细胞永生化
如何构建永生化细胞？
研究背景正常组织来源的细胞在体外培养条件下可分裂生长，但经过有限次数的传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡，这种现象称之为海弗利克极限。
有的细胞自发或受外界因素的影响，可以从增殖衰老危机中逃离，从而拥有无限增殖的能力，该过程称之为细胞永生化。
然而自发永生化的几率非常小，啮齿类动物为10-5-10-6，而人类细胞则更为罕见，小于10-12。
通过转染技术将外源性永生化基因导入目的细胞或诱导衰老相关基因突变，可以增加永生化的发生率，从而建立稳定的永生化细胞株。
研究意义永生化细胞能够提供稳定均一、性状一致的细胞来源，并且可以降低材料成本，因此，它是体外研究细胞增殖、分化、凋亡、衰老等的理想模型，加之，永生化细胞和肿瘤细胞关系密切，所以永生化细胞也是研究肿瘤发生机制的重要模型。
另外，由于永生化细胞具有可以多次传代的特性，可以利用各种细胞永生化的方法使那些传代困难、增殖缓慢、容易衰老的细胞获得永生，从而为研究人员提供更多的细胞资源。
研究方法目前，人们已建立了多种细胞永生化的方法，包括：1病毒基因转染很多病毒感染能够诱导细胞永生化，例如EB病毒(epstein-barr virus, EBV)、猿猴病毒40 (simian virus40, SV40)和人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)。
这些病毒感染其天然宿主细胞，能诱导细胞永生化。
EBV能使B淋巴母细胞永生化形成淋巴母细胞样细胞系，它是通过潜伏蛋白激活细胞因子与其受体相互作用的途径使细胞永生的。
EBV永生化B细胞的一个最显著的特点是端粒酶活性的提高，这可能是导致B细胞永生的主要原因。
目前，EB 病毒介导的细胞永生化应用最多的是B淋巴细胞，其他细胞中的应用很少。
SV40是简单的真核细胞病毒，SV40的T抗原片段是最常用的目的片段，将其整合入靶细胞核内并表达，可导致细胞增殖活力的改变并表现出多种与肿瘤相关的转化显型。
应用的方法包括：野生型SV40病毒共培养感染靶细胞、磷酸钙法、电穿孔以及逆转录病毒载体法等。
永生化细胞名词解释
永生化细胞名词解释
永生化细胞是指具有无限增殖能力的细胞，能够维持其生命周期的延长而不进入老化或凋亡状态。
这种细胞通常具有以下特征：
1. 无限增殖能力，永生化细胞能够不断地分裂和繁殖，而不受传统细胞分裂次数的限制。
它们能够持续地产生后代细胞，并保持其活力和功能。
2. 抗老化特性，相比普通细胞，永生化细胞具有更强的抵抗老化的能力。
它们能够维持较长的细胞寿命，不易受到环境因素和时间的影响而发生功能衰退。
3. 自我修复机制，永生化细胞通常具有较强的自我修复能力，能够修复受损的DNA或细胞结构，从而保持其正常功能和稳定性。
4. 细胞周期调控，永生化细胞能够调控细胞周期的进程，使细胞能够持续地进行有序的分裂和增殖，而不会过早地进入停滞或凋亡状态。
永生化细胞在生物学研究和医学领域具有重要意义。
研究人员
利用永生化细胞的特性，可以更好地理解细胞增殖、老化和疾病发
生的机制。
此外，永生化细胞还被应用于组织工程、干细胞研究、
药物筛选和基因治疗等领域，为人类健康和医学进步提供了新的可
能性。
需要注意的是，永生化细胞并非在自然界中普遍存在，而是通
过人工手段或基因突变等方式获得的。
此外，永生化细胞的研究和
应用也存在一些伦理和安全的考虑，需要在科学和伦理框架下进行。
细胞永生化
细胞永生化:体外培养细胞经过自发的或受外界因素的影响而从增殖危机中逃逸，细胞获得持续生长增殖能力的特性.永生化的细胞具有无限增殖生长性，可长期传代，并多伴有核型改变。
原代细胞永生化后即获得无限增殖的能力，但它们没有恶性转化的表型特征，即不能在软琼脂上形成克隆(锚着独立性生长)，也不能在裸鼠皮下成瘤。
如果细胞在永生化的基础上发生更多的分子突变事件如癌基因的活化、抑癌基因的失活、表观遗传突变等，这些突变在细胞中不断累积，达到一定的负荷时，细胞就可能发生恶性转化，因此细胞永生化实际上可以看作是细胞转化前的一个特殊阶段。
目前普遍认为细胞永生化是细胞恶性转化的必经阶段，因为所有的肿瘤细胞都具备无限分裂的特性。
也就是说永生化细胞有可能是肿瘤细胞的前奏，它和肿瘤细胞都是无限增殖的，但是永生化细胞无成瘤性，肿瘤细胞有成瘤性质，它们在癌基因的活化、抑癌基因的失活、表观遗传突变等方面分子方面应该有很多不同
永生化细胞和肿瘤细胞：虽然二者均可无限增殖，永生化细胞没有肿瘤具有的浸润性和转移性。
大学细胞生物学考试练习题及答案851
大学细胞生物学考试练习题及答案81.[单选题]用胸腺嘧啶脱氧核苷酸（TdR）处理增殖中的细胞可使其阻滞在哪个时期？（ ）A)G1期B)S期C)G2期D)M期答案:B解析:高浓度的胸腺嘧啶能阻断DNA合成所需的核苷酸的合成，在细胞分裂周期中， 将细胞阻断在G1/S期交界处，正在合成DNA的细胞将停滞在S期。
2.[单选题]卵磷脂又叫做( )A)磷脂酰胆碱B)磷脂酰乙醇胺C)磷脂酰丝氨酸D)鞘磷脂答案:A解析:3.[单选题]具有破坏微管结构的特异性药物是( )A)秋水仙素B)细胞松弛素C)鬼笔环肽D)紫杉酚答案:A解析:4.[单选题]在核糖体中执行催化功能的生物大分子是（ ）。
