一种高效细胞永生化载体的构建及其功能分析_宋子仪
我发明了一种可以让人类永生的技术
我发明了一种可以让人类永生的技术在科技飞速发展的今天，人类对于生命的奥秘和长生不老的追求从未停止。
而我，经过无数个日夜的钻研与实验，竟然成功发明了一种可以让人类实现永生的技术！这项技术的诞生并非偶然，而是源于我对生命科学的热爱和对人类命运的深深关切。
多年来，我一直致力于研究细胞的再生和衰老机制，试图找到突破人类寿命极限的方法。
在研究过程中，我发现了细胞老化的关键因素——端粒体的缩短。
端粒体就像是细胞的“计时器”，随着细胞的分裂而逐渐缩短，当端粒体耗尽时，细胞就会停止分裂，进而导致机体的衰老和死亡。
基于这个发现，我开始尝试寻找一种能够延长端粒体的方法。
经过反复的实验和尝试，我终于找到了一种特殊的生物酶，它能够有效地修复和延长端粒体。
但这仅仅是第一步，要实现人类的永生，还需要解决许多其他的问题。
比如，如何确保这种生物酶在人体内能够稳定地发挥作用，而不会引起副作用？为了解决这个问题，我又进行了大量的动物实验和临床试验。
经过多年的努力，我成功地优化了生物酶的配方和给药方式，使其能够安全、有效地在人体内发挥作用。
此外，人类的永生还可能带来一系列的社会问题。
比如，人口的过度增长、资源的短缺、社会结构的变化等等。
为了解决这些问题，我在发明这项技术的同时，也提出了一系列相应的解决方案。
首先，对于人口增长的问题，我们可以通过严格的生育控制政策来平衡人口的数量。
只有当有人员自然死亡或者选择放弃永生时，才会开放新的生育名额。
其次，资源短缺的问题可以通过科技的进步来解决。
例如，开发更加高效的可再生能源，提高资源的利用效率，甚至探索外太空资源等等。
而对于社会结构的变化，我们需要重新构建教育、就业、养老等社会制度，以适应新的社会形态。
当我的发明公布于世时，引起了轩然大波。
有人对这项技术充满期待，认为这是人类的福音，将彻底改变人类的命运；而也有人对此表示担忧，害怕永生会带来不可预知的后果。
面对种种质疑和争议，我深知自己肩负着重大的责任。
一种高效细胞永生化载体的构建及其功能分析_宋子仪
基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项(No.2011ZX08006-005)和国家973计划项目(No.2012CB124705)收稿日期：2012-12-07接受日期：2013-01-21研究资源Resources一种高效细胞永生化载体的构建及其功能分析宋子仪杨浩高倩李岳峰史新娥庞卫军杨公社*西北农林科技大学动物科技学院，动物脂肪沉积与肌肉发育实验室，杨凌712100*通讯作者，gsyang999@摘要细胞永生化在基因功能验证、转基因动物制作、药物研发等领域发挥关键作用，然而由于细胞永生化难度大，所以到目前为止仅有少数种类的细胞被永生化。
为了解决这一技术问题，本研究拟通过构建人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase ，hTERT )的慢病毒表达载体来提高原代细胞永生化效率，从而最终建立细胞系。
本研究先用PCR 的方法从载体pBABE-neo-hTERT 上扩增获得hTERT 基因片段，然后将其连接到慢病毒骨架载体pLV-puro 上，最终获得目标载体pLV-puro-hTERT 。
为了验证这一载体的有效性，先将其包装成慢病毒颗粒，再对猪原代前体脂肪细胞进行侵染，然后用嘌呤霉素筛选获得阳性克隆，之后检测了阳性克隆的端粒酶的活性、细胞增殖和分化能力。
研究结果表明，与对照组相比，pLV-puro-hTERT 慢病毒侵染猪前体脂肪细胞，可使细胞端粒酶mRNA 的表达水平上调12倍，并极显著的促进了猪前体脂肪细胞的增殖，同时不影响猪前体脂肪细胞的分化。
本研究所构建的慢病毒表达载体能够有效的提高原代细胞的增殖能力，同时保持了原代细胞的生物学特性，这将为进一步永生化原代细胞提供便利。
关键词细胞永生化，hTERT ，慢病毒，猪前体脂肪细胞Construction and Functional Analysis of a Vector for CellImmortalization with High-efficiencySONG Zi-Yi YANG Hao GAO Qian LI Yue-Feng SHI Xin-E PANG Wei-Jun YANG Gong-She *Laboratory of Animal Fat Deposition and Muscle Development,College of Animal Science and Technology,Northwest A&F University,Yangling 712100,China*Corresponding author,gsyang999@Abstract Cell lines as a immortalized cell materials play an important role in exploring gene function,producing transgenic animals and discovering new drugs.However,because of difficulties in immortalizing primary cells,until now only a few types of cells were reported to be immortalized.In order to overcome this problem,we aimed to construct a recombination lentivirus expressing human telomerase reverse transcriptase to improve the efficiency of immortalization so as to establish cell lines.So,we cloned ORF of hTERT gene from the retrovirus vector of pBABE-neo-hTERT and inserted into pLV-puro vector to