细胞永生化 PPT课件
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液洗涤淋巴细胞2次后，再用2ml RPMI 1640完全 培养基重悬，加入 1.3mlEBV悬液和 0.4ml环孢 霉素(0.2μg/μl) 充分混匀后等量移入2个10ml 培养瓶内 置于 37℃、5％CO2培养箱培养。7d左 右镜下观察,可见淋巴细胞明显增大,出现聚集现 象,并根据培养液pH值的改变情况,进行每周两次 半量换液;约2周后可见瓶底大量呈聚集生长的细 胞团,即可转瓶,转瓶后镜下可见胞质突出,形态 各异,聚集成团的细胞株;至6-8周后开始大量扩 增,当细胞数达到(4-6)×106/ml时，可收集大部 分细胞进行冻存。
• 其它病毒
• 一些病毒如乳头瘤病毒E6、 乙型 肝炎使一些特殊 细胞的增殖能力加强。人乳头瘤病 毒E6 蛋白是最常见的转化蛋白,通 过对端粒酶催化亚基( hT ERT )的 转录调控而激活端粒酶。
二、端粒酶
• 端粒酶是由RNA和蛋白质组成的复合体,为一种特殊的 DNA 聚合酶,合成DNA到染色体末端,因而被认为是一种依 赖自身RNA 的逆转录酶。在体外培养的正常体细胞中, 端 粒长度逐渐缩短,细胞克隆将面临增殖危机和死亡, 但这 种细胞的端粒酶一旦被激活, 将维持端粒缩短和延长的动 态平衡,从而使细胞获得无限增殖的能力, 使之永生或癌 变。病毒转化的各种人永生化细胞试验结果证明端粒酶活 化可能是细胞永生化的共同步骤,病毒的转化能使一些细 胞(如成纤维细胞、 胚肾细胞等) 越过M1 阻断, 但并不 能使细胞顺利的度过M2 期。在许多转化细胞和肿瘤细胞 中端粒长度近于临界值, 所以推测端粒酶活化可能是细胞 永生化过程中较晚的事件。
细胞永生化
杨星
什么是细胞永生化？
• 细胞永生化是指体外培养的细胞经过自 发的或受外界因素的影响从增殖衰老危 机中逃离, 从而具有无限增殖能力的过 程。
• 正常细胞的增殖能力有限,经过一定时间 的增殖后, 最终会进入一种生长抑制状 态, 而一些肿瘤细胞可以无限增殖。
Hay flick界限
• Hay flick界限：体外培养的细胞，不是不死的， 而是有一定寿命的，其增殖不是无限的，而是有 一定界限，这个界限称为Hay flick界限。
• 用完全RPMI-1640培养液(含10％FBS，含Pen／ Strep)将B95-8细胞调整到浓度为lxl06／ml，置 37℃、50％C02条件下孵育7—14天，于4℃，1800r ／min离心15分钟，收集上清，用0．221am的无菌滤 膜过滤，分装为lml／支，保存于-80℃ 。
• 建立永生化B淋巴母细胞系 • 常规分离淋巴细胞 :用无血清 RPMI 1640 培养
• Epstein-Barr病毒(EBV)是1964年首先从非洲恶性 Burkitt淋巴瘤(BL)的淋巴母细胞系中发现的，属 疱疹病毒科γ亚科。EBV有一个与其他DNA病毒不同 的特点，就是它在体外对B细胞的感染可刺激细胞 的持续性生长并引起细胞的永生化，从而形成淋巴 母细胞样细胞系(1ymphoblastoid cell lines， LCLs) ,尤其对人二倍体淋巴细胞转化效果极佳。 EBV主要通过结合人类B淋巴细胞膜上的EB病毒受体 而感染B淋巴细胞，初次受到感染便被迅速致敏， 36h后就可有DNA合成。被感染的B细胞在EB病毒核 抗原的刺激下转化为类淋巴母细胞，其端粒酶活性 提高，维护了细胞染色体端粒长度的稳定，并能够 不断分裂增殖，从而促使B淋巴细胞的永生性生长 。转化的细胞株染色体稳定，保留了原有的遗传性 状。人淋巴细胞转化是建立永生细胞系及进行细胞 遗传和分子遗传研究的极好方法。