[南开大学2011研]A)蛋白质B)DNAC)RNAD)糖类答案:C解析:核糖体是核糖体RNA（rRNA）和核糖体蛋白（r蛋白）复合物，其关键的部分是rRNA，它是蛋白质合成的催化机器，具有肽酰转移酶的活性；而核糖体蛋白更多地是作为一种骨架帮助rRNA维持正确的构象，以及在蛋白质合成中起微调作用。
5.[单选题]N-连接的糖基化中，糖链连接在( )上。
A)天冬酰胺D)羟脯氨酸E. 精氨酸答案:A解析:6.[单选题]有关受体的激动剂和阻断剂，说法不对的是 （ ）A)激动剂和阻断剂都可以与受体结合B)激动剂与受体亲和力大，而阻断剂与受体的亲和力小C)激动剂与受体的亲和力大，并且内在活性大D)阻断剂与受体的亲和力大，并且缺乏内在活性答案:B解析:7.[单选题]核糖体上肽酰基位点的作用是（ ）A)接受并结合新掺入的氨酰基-tRNAB)结合延伸中的肽酰基-tRNAC)在肽链延伸过程中催化氨基酸残基之间形成肽键D)供给催化肽酰基-tRNA转位时所需的能量答案:B解析:8.[单选题]将血清从处于S期的原代细胞的培养液中去除后，细胞将停在（ ）A)SB)G2C)MD)G0答案:D解析:9.[单选题]中心粒的复制发生在（ ）。
A)G1期B)S期C)G2期D)M期答案:A解析:10.[单选题]微粉干涉显微镜是将（ ）转变成明暗差A)景深差B)焦距差C)相位差解析:11.[单选题]亲和层析是依靠填充物的（ ）将蛋白质选择性的分离A)孔径B)电荷C)配体D)分子量答案:C解析:12.[单选题]内共生假说认为叶绿体的祖先为一种（ ）。
细胞永生化实验
• EBV主要通过结合人类B淋巴细胞膜上的 EB病毒受体而感染B淋巴细胞，初次受到 感染便被迅速致敏，36h后就可有DNA 合成。被感染的B细胞在EB病毒核抗原的 刺激下转化为类淋巴母细胞，其端粒酶活 性提高，维护了细胞染色体端粒长度的稳 定，并能够不断分裂增殖，从而促使B淋 巴细胞的永生性生长。转化的细胞株染色 体稳定，保留了原有的遗传性状。人淋巴 细胞转化是建立永生细胞系及进行细胞遗 传和分子遗传研究的极好方法。
• Epstein-Barr病毒(EBV)是1964年首先从 非洲恶性Burkitt淋巴瘤(BL)的淋巴母细胞 系中发现的，属疱疹病毒科γ亚科。EBV 有一个与其他DNA病毒不同的特点，就是 它在体外对B细胞的感染可刺激细胞的持 续性生长并引起细胞的永生化，从而形成 淋巴母细胞样细胞系(1ymphoblastoid cell lines，LCLs) ,尤其对人二倍体淋巴细 胞转化效果极佳。
实验材料和方法
试剂 产生 EBV的 B95-8细胞株，RPMI1640培
养基，PBS缓冲液，胎牛血清，淋巴细 胞分离液，环孢霉素A，植物凝集素， 台盼蓝染液 标本的收集 取样：无菌、轻轻摇动使血液与肝素混匀 秦巴山区精神发育迟滞患者家系（两天 之内的血样）
实验方法
EB病毒的制备
• EB病毒基因组序列及其表达研究主要是 用B95-8 株进行的,B95-8 细胞系是用 传染性单核细胞增多症患者的EB 病毒感 染绒猴B 淋巴细胞建立的。在B95-8 细 胞系中只有很少一部分细胞可以自发产 生病毒, 其他细胞呈隐性状态, 用不同的 诱生剂如TPA诱生后, 使产生病毒的细胞 明显增加。B95-8在EB病毒转化B-淋巴 细胞过程中非常重要, 通过培养B95-8细 胞制备出大量高效价的EB病毒液, 对于 B95-8细胞的培养质量是EB病毒转化B淋巴细胞成败的关键。
细胞永生化处理方法
细胞永生化处理方法引言细胞永生化处理方法是指通过一系列的技术手段，使细胞能够长时间保持活力和增殖能力，从而实现细胞的永生化。
这项技术在生物医学研究、药物开发和组织工程等领域具有重要的应用价值。
本文将介绍几种常见的细胞永生化处理方法，并分析它们的优缺点。
方法一：基因修饰基因修饰是一种常见的细胞永生化处理方法。
通过改变特定基因的表达或功能，可以延长细胞的寿命和增加其增殖能力。
常用的基因修饰方法包括下调抑制性基因、上调促进性基因以及改变染色体结构等。
下调抑制性基因是一种常见的策略。
例如，通过RNA干扰技术或CRISPR-Cas9系统靶向沉默p53等抑制性基因，可以减少细胞凋亡和老化现象，延长细胞寿命。
上调促进性基因也是一种有效的方法。
例如，通过转染特定基因或使用激活子等技术，可以增加细胞的增殖能力和代谢活性，从而延长细胞寿命。
改变染色体结构是另一种常见的基因修饰方法。
例如，通过转座子或合成染色体等技术，可以改变细胞染色体的结构和组成，提高其稳定性和抗衰老能力。
然而，基因修饰方法存在一些局限性。
首先，基因修饰可能引发不可预测的副作用或导致细胞功能异常。
其次，基因修饰需要精确的操作和复杂的技术支持，对于一些非专业人员来说较为困难。
方法二：药物干预药物干预是另一种常用的细胞永生化处理方法。
通过使用特定药物或化合物，可以调节细胞的代谢、增殖和凋亡等过程，从而延长细胞寿命。
一种常用的药物干预方法是使用抗衰老剂。
目前已经发现了多种具有抗衰老效果的化合物，如雷帕霉素、二甲双胍等。