construct pLV-puro-hTERT .After that,lentivirus particals were successfully packaged and used to infect pig preadipocytes.Then,positive cell clones were selected by puromycin.Finally,we examined the expression of telomerase reverse transcriptase by Real-time PCR,and evaluated the ability of proliferation and differetiation by DAPI and OilOnline system:农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2013,21(8):984~992DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2013.08.012细胞作为机体生命活动的基本单位，是体外探究生物机体复杂表型分子调控机制不可替代的模型。
细胞永生化处理方法
细胞永生化处理方法细胞永生化处理方法，就是通过一系列手段让细胞在无限期间内不受自然死亡的限制而实现细胞“永生”的过程。
此技术的发展与生命科学领域研究的进步密切相关，对于人类医疗、生命科学等领域都有着重要的意义。
目前，细胞永生化的处理方法主要有以下几种。
第一种，各种DNA损伤修复系统的促进。
当细胞受到外界环境、化学物质、射线等因素影响时，其内部的DNA会出现不同程度的损伤。
而损伤的DNA长期叠加，并不能通过机体自身修复的方式，致使细胞失去自我修复能力，从而导致细胞死亡。
目前的细胞永生化处理方法就是通过促进各种DNA修复系统的运作，极大地提高了细胞修复损伤的速度和效率。
第二种，线粒体增值。
线粒体是细胞内的一个重要器官，其主要功能是提供细胞所需的能量。
而线粒体的功效则取决于其内部的氧化磷酸化过程，当这个过程出现问题时，线粒体的能量供给也会跟着减弱。
因此，通过增加细胞内线粒体的数量，可以从根本上改善细胞代谢的状况，进而实现细胞永生化的效果。
第三种，活性氧的消除。
在细胞永生化过程中，活性氧的生成是一个不可避免的过程。
随着时间的推移，这些活性氧会逐渐积累，最终导致细胞的死亡。
因此，消除细胞内的活性氧，可以有效防止其积累，从而保证细胞的生存。
第四种，细胞表面的改变。
在自然界中，很多细胞都需要经历繁殖、生长、发育等过程，而这些过程对于细胞表面的改变至关重要。
因此，通过维持细胞表面的稳定状态，可以提高细胞的自我修复能力，实现细胞永生化的效果。
在当前的生命科学领域中，细胞永生化处理方法已经开始得到广泛的应用。
通过这些技术的不断推进，我们相信，未来的这个领域会带来更多的创新和发展，为人类健康和生命科学的发展做出更大的贡献。
无病毒可回复性肝细胞永生化载体的构建和结构鉴定
无病毒可回复性肝细胞永生化载体的构建和结构鉴定李爱民;王亚东;王泽楠;张洁;罗晓蓓;燕群;白杨;林建华;刘思德【摘要】Objective To constructe a vector hTERT for virus-free hepalocyte reversible immortalization by optimized technique. Methods To get the vector hTERT for virus-free hepatocyte reversible immortalization, we obtained attB1-Kozak-eGFP/F2A/neo-attB2, attBl-Kozak-hTERT-attB2 and attB1-hTERT/E2A/ eGFP/F2A/neo-attB2 through PCR amplification, then we recovered the product through gel extraction, and then we constructed the vector PB-hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo through Gateway, a recombinant clone technology including BR reaction and LR reaction, and endonuclease digestion and conjunction. Results The insertion and correct orientation of the vector PB-hTERT/E2A/eGRVF2A/neo and PB-eGFP/F2A /neo was confirmed by PCR,restriction enzyme digestion, and gene sequencing. Conclusion A vector for virus-free hepatocyte reversible immortalization has been successfully constructed, which may be used to improve the clinical security of immortalization hepatocyte.%目的构建不携带病毒基因且可回复的肝细胞永生化载体,优化目前的肝细胞永生化方法.方法构建含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的无病毒可回复性肝细胞永生化载体,PCR扩增attB1-Kozak -hTERT(前端)-attB2和attB1 -hTERT(后端)/E2A/eGFP/F2A/neo-attB2,对相应大小条带切胶回收后,通过Gateway重组克隆技术BR反应和LR反应,以及酶切连接,构建最终目的载体PB -hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo.结果 PCR及酶切和测序鉴定均证实成功构建了肝细胞永生化载体PB-hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo,目的基因序列与GenBank报道一致.结论成功构建不携带病毒基因且可实现回复的肝细胞永生化载体,有望提高永生化肝细胞临床应用的安全性.【期刊名称】《现代消化及介入诊疗》【年(卷),期】2012(017)002【总页数】5页(P61-65)【关键词】生物人工肝;肝细胞永生化;人端粒酶逆转录酶;piggyBac转座子【作者】李爱民;王亚东;王泽楠;张洁;罗晓蓓;燕群;白杨;林建华;刘思德【作者单位】510515 南方医科大学南方医院消化内科;510515 南方医科大学南方医院消化内科;510515 南方医科大学南方医院消化内科;510515 南方医科大学南方医院消化内科;510515 南方医科大学南方医院消化内科;510515 南方医科大学南方医院消化内科;510515 南方医科大学南方医院消化内科;510515 南方医科大学南方医院肝胆外科;510515 南方医科大学南方医院消化内科【正文语种】中文我国终末期肝病患者约900万人，常规药物治疗死亡率高达80%~90%，因此肝衰竭的治疗是目前临床医生面临的一项重要课题。
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基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项(No.2011ZX08006-005)和国家973计划项目(No.2012CB124705)收稿日期：2012-12-07接受日期：2013-01-21研究资源Resources一种高效细胞永生化载体的构建及其功能分析宋子仪杨浩高倩李岳峰史新娥庞卫军杨公社*西北农林科技大学动物科技学院，动物脂肪沉积与肌肉发育实验室，杨凌712100*通讯作者，gsyang999@摘要细胞永生化在基因功能验证、转基因动物制作、药物研发等领域发挥关键作用，然而由于细胞永生化难度大，所以到目前为止仅有少数种类的细胞被永生化。
为了解决这一技术问题，本研究拟通过构建人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase ，hTERT )的慢病毒表达载体来提高原代细胞永生化效率，从而最终建立细胞系。
本研究先用PCR 的方法从载体pBABE-neo-hTERT 上扩增获得hTERT 基因片段，然后将其连接到慢病毒骨架载体pLV-puro 上，最终获得目标载体pLV-puro-hTERT 。
为了验证这一载体的有效性，先将其包装成慢病毒颗粒，再对猪原代前体脂肪细胞进行侵染，然后用嘌呤霉素筛选获得阳性克隆，之后检测了阳性克隆的端粒酶的活性、细胞增殖和分化能力。
研究结果表明，与对照组相比，pLV-puro-hTERT 慢病毒侵染猪前体脂肪细胞，可使细胞端粒酶mRNA 的表达水平上调12倍，并极显著的促进了猪前体脂肪细胞的增殖，同时不影响猪前体脂肪细胞的分化。
本研究所构建的慢病毒表达载体能够有效的提高原代细胞的增殖能力，同时保持了原代细胞的生物学特性，这将为进一步永生化原代细胞提供便利。
关键词细胞永生化，hTERT ，慢病毒，猪前体脂肪细胞Construction and Functional Analysis of a Vector for CellImmortalization with High-efficiencySONG Zi-Yi YANG Hao GAO Qian LI Yue-Feng SHI Xin-E PANG Wei-Jun YANG Gong-She *Laboratory of Animal Fat Deposition and Muscle Development,College of Animal Science and Technology,Northwest A&F University,Yangling 712100,China*Corresponding author,gsyang999@Abstract Cell lines as a immortalized cell materials play an important role in exploring gene function,producing transgenic animals and discovering new drugs.However,because of difficulties in immortalizing primary cells,until now only a few types of cells were reported to be immortalized.In order to overcome this problem,we aimed to construct a recombination lentivirus expressing human telomerase reverse transcriptase to improve the efficiency of immortalization so as to establish cell lines.So,we cloned ORF of hTERT gene from the retrovirus vector of pBABE-neo-hTERT and inserted into pLV-puro vector to construct pLV-puro-hTERT .After that,lentivirus particals were successfully packaged and used to infect pig preadipocytes.Then,positive cell clones were selected by puromycin.Finally,we examined the expression of telomerase reverse transcriptase by Real-time PCR,and evaluated the ability of proliferation and differetiation by DAPI and OilOnline system:农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2013,21(8):984~992DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2013.08.012细胞作为机体生命活动的基本单位，是体外探究生物机体复杂表型分子调控机制不可替代的模型。
