶基因, 命名为Aldh1。该基因CDS长为1 497 bp, 编码498氨基酸, 分子质量是53.8 kD。ALDH1的N末端无信号肽, 也没有细胞器定位序列。ALDH1在腺毛中表达最高, 在花芽中表达适中, 在叶子中表达较低, 而在根中检测不到活性, 这种表达方式与CYP71A V1的很相似, 也与青蒿素在植物中的分布很相似。

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2003年，美国Keasling小组将青蒿ADS基因经密码子优化后导入大肠杆菌中表达，首次在细菌体内合成出青蒿素的第一个关键前体——紫穗槐-4,11-二烯

2006年，Keasling小组将ADS基因连同CYP71A V1和CPR基因同时导入酿酒酵母中表达，培育出世界上第一株生产青蒿酸的酵母工程菌，经代谢途径修饰与优化，其产率已达153 mg/L，加拿大的一支队伍于08年将新克隆的青蒿DBR2基因连同ADS，CYP71A V1和CPR 基因一同导入酿酒酵母，率先培育出合成双氢青蒿酸的酵母工程菌。

美国肯塔基大学将青蒿ADS基因及鸟类FPS基因导入烟草中表达，经叶绿体信号序列引导，ADS 和FPS 被转运至叶绿体，并合成紫穗槐-4,11-二烯。

第七张PPT

一：只导入青蒿素合成特异途径中的基因利用底盘细胞中固有的底物供应途径，达到制备青蒿素中间体的目的。

二：除了导入青蒿素合成特异途径中的基因外，还导入了底物供应途径的限速酶基因。三：除了导入青蒿素合成特异途径中的基因外，另外导入一条底物供应途径。

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增加FPP合成途径中酶基因的拷贝数, 能有效地增加底物的供应。

通过将甲羟戊酸生物合成相关操纵子的Lac启动子替换成强启动子araBAD后, 导致甲羟戊酸积累。

这种策略主要针对以植物为底盘细胞的合成生物学研究。植物中存在两条萜类生物合成途径, 细胞质中主要是MV A途径发挥作用, 而质体主要通过MEP途径供应前体, 在这两条途径的作用下, 在不同的区室形成了含量有差异的萜类前体池。当将不同的萜类生物合成途径导向不同的区室时, 由于前体供应的差异, 使得萜类产物的产量也有很大不同。导向质体的紫穗槐-4, 11-二烯代谢途径产生的紫穗槐-4, 11-二烯产量比导向细胞质中的紫穗槐-4, 11-二烯代谢途径产生的紫穗槐-4, 11-二烯产量高40 000倍。

当CYP71A V1的N末端跨膜序列被假丝酵母(Candida tropicalis) 的P450跨膜序列取代时, 或者用来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 的HMGR和HMGS两个基因元件取代工程菌中甲羟戊酸代谢模块中的HMGR和HMGS元件后, 该工程菌中紫穗槐-4,11-二烯产量也会显著上升。

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几个与FPP合成相关的基因的表达被正调控，而另外几个促使FPP转变成固醇的基因被负调控。同时为了保证宿主菌株的遗传稳定性，所有这些对宿主细胞进行的修饰都是通过染色体融合进行的。

首先，将一截短的水溶性酶3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶（tHMGR，固醇合成的限速酶）过表达。

利用一个启动子(PMET3)，通过对编码鲨稀合酶（固醇生物合成途径中FPP合成后第一步）的ERG9基因进行负调控。

在酵母染色体更远处在转进一个tHMGP拷贝可以将将其合成量再增加。