这些化合物可以通过激活特定信号通路或改变细胞内环境来延长细胞的寿命。
另一种常见的药物干预方法是使用激素。
例如，雌激素在一些细胞中具有促进增殖和减少凋亡的作用，可以延长细胞寿命。
然而，激素使用需要注意剂量和时间的控制，以避免不良反应和副作用。
虽然药物干预方法相对简单易行，但也存在一些问题。
首先，不同细胞对药物的敏感性存在差异，需要进行个体化处理。
细胞永生化 PPT课件
• 其它病毒
• 一些病毒如乳头瘤病毒E6、 乙型 肝炎使一些特殊 细胞的增殖能力加强。人乳头瘤病 毒E6 蛋白是最常见的转化蛋白,通 过对端粒酶催化亚基( hT ERT )的 转录调控而激活端粒酶。
二、端粒酶
• 端粒酶是由RNA和蛋白质组成的复合体,为一种特殊的 DNA 聚合酶,合成DNA到染色体末端,因而被认为是一种依 赖自身RNA 的逆转录酶。在体外培养的正常体细胞中, 端 粒长度逐渐缩短,细胞克隆将面临增殖危机和死亡, 但这 种细胞的端粒酶一旦被激活, 将维持端粒缩短和延长的动 态平衡,从而使细胞获得无限增殖的能力, 使之永生或癌 变。病毒转化的各种人永生化细胞试验结果证明端粒酶活 化可能是细胞永生化的共同步骤,病毒的转化能使一些细 胞(如成纤维细胞、 胚肾细胞等) 越过M1 阻断, 但并不 能使细胞顺利的度过M2 期。在许多转化细胞和肿瘤细胞 中端粒长度近于临界值, 所以推测端粒酶活化可能是细胞 永生化过程中较晚的事件。
细胞永生化
杨星
什么是细胞永生化？
• 细胞永生化是指体外培养的细胞经过自 发的或受外界因素的影响从增殖衰老危 机中逃离, 从而具有无限增殖能力的过 程。
细胞永生化处理方法
细胞永生化处理方法细胞永生化处理方法，就是通过一系列手段让细胞在无限期间内不受自然死亡的限制而实现细胞“永生”的过程。
此技术的发展与生命科学领域研究的进步密切相关，对于人类医疗、生命科学等领域都有着重要的意义。
目前，细胞永生化的处理方法主要有以下几种。
第一种，各种DNA损伤修复系统的促进。
当细胞受到外界环境、化学物质、射线等因素影响时，其内部的DNA会出现不同程度的损伤。
而损伤的DNA长期叠加，并不能通过机体自身修复的方式，致使细胞失去自我修复能力，从而导致细胞死亡。
目前的细胞永生化处理方法就是通过促进各种DNA修复系统的运作，极大地提高了细胞修复损伤的速度和效率。
第二种，线粒体增值。
线粒体是细胞内的一个重要器官，其主要功能是提供细胞所需的能量。
而线粒体的功效则取决于其内部的氧化磷酸化过程，当这个过程出现问题时，线粒体的能量供给也会跟着减弱。
因此，通过增加细胞内线粒体的数量，可以从根本上改善细胞代谢的状况，进而实现细胞永生化的效果。
第三种，活性氧的消除。
在细胞永生化过程中，活性氧的生成是一个不可避免的过程。
随着时间的推移，这些活性氧会逐渐积累，最终导致细胞的死亡。
因此，消除细胞内的活性氧，可以有效防止其积累，从而保证细胞的生存。
第四种，细胞表面的改变。
在自然界中，很多细胞都需要经历繁殖、生长、发育等过程，而这些过程对于细胞表面的改变至关重要。
因此，通过维持细胞表面的稳定状态，可以提高细胞的自我修复能力，实现细胞永生化的效果。
在当前的生命科学领域中，细胞永生化处理方法已经开始得到广泛的应用。
通过这些技术的不断推进，我们相信，未来的这个领域会带来更多的创新和发展，为人类健康和生命科学的发展做出更大的贡献。
人永生化胰腺星形细胞系的构建及其功能的验证
人永生化胰腺星形细胞系的构建及其功能的验证韩世纪1，2，练国达1，2，陈少杰1，2，黄开红1，2*，李佳佳1，3*［摘要］目的构建人永生化胰腺星形细胞（PSCs）系并探讨其生物学功能。
方法采用outgrowth方法提取人原代胰腺星形细胞（hPSCs），慢病毒感染方法导入SV40LT基因和hTERT基因，嘌呤霉素筛选稳定高表达两个基因的细胞（im PSCs），qRT⁃PCR和Western bolt方法检测表达水平；CCK8法、核型分析、免疫荧光、体内成瘤实验检测im PSCs生长曲线，染色体数目，胶原基质蛋白表达和有无恶性表型转化；共培养方法、CCK8法、细胞划痕、迁移侵袭方法检测imPSCs促瘤作用。
结果hPSCs呈多角形和梭形，慢病毒感染的im PSCs，显微镜下有亮绿色荧光；im PSCs细胞高表达SV40LT基因和hTERT基因；im PSCs生长曲线呈典型的“S”型，染色体数目增多，体内不能成瘤，表达α⁃SMA、Collagen I、Fibronectin，具有PSCs的生物学功能和特点；其与胰腺癌细胞共培养后，明显促进肿瘤生长，与人原代PSCs功能相当。
结论采用慢病毒转染SV40LT基因和hTERT基因可成功构建人胰腺星形细胞永生化细胞系，为胰腺星形细胞本身及胰腺癌微环境相关研究提供实验材料和模型。