四、 癌基因、 原癌基因
• 根据细胞凋亡与增殖的机理,有人用cmyc、 c-fos、 Ras 等原癌基因转染细 胞,使抑癌基因突变功能丧失, 从而使细 胞永生。 转染c-myc基因到人正常乳腺 上皮细胞, 可恢复端粒酶活性,并使p53 发生突变,进而促进细胞永生化。但也有 一些癌基因不仅不能转化细胞, 甚至促 进细胞的衰老,如Ras 癌基因、 Ab5 等 。
• 在体外培养的人正常细胞, 经一段时间的分裂, 就会进入一种生长抑制状态, 即衰老期( M1期)。 大多数真核生物细胞(生殖细胞、 干细胞除外)都 具有这种特性。 经转化了的细胞可越过衰老期而 进入另一增殖抑制状态,即危机期( M2期) ,危机 期的细胞开始出现退化, 并逐渐死亡。 只有少数 细胞在一定因素的影响下, 端粒酶被激活, 以自 身RNA 为模板合成端粒DNA 来补充或延长端粒,恢 复染色体的稳定性,从而使细胞越过危机期,发生 了永生化。
细胞永生化意义
• 了解细胞增殖与衰老的分子机制及保存 一些重要疑难病例的样本。
• 为治疗肿瘤、 控制肿瘤细胞的增殖以及 器官移植的研究奠定了坚实的基础。
• 由于永生化细胞具有可以多次传代的这 一特性, 我们可以利用各种细胞永生化 的方法使那些传代困难、 增殖慢、 易 衰老的细胞获得永生,从而为我们提供更 多的细胞资源。
EB 病毒转化人类外周血B-淋巴细 胞建立永生细胞系
• EB 病毒 (epstein2 barr virus) 转化外周血B 淋巴细胞(B-LC) , 使其成为一种能连续分裂永久 生存的类淋巴母细胞 ( lymphoblastoid) , 由此 建立的类淋巴母细胞株即为永生细胞株 ( immorta1ized cell lines) , 它可永远传代, 并 且每一种永生细胞株保存了原来提供血样个体的 完整基因组, 而且它的生化和分子生物学特性不 发生变化, 可作为生物标本库建立的首选方法。
促使细胞永生的基本方法
一、病毒转染 • EB 病毒 • EB 病毒( epstein-barr virus) 在体外能使
B 淋巴母细胞永生化形成淋巴母细胞样细胞系 , 它是通过潜伏蛋白激活细胞因子与其受体相 互作用的途径使细胞永生的。 • 目前, EB 病毒感染细胞使其永生应用最多的 是B 淋巴细胞,可以直接用与EB 病毒共培养的 方法,而在其他细胞中的应用很少。
• 研究细胞永生化最常用的方法就是通过构建含端 粒酶催化亚基( hT ERT ) 的表达载体, 通过各种 方法来转染细胞。
三、放射因素
• 通过X 射线、 电离辐射、 60Co等放射 性因素进行细胞永生化的方法, 可使细 胞周期得到延伸。可能是由于放射因素 破坏了细胞的衰老机制,或促进了与细胞 永生相关基因的表达。
• 利用EB病毒转化外周血B-淋巴细胞建立出生缺陷 永生细胞库, 或各种疾病, 特别是罕见疾病永生 细胞库已成为当今永久保存全基因组的首选方法, 它可为出生缺陷及其它罕见疾病的遗传流行病学 、临床遗传学、分子生物学等研究提供永久性试 验材料,
• EB病毒的特征之一是对B细胞有天然的亲和力并使 其发生转化,EBV引起的是一种无休止的细胞分裂 和 DNA 的无限的合成。
EB病毒的制备