目前生命科学或生物医学研究常涉及两类细胞，一种为原代细胞(primary cell)，另一种为永生化细胞(immortalized cell)或细胞系(cell line)。
原代细胞是指直接从机体取新鲜组织样，然后用组织块培养法或胰酶消化法获得的细胞。
这类细胞因能真实的模拟动物体的某些生物特性，因此备受科学家的亲眯。
然而，原代细胞却存在增殖缺陷，随着传代次数的增多便会出现衰老和凋亡(Hayflick L,2000)，因此在一定程度上限制了原代细胞在科学研究中的广泛应用。
为了解决这一问题，人们通过转染原癌基因或端粒酶逆转录酶等方式，获得了一批永生化细胞。
其中，转染端粒酶逆转录酶是永生化原代细胞的最有效的方式(Kwang M L et al.,2004)。
研究发现，原代细胞每分裂一次，端粒末端将减少50~200bp 碱基；因此随着细胞分裂次数的增加，端粒末端将不断的缩短，当端粒末端减少到一定程度时，其就丧失了维持染色体稳定的功能，导致细胞停止增殖并出现凋亡。
研究表明，端粒酶逆转录酶在细胞分裂的过程中发挥关键作用(Meyerson,1998)，其可催化端粒酶以自身的RNA 为模板，从端粒DNA 3'羟基末端延伸端粒，以补偿细胞分裂时染色体末端的缩短，从而维持了端粒的长度，避免了细胞因端粒耗尽而出现凋亡。
端粒酶逆转录酶基因在各物种间较为保守，因此目前国内外常用人的端粒酶逆转录酶基因(hTERT )来永生化原代细胞，目前已获得多个物种的永生化细胞系，如人骨骼肌细胞系(Wootton et al.,2003)、猪脐静脉内皮细胞系(Hong et al.,2007)、山羊乳腺上皮细胞系(He et al.,2009)和猪胰腺间充质干细胞系(Cao et al.,2011)等。
然而，目前大家普遍使用的hTERT 表达载体常为真核表达载体(pCI-neo-hTERT )或逆转录病毒载体(pBABE-neo-hTERT )，尽管有一些成功的先例，但对原代细胞来说，转染或侵染效率低，稳定表达的效率也低，所以在很大程度上限制了这一方法更广泛的应用。
为了解决这一技术难题，本研究选择侵染能力强并可稳定整合于宿主基因组的慢病毒表达载体作为骨架载体，成功构建了带嘌呤霉素抗性基因的hTERT 慢病毒表达载体，然后对其进行了包装，并在猪前体脂肪细胞中验证了这一载体的有效性，以期为永生化更多的原代细胞提供便利。
1结果1.1hTERT 慢病毒表达载体的构建与鉴定首先利用带Eco R Ⅰ酶切位点的引物从pBABE-neo-hTERT 质粒上扩增得到含hTERT 全长的基因片段，大小为3680bp(图1A)；之后将其与酶切线性化的慢病毒载体pLV-puro 定向连接，得到目标载体pLV-puro-hTERT 。
对目标载体进行Eco RⅠ酶切，以pBABE-neo-hTERT 和pLV-puro 为阴性对照，如图1B-3所示，琼脂糖凝胶电泳可见大小为8100和3565bp 2个片段，说明目标质粒初步构建成功。
接下来，利用载体的通用引物进行测序，测序结果进一步说明hTERT 片段与骨架载体pLV-puro 连接方向正确，片段完整，包含hTERT 基因的起始密码子和终止密码，并且没有碱基突变，可以进行后续的功能研究。
1.2hTERT 慢病毒载体的包装及对猪前体脂肪细胞的侵染由于目标载体pLV-puro-hTERT 不带荧光报告基因，所以较难准确把握慢病毒包装和侵染的效率。
为了便于观察，选用另外一个与pLV-puro-hTERT 载体骨架元件基本相同，但携带有GFP 报告基因的载体pLV-GFP 作为病毒包装和侵染的阳性对照。
pLV-GFP 在293T 细胞包装48h 后，在荧光显微镜下观察到细胞内GFP 大量表达(图2A;B),表red O staining.The results showed that porcine preadipocytes infected with pLV-puro-hTERT lentivirus displayed a 12-fold increase in telomerase mRNA level compared to control(P <0.01)with significant enhancement in cell proliferative activity,whilst no effects of lentivirus on porcine preadipocyte differentiation were observed.Taken together,these results indicate that the lentivirus vector can be used to promote primary cells proliferation,meanwhile it doesn't change primary cells'original biological characters,so it provides us a powerful tool to immortalize more primary cells in the future.Keywords Cell immortalization,Human telomerase reverse transcriptase(hTERT),Lentivirus,Pig preadipocytes一种高效细胞永生化载体的构建及其功能分析Construction and Functional Analysis of a Vector for Cell Immortalization with High-efficiency985农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology明慢病毒载体包装成功。