［关键词］胰腺癌；胰腺星形细胞；永生化细胞系doi：10.3969/j.issn.1009⁃976X.2021.01.007中图分类号：R735.9文献标识码：AConstruction and functional verification of immortalized human pancreatic stellate cellsHAN Shi⁃ji1，2，LIAN Guo⁃da1，2，CHEN Shao⁃jie1，2，HUANG Kai⁃hong1，2*，LI Jia⁃jia1，3*1.Key Laboratory of Epidemiology and Gene Regulation of Malignant Tumors，Sun Yat⁃sen MemorialHospital，Sun Yat⁃sen University，Guangzhou510120，China；2.Department of Digestive System Depart⁃ment，Sun Yat⁃sen Memorial Hospital，Sun Yat⁃sen University，Guangzhou510120，China；3.Depart⁃ment of Nephropathy Department，Sun Yat⁃sen Memorial Hospital，Sun Yat⁃sen University，Guangzhou510120，ChinaCorresponding author：HUANG Kai⁃hong，*****************；LI Jia⁃jia，****************［Abstract］Objective To construct the human pancreatic stellate cell line immortalization anddiscuss their biological function.Methods We extracted human primary pancreatic stellate cells（hPSCs）by outgrowth and then infected the cells with SV40LT and hTERT genes using lentivirus infection.Thecells（named imPSCs）with stable and high expression of SV40LT and hTERT genes were screened with puromycin.The next，qRT⁃PCR and Western Bolt methods were used to detect the expression levelsof the two K8method，karyotype analysis and immunofluorescence method were conducted respectively to detect the growth curve，chromosome number，protein expression ofα⁃SMA，collagen Iand fibronectin of the imPSCs.We also performed tumor formation assay in vivo to detect whether theimPSCs had malignant phenotypic transformation.The tumorigenesis of imPSCs was detected by transwellcell co⁃culture，CCK8methods，wound healing assay，migration and invasion methods.Results Humanprimary PSCs were polygonal and spindle shaped，and bright green fluorescence was observed under the microscope after successfully infected lentivirus.In imPSCs，SV40LT and hTERT genes were stably andhighly expressed in mRNA and protein levels.The imPSCs had typed“S”growth curve and increased基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（82003175）；广东省医学科学技术研究基金项目（A2019447）作者单位：1.中山大学孙逸仙纪念医院，广东省恶性肿瘤表观遗传学与基因调控重点实验室，广州510120；2.中山大学孙逸仙纪念医院消化内科，广州510120；3.中山大学孙逸仙纪念医院肾内科，广州，510120*通讯作者：黄开红，Email：*****************；李佳佳，Email：****************胰腺癌恶性程度高，肿瘤间质纤维化是其重要病理特征，纤维化程度与不良预后相关［1］。
永生化绵羊肺成纤维细胞系的构建及鉴定