• EB病毒基因组序列及其表达研究主要是用B95-8 株 进行的,B95-8 细胞系是用传染性单核细胞增多症患 者的EB 病毒感染绒猴B 淋巴细胞建立的。在B95-8 细胞系中只有很少一部分细胞可以自发产生病毒, 其他细胞呈隐性状态, 用不同的诱生剂如TPA诱生后 , 使产生病毒的细胞明显增加。B95-8在EB病毒转化 B-淋巴细胞过程中非常重要, 通过培养B95-8细胞制 备出大量高效价的EB病毒液, 对于B95-8细胞的培养 质量是EB病毒转化B-淋巴细胞成败的关键。
• 此外,EBV 在体外对B细胞的转化效率很高,一般都 能达到80%-100%。因为上述特点,世界上许多遗传 研究中心都用此方法作为常规处理每一份血标本 ,建立人类遗传种质库。
• 病毒转化后的B淋巴母细胞样细胞系(B-LCLs)依然 保存了B细胞的分化特征和免疫表型，作为抗原递 呈细胞，它可以摄取加工抗原，并将其载体部分 表达于细胞表面，供T细胞受体识别；也可作为抗 体基因的来源，将其与骨髓瘤细胞融合，制备分 泌相应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
• SV40 病毒
• SV40 是简单的真核细胞病毒, SV40 的T抗原片段是最常用的目的片段, 将其 整合入靶细胞核内并表达,可导致细胞增 殖活力的改变并表现出多种与肿瘤相关 的转化显型。
• 近年, 人们已成功获得多种 SV40转化的 永生细胞株,应用的方法包括:野生型SV 40病毒共培养感染靶细胞、 磷酸钙法、 电穿孔以及逆转录病毒载体法等。
细胞永生化的分子机制
• 目前认为,细胞永生化的模式如下:细胞经多次 分裂后 ,在肿瘤抑制因子 ,如p53、Rb 等作用 下,细胞进人衰老期(M1)期,此时细胞对生长因 子等失去反应 ,产生 DNA合成蛋白抑制因子 , 细胞周期检查点发送细胞周期停止信号,DNA合 成停止,细胞开始衰老 ,但不一定死亡。而病 毒、原癌基因、抑癌基因突变体则可以抑制M1 期机制,细胞绕过 M1期继续生长。细胞经过 20-30PDs后,进人危机期(M2期),细胞出现退化 ,分裂细胞逐渐减少 ,绝大多数细胞发生凋亡 ,只有罕见的细胞在一些因素影响下 ,可越过 M2期获得永生性转化。
• 其它病毒
• 一些病毒如乳头瘤病毒E6、 乙型 肝炎使一些特殊 细胞的增殖能力加强。人乳头瘤病 毒E6 蛋白是最常见的转化蛋白,通 过对端粒酶催化亚基( hT ERT )的 转录调控而激活端粒酶。
二、端粒酶
• 端粒酶是由RNA和蛋白质组成的复合体,为一种特殊的 DNA 聚合酶,合成DNA到染色体末端,因而被认为是一种依 赖自身RNA 的逆转录酶。在体外培养的正常体细胞中, 端 粒长度逐渐缩短,细胞克隆将面临增殖危机和死亡, 但这 种细胞的端粒酶一旦被激活, 将维持端粒缩短和延长的动 态平衡,从而使细胞获得无限增殖的能力, 使之永生或癌 变。病毒转化的各种人永生化细胞试验结果证明端粒酶活 化可能是细胞永生化的共同步骤,病毒的转化能使一些细 胞(如成纤维细胞、 胚肾细胞等) 越过M1 阻断, 但并不 能使细胞顺利的度过M2 期。在许多转化细胞和肿瘤细胞 中端粒长度近于临界值, 所以推测端粒酶活化可能是细胞 永生化过程中较晚的事件。
细胞永生化
杨星
什么是细胞永生化？
• 细胞永生化是指体外培养的细胞经过自 发的或受外界因素的影响从增殖衰老危 机中逃离, 从而具有无限增殖能力的过 程。
• 正常细胞的增殖能力有限,经过一定时间 的增殖后, 最终会进入一种生长抑制状 态, 而一些肿瘤细胞可以无限增殖。
Hay flick界限