永生化绵羊肺成纤维细胞系的构建及鉴定刘腾;董丹丹;张莉;朱杰;缪秋红;刘光清【摘要】The lentivirus system carrying hTERT gene was inserted to sheep lung fibroblasts (SLT) in order to establish an immortal cell line. Firstly, the recombinant lentiviral expression vector (pLOV-puro-hTERT) carrying hTERT gene was transfected into 293T cells. Subsequently, the primary SLT cells were infected with the rescued lentiviruses. The positive SLT cells expressing hTERT were selected with puromycin and examined with RT-PCR and Western blot. The results showed that hTERT gene was stably expressed in SLT cells, indicated that an immortalized SLT cell line had been established.%为了利用携带人源端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因的慢病毒表达系统将原代绵羊肺成纤维细胞进行永生化.本研究利用PCR技术从pBabe-neo-hTERT中扩增hTERT基因,并利用infusion技术构建重组慢病毒表达载体pLOV-puro-hTERT.将重组慢病毒三质粒系统共转染293T细胞,拯救出慢病毒颗粒并感染原代绵羊肺成纤维细胞,经嘌呤霉素抗性筛选获得阳性克隆,分别应用RT-PCR和Western blot方法检测传代细胞系中hTERT基因的转录和表达水平.筛选获得的阳性克隆,命名为SLT细胞系.SLT 细胞系连续传代后RT-PCR及Western blot 检测均显示hTERT稳定表达.本研究表明,我们成功构建了永生化绵羊肺成纤维细胞系.【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2018(026)002【总页数】5页(P54-58)【关键词】绵羊肺成纤维细胞;人端粒酶逆转录酶;永生化【作者】刘腾;董丹丹;张莉;朱杰;缪秋红;刘光清【作者单位】中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241【正文语种】中文【中图分类】S852.659.3传代细胞系是开展动物病毒应用和基础研究的重要平台，然而有许多动物病毒缺乏能支持其稳定增殖的本源宿主细胞系，例如小反刍兽疫病毒和兔瘟病毒，严重阻碍了这些病毒的分子生物学研究和疫苗研制工作。
hTERT基因电转染人_T细胞建立可诱导的永生化细胞系_庞永胜
２０１２年９月内蒙古大学学报（自然科学版）Ｓｅｐｔ．２０１２第４３卷第５期Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．４３Ｎｏ．５ 文章编号：１０００－１６３８（２０１２）０５－０５０２－０７ｈＴＥＲＴ基因电转染人"#Ｔ细胞建立可诱导的永生化细胞系＊庞永胜１，２，何 维１，２，王 浩１，２，崔莲仙１，２（１．中国医学科学院基础医学研究所，北京１００００５；２．北京协和医学院基础学院免疫学系，北京１００００５）摘要：利用电击将外源基因ｈＴＥＲＴ与ｐＴｅｔ－ｏｎ调控质粒共转染人"#Ｔ细胞，建立可诱导的永生化人"#Ｔ细胞系．分离人ＰＢＭＣ，体外刺激增殖后经磁珠分选纯化，然后对其进行外源ｈＴＥＲＴ基因和ｐＴｅｔ－ｏｎ调控质粒的共同电转染，并加入强力霉素诱导目的基因表达．电转染程序Ｔ－２３和Ｔ－２０的效率分别为３７．５％±０．９８６０％和３０．５％±０．５５９０％．经鉴定，外源ｈＴＥＲＴ基因能够整合人"#Ｔ细胞基因组中并在诱导后表达．程序Ｔ－２３的转染效率更高，强力霉素的有效诱导浓度是６００ｎｇ／ｍＬ，志愿者本人的血清更利于电转后细胞的存活．关键词：ｈＴＥＲＴ基因；人"#Ｔ细胞；永生化；电转染中图分类号：Ｒ３９２－３３ 文献标志码：Ａ 正常细胞的增殖能力是有限的，经过一定时间的增殖后，最终进入一种生长抑制状态〔１〕．已经有实验证明通过转染人端粒酶逆转录酶（ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ｈＴＥＲＴ）基因进入某些细胞系可以使这些细胞系生命周期延长或者永生化〔２－４〕，并且已经证实这些永生化细胞的核型并没有发生变化〔２〕．甚至使用ｈＴＥＲＴ永生化的细胞进行临床治疗已经证明可行〔５〕．对悬浮细胞使用病毒感染等永生化方法较难成功，而电转染方法虽然存在着电击后细胞死亡较多等缺点，但是其适用范围广，转染效率高的优点使之可以应用于难转染的悬浮细胞〔６－７〕．"#Ｔ细胞作为重要的淋巴细胞，目前仍没有永生化的细胞系，实验中使用的"#Ｔ细胞均由健康志愿者或者活体动物获得，这不仅消耗了较大的人力和物力，而且由于不同个体的"#Ｔ细胞存在个体间差异，往往导致使用不同个体的"#Ｔ细胞所得到的实验结果差异很大．为了更好地研究和应用"#Ｔ细胞，制备永生化的"#Ｔ细胞就显得很有必要．但是考虑到电转染进去的基因很可能会改变"#Ｔ细胞原本的生物学性状，如果能够在需要的时候阻止该基因的表达则可以使之恢复其原本的生物学性状．本研究以人"#Ｔ细胞作为研究对象，试图通过电转染外源性ｈＴＥＲＴ基因和ｐＴｅｔ－ｏｎ调控质粒进入人外周血"#Ｔ细胞，进而通过强力霉素的加入与否来控制ｈＴＥＲＴ基因表达来获得可调控的永生化人"#Ｔ细胞系．１ 实验１．１ 质粒、菌株与细胞质粒ｐＬＰＣ－ｈＴＥＲＴ、ｐＲｅｖＴＲＥ载体和ｐＲｅｖＴｅｔ－Ｏｎ载体均购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司；大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５$细胞由本实验室保存；人外周静脉血细胞从健康志愿者获得．＊收稿日期：２０１１－１２－０８；修回日期：２０１２－０３－２６基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０４００３９１）作者简介：庞永胜（１９８２－），男，河南省漯河市人，２００８级硕士研究生．Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｒａ．ｒａｎｇｅ＠１６３．ｃｏｍ．通信作者：何 维（１９５５－），男，黑龙江人，教授，博士，博士生导师．Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｅｗｅｉ＠ｍｏｈ．ｇｏｖ．ｃｎ．１．２ 电转染相关设备及试剂德国Ｌｏｎｚａ公司的Ａｍａｘａ ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒⅠ电转染仪器属于中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室．电转染试剂盒Ａｍａｘａ?Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ购自Ｌｏｎｚａ公司．１．３ 酶、其他试剂与材料ＨｉｎｄⅢ、ＣｌａⅠ等限制性内切酶购自ＮＥＢ公司；Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＥｘＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＤＮＡ基因组提取试剂盒和ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００、ＤＬ１００００及ＤＬ１５０００均购自ＴａＫａ－Ｒａ公司；ｐａｎ－ａｎｔｉ"#ＴＣＲ抗体以及ＰＥ标记的"#ＴＣＲ抗体均购自ＢＤ公司；注射用重组人白介素２购自北京瑞得合通药业有限公司；"#Ｔ细胞分选试剂盒购自Ｍｉｌｔｅｎｙ公司；ＲＰＭＩ－１６４０培养基是Ｉｎ－ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品；新生胎牛血清是Ｈｙｃｌｏｎｅ公司产品；枸橼酸钠（ＡＣＤ）抗凝血液保存液购自北京红十字血液中心；人淋巴细胞分离液是中国医学科学院生物工程医学研究所产品；强力霉素（Ｄｏｘｙｃｙｃ－ｌｉｎｅ）购自罗氏公司；ｍＲＮＡ提取试剂盒购自Ｑｉａｇｅｎ公司；质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒均购自威格拉斯生物公司；其他试剂均为国产分析纯．实验中所用引物如表１所示．表１ ＰＣＲ所用引物Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ＰＣＲ引物名称引物序列引物长度ｈＴＥＲＴ－Ｆ－１ ５’－ＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＣＧＣＧＣＴ－３’２２ｂｐｈＴＥＲＴ－Ｒ－１ ５’－ＧＧＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＴＣＴＧＧＴＡＧＧＡＣＣＴＧＡＣＴＡ－３’３０ｂｐｈＴＥＲＴ－Ｆ－２ ５’－ＴＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡ－３’２３ｂｐｈＴＥＲＴ－Ｒ－２ ５’－ＴＣＣＧＧＣＧＴＣＧＧＴＴＧＧＧＣＣＧＴＧＡＣＧＧＧＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＴ－３’３７ｂｐ１．４ 方法１．４．１ 构建载体ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ首先对载体ｐＬＰＣ－ｈＴＥＲＴ利用ＨｉｎｄⅢ和ＣｌａⅠ双酶切后胶回收ｈＴＥＲＴ基因，同时对空载体ｐＲｅｖＴＲＥ进行ＨｉｎｄⅢ和ＣｌａⅠ双酶切，经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接并转化到Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α感受态细胞，挑选阳性克隆进行双酶切鉴定并测序．