• Hay flick界限：体外培养的细胞，不是不死的， 而是有一定寿命的，其增殖不是无限的，而是有 一定界限，这个界限称为Hay flick界限。
• 用完全RPMI-1640培养液(含10％FBS，含Pen／ Strep)将B95-8细胞调整到浓度为lxl06／ml，置 37℃、50％C02条件下孵育7—14天，于4℃，1800r ／min离心15分钟，收集上清，用0．221am的无菌滤 膜过滤，分装为lml／支，保存于-80℃ 。
• 建立永生化B淋巴母细胞系 • 常规分离淋巴细胞 :用无血清 RPMI 1640 培养
• Epstein-Barr病毒(EBV)是1964年首先从非洲恶性 Burkitt淋巴瘤(BL)的淋巴母细胞系中发现的，属 疱疹病毒科γ亚科。EBV有一个与其他DNA病毒不同 的特点，就是它在体外对B细胞的感染可刺激细胞 的持续性生长并引起细胞的永生化，从而形成淋巴 母细胞样细胞系(1ymphoblastoid cell lines， LCLs) ,尤其对人二倍体淋巴细胞转化效果极佳。 EBV主要通过结合人类B淋巴细胞膜上的EB病毒受体 而感染B淋巴细胞，初次受到感染便被迅速致敏， 36h后就可有DNA合成。被感染的B细胞在EB病毒核 抗原的刺激下转化为类淋巴母细胞，其端粒酶活性 提高，维护了细胞染色体端粒长度的稳定，并能够 不断分裂增殖，从而促使B淋巴细胞的永生性生长 。转化的细胞株染色体稳定，保留了原有的遗传性 状。人淋巴细胞转化是建立永生细胞系及进行细胞 遗传和分子遗传研究的极好方法。
四、 癌基因、 原癌基因
• 根据细胞凋亡与增殖的机理,有人用cmyc、 c-fos、 Ras 等原癌基因转染细 胞,使抑癌基因突变功能丧失, 从而使细 胞永生。 转染c-myc基因到人正常乳腺 上皮细胞, 可恢复端粒酶活性,并使p53 发生突变,进而促进细胞永生化。但也有 一些癌基因不仅不能转化细胞, 甚至促 进细胞的衰老,如Ras 癌基因、 Ab5 等 。
• 在体外培养的人正常细胞, 经一段时间的分裂, 就会进入一种生长抑制状态, 即衰老期( M1期)。 大多数真核生物细胞(生殖细胞、 干细胞除外)都 具有这种特性。 经转化了的细胞可越过衰老期而 进入另一增殖抑制状态,即危机期( M2期) ,危机 期的细胞开始出现退化, 并逐渐死亡。 只有少数 细胞在一定因素的影响下, 端粒酶被激活, 以自 身RNA 为模板合成端粒DNA 来补充或延长端粒,恢 复染色体的稳定性,从而使细胞越过危机期,发生 了永生化。
细胞永生化意义
• 了解细胞增殖与衰老的分子机制及保存 一些重要疑难病例的样本。
• 为治疗肿瘤、 控制肿瘤细胞的增殖以及 器官移植的研究奠定了坚实的基础。
• 由于永生化细胞具有可以多次传代的这 一特性, 我们可以利用各种细胞永生化 的方法使那些传代困难、 增殖慢、 易 衰老的细胞获得永生,从而为我们提供更 多的细胞资源。
EB 病毒转化人类外周血B-淋巴细 胞建立永生细胞系
• EB 病毒 (epstein2 barr virus) 转化外周血B 淋巴细胞(B-LC) , 使其成为一种能连续分裂永久 生存的类淋巴母细胞 ( lymphoblastoid) , 由此 建立的类淋巴母细胞株即为永生细胞株 ( immorta1ized cell lines) , 它可永远传代, 并 且每一种永生细胞株保存了原来提供血样个体的 完整基因组, 而且它的生化和分子生物学特性不 发生变化, 可作为生物标本库建立的首选方法。
促使细胞永生的基本方法
一、病毒转染 • EB 病毒 • EB 病毒( epstein-barr virus) 在体外能使
B 淋巴母细胞永生化形成淋巴母细胞样细胞系 , 它是通过潜伏蛋白激活细胞因子与其受体相 互作用的途径使细胞永生的。 • 目前, EB 病毒感染细胞使其永生应用最多的 是B 淋巴细胞,可以直接用与EB 病毒共培养的 方法,而在其他细胞中的应用很少。
• 研究细胞永生化最常用的方法就是通过构建含端 粒酶催化亚基( hT ERT ) 的表达载体, 通过各种 方法来转染细胞。
三、放射因素
• 通过X 射线、 电离辐射、 60Co等放射 性因素进行细胞永生化的方法, 可使细 胞周期得到延伸。可能是由于放射因素 破坏了细胞的衰老机制,或促进了与细胞 永生相关基因的表达。
• 利用EB病毒转化外周血B-淋巴细胞建立出生缺陷 永生细胞库, 或各种疾病, 特别是罕见疾病永生 细胞库已成为当今永久保存全基因组的首选方法, 它可为出生缺陷及其它罕见疾病的遗传流行病学 、临床遗传学、分子生物学等研究提供永久性试 验材料,
• EB病毒的特征之一是对B细胞有天然的亲和力并使 其发生转化,EBV引起的是一种无休止的细胞分裂 和 DNA 的无限的合成。
EB病毒的制备
• EB病毒基因组序列及其表达研究主要是用B95-8 株 进行的,B95-8 细胞系是用传染性单核细胞增多症患 者的EB 病毒感染绒猴B 淋巴细胞建立的。在B95-8 细胞系中只有很少一部分细胞可以自发产生病毒, 其他细胞呈隐性状态, 用不同的诱生剂如TPA诱生后 , 使产生病毒的细胞明显增加。B95-8在EB病毒转化 B-淋巴细胞过程中非常重要, 通过培养B95-8细胞制 备出大量高效价的EB病毒液, 对于B95-8细胞的培养 质量是EB病毒转化B-淋巴细胞成败的关键。
• 此外,EBV 在体外对B细胞的转化效率很高,一般都 能达到80%-100%。因为上述特点,世界上许多遗传 研究中心都用此方法作为常规处理每一份血标本 ,建立人类遗传种质库。
• 病毒转化后的B淋巴母细胞样细胞系(B-LCLs)依然 保存了B细胞的分化特征和免疫表型，作为抗原递 呈细胞，它可以摄取加工抗原，并将其载体部分 表达于细胞表面，供T细胞受体识别；也可作为抗 体基因的来源，将其与骨髓瘤细胞融合，制备分 泌相应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
• SV40 病毒
• SV40 是简单的真核细胞病毒, SV40 的T抗原片段是最常用的目的片段, 将其 整合入靶细胞核内并表达,可导致细胞增 殖活力的改变并表现出多种与肿瘤相关 的转化显型。
• 近年, 人们已成功获得多种 SV40转化的 永生细胞株,应用的方法包括:野生型SV 40病毒共培养感染靶细胞、 磷酸钙法、 电穿孔以及逆转录病毒载体法等。
细胞永生化的分子机制
• 目前认为,细胞永生化的模式如下:细胞经多次 分裂后 ,在肿瘤抑制因子 ,如p53、Rb 等作用 下,细胞进人衰老期(M1)期,此时细胞对生长因 子等失去反应 ,产生 DNA合成蛋白抑制因子 , 细胞周期检查点发送细胞周期停止信号,DNA合 成停止,细胞开始衰老 ,但不一定死亡。而病 毒、原癌基因、抑癌基因突变体则可以抑制M1 期机制,细胞绕过 M1期继续生长。细胞经过 20-30PDs后,进人危机期(M2期),细胞出现退化 ,分裂细胞逐渐减少 ,绝大多数细胞发生凋亡 ,只有罕见的细胞在一些因素影响下 ,可越过 M2期获得永生性转化。