１．４．２ Ｆｉｃｏｌｌ密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞ＰＢＭＣ从健康志愿者抽取新鲜外周静脉血６０ｍＬ，利用枸橼酸钠（ＡＣＤ）血液保存液抗凝后用６０ｍＬＨＡＮＫｓ缓冲液１∶１稀释；先将１５ｍＬ淋巴细胞分离液加到５０ｍＬ离心管中，随后用滴管贴壁缓慢将稀释血液按照稀释血液：淋巴细胞分离液＝２∶１的比例加入３０ｍＬ稀释血液，勿打乱液层界面；１９５０ｒ／ｍｉｎ室温离心１５ｍｉｎ；离心后用吸管小心吸取白膜层到新的离心管；加入３０ｍＬ灭菌ＰＢＳ，混匀后进行细胞计数，然后１６００ｒ／ｍｉｎ室温离心１０ｍｉｎ；弃上清，再加入１５ｍＬ ＰＢＳ，混匀后１３５０ｒ／ｍｉｎ室温离心１０ｍｉｎ；小心完全吸弃上清，留下的ＰＢＭＣ用于接下来磁珠分选"#Ｔ细胞．１．４．３ 人"#Ｔ细胞的扩增用无血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养基将上一步的人ＰＢＭＣ细胞重悬后移入到已包被ｐａｎ－ａｎｔｉ"#ＴＣＲ抗体的２４孔板中，然后加入等量含２０％胎牛血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养基和重组人白介素－２，在３７℃，５％ＣＯ２的孵箱内培养１周后用于分选及电转染．１．４．４ 磁珠分选纯化人"#Ｔ细胞按照Ｍｉｌｔｅｎｙ公司的人"#Ｔ细胞磁珠分选操作步骤获得人"#Ｔ细胞，细胞经ＰＥ标记的"#ＴＣＲ抗体染色后进行流式分析．将分选后的人"#Ｔ细胞在３７℃，５％ＣＯ２的孵箱内培养２４ｈ．１．４．５ 电转染人"#Ｔ细胞及电转染条件的优化１．４．５．１ 电转染人"#Ｔ细胞根据Ｌｏｎｚａ公司的Ａｍａｘａ?Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ?Ｋｉｔ的操作说明进行电转染：将电转染溶液和补充溶液按４．５∶１的比例混合，４℃存放，作为电转染混合溶液，每个反应用该混合液３０５第５期庞永胜等 ｈＴＥＲＴ基因电转染人"#Ｔ细胞建立可诱导的永生化细胞系１００μＬ．在１２孔板中加入含有１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养基２ｍＬ／孔，放入３７℃，５％ＣＯ２的孵箱内预温至少３０ｍｉｎ．取４×１０６个"#Ｔ细胞用于１个电转染反应；将２．５μｇ去内毒素高浓度（＞１μｇ／μＬ）的质粒ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ和２．５μｇ调控载体ｐＲｅｖＴｅｔ－Ｏｎ分别加到预冷的１００μＬ电转染混合溶液中，同时设立阳性对照组ｐｍａｘＧＦＰ质粒和阴性对照组ｐＲｅｖＴＲＥ载体；具体分组见表２．表２ 电转染实验分组Ｔａｂｌｅ ２ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ程序阳性对照阴性对照实验组１、２和３Ｔ２３ｐｍａｘＧＦＰ ｐＲｅｖＴＲＥ ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ＋ｐＲｅｖＴｅｔ－ｏｎＴ２０ｐｍａｘＧＦＰ ｐＲｅｖＴＲＥ ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ＋ｐＲｅｖＴｅｔ－ｏｎ 在１５ｍｉｎ内将上述电转染样品分别使用电转染程序Ｔ－２３和Ｔ－２０（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ?ⅠＤｅｖｉｃｅ）进行电转染，电转染后迅速缓慢加入５００μＬ于３７℃孵箱内预热的ＲＰＭＩ－１６４０培养基，小心将电转杯内的细胞轻柔地转移到含有１．５ｍＬ预热ＲＰＭＩ－１６４０培养基的１２孔板中（总体积为２ｍＬ）并且避免反复吹打细胞．然后将１２孔板置于３７℃，５％ＣＯ２的孵箱内孵育．培养４．５ｈ时在荧光显微镜下观察阳性对照组ＧＦＰ表达情况并用流式细胞仪检测电转染效率；培养２４ｈ后加入强力霉素（Ｄｏｘｙｃｙｃ－ｌｉｎｅ）来诱导ｈＴＥＲＴ基因表达；继续培养４８ｈ后进行鉴定．１．４．５．２ 电转染条件的优化选择使用流式细胞仪检测ＧＦＰ的表达情况，来比较Ｔ－２３和Ｔ－２０这两种不同电转染程序的转染效率；在电击后对细胞进行培养时，比较分别使用１０％ＦＢＳ与１０％志愿者本人血清所带来的不同培养效果．１．４．６ 强力霉素诱导ｈＴＥＲＴ表达及诱导条件的优化１．４．６．１ 提取人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ鉴定ｈＴＥＲＴ基因按照ＴａＫａＲａ公司的细胞基因组ＤＮＡ快速提取试剂盒的步骤提取经强力霉素诱导２４ｈ的人"#Ｔ细胞的基因组ＤＮＡ，利用引物ｈＴＥＲＴ－Ｆ－１和ｈＴＥＲＴ－Ｒ－１（表１）进行ＰＣＲ，来鉴定ｈＴＥＲＴ基因是否整合到基因组ＤＮＡ中．１．４．６．２ 提取人"#Ｔ细胞ｍＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ鉴定ｈＴＥＲＴ基因的表达按照Ｑｉａｇｅｎ公司的ＲＮｅａｓｙ?Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ的ＲＮｅａｓｙ?Ｍｉｎｉ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１０）中的操作步骤提取经强力霉素诱导２４ｈ的人"#Ｔ细胞的ＲＮＡ；经ＲＴ－ＰＣＲ证实ｈＴＥＲＴ基因表达．ＰＣＲ所用引物为ｈＴＥＲＴ－Ｆ－２和ｈＴＥＲＴ－Ｒ－２（表１）．另外使用一对引物的原因在于：ｈＴＥＲＴ基因ＧＣ含量高，基因片段长，又要进行较为复杂的操作，所以针对该基因的３’端设计了这样一对引物．１．４．６．３ 强力霉素诱导表达浓度的优化在电转染２４ｈ后，分别加入以下不同浓度的强力霉素：０，１００ｎｇ／ｍＬ，２００ｎｇ／ｍＬ，４００ｎｇ／ｍＬ，６００ｎｇ／ｍＬ，８００ｎｇ／ｍＬ，１０００ｎｇ／ｍＬ，继续培养４８ｈ后进行鉴定，根据鉴定结果来判断诱导人"#Ｔ细胞表达ｈＴＥＲＴ的最适合强力霉素浓度，从而优化诱导表达条件．Ｍ：ＤＬ１００００ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１，２和３：ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ重组质粒经ＨｉｎｄⅢ和ＣｌａⅠ双酶切鉴定图１ ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ重组质粒的鉴定Ｆｉｇ．１ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴｖｅｃｔｏｒ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＨｉｎｄⅢ和ＣｌａⅠ４０５内蒙古大学学报（自然科学版）２０１２年２ 结果与讨论２．１ 重组质粒ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ的鉴定双酶切结果表明（图１），目的基因ｈＴＥＲＴ已克隆至ｐＲｅｖＴＲＥ载体中，基因插入方向正确，测序结果亦证实目的基因序列３３９９ｂｐ，大小准确无误．２．２ 流式细胞术分析磁珠分选纯化人"#Ｔ细胞的效果经过７天的刺激扩增，人"#Ｔ细胞的比例提高到５２．３％；经过磁珠阳性分选纯化获得了纯度为８５％的人"#Ｔ细胞（图２）．Ａ：分选前人"#Ｔ细胞所占比例；Ｂ：分选后人"#Ｔ细胞所占比例图２ 流式技术分析磁珠分选纯化人"#Ｔ细胞Ｆｉｇ．２ Ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ"#Ｔ ｃｅｌｌｓ ｓｏｒｔｅｄ ｂｙ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ２．３ 利用荧光显微镜和流式细胞仪分析人"#Ｔ细胞的电转染效率电转染的人"#Ｔ细胞使用含１０％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ－１６４０培养基在３７℃，５％ＣＯ２孵箱内培养４．５ｈ后，在荧光显微镜下观察阳性对照组ＧＦＰ的表达情况（图３）．Ａ．ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｉｍａｇｅ；Ｂ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｉｍａｇｅ图３ 电转染后培养４．５ｈ时人"#Ｔ细胞阳性对照组中ＧＦＰ的表达情况Ｆｉｇ．３ ＧＦＰ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｏｒ ４．５ｈａｆｔｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ培养４．５ｈ后收取人"#Ｔ细胞，用ＰＥ标记的抗"#ＴＣＲ抗体进行流式染色，用流式细胞仪定量分析两种电转染程序的转染效率（图４）．２．４ 电转染人"#Ｔ细胞程序的优化统计学分析结果表明，在其他电转染条件相同的情况下，人"#Ｔ细胞使用电转染程序Ｔ－２３时的电转染效率为３７．５％±０．９８６０％，使用电转染程序Ｔ－２０时的电转染效率为３０．５％±０．５５９０％，两种电转染程序的转染效率存在统计学显著性差异．２．５ 电转染后对人"#Ｔ细胞中ｈＴＥＲＴ基因及其表达情况进行鉴定在人"#Ｔ细胞电转染ｈＴＥＲＴ基因４８ｈ后，也即经强力霉素诱导表２４ｈ后，分别提取基因组５０５第５期庞永胜等 ｈＴＥＲＴ基因电转染人"#Ｔ细胞建立可诱导的永生化细胞系ＤＮＡ进行ＰＣＲ和提取ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ．如图５所示，经琼脂糖凝胶电泳发现条带分子量大小与预期相同．该鉴定结果表明，在电转染并诱导后的人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ和ＲＮＡ中能够检测到ｈＴＥＲＴ基因及其转录产物的存在．１．ＰＥ－ａｎｔｉ－"#ＴＣＲ抗体；２．程序Ｔ－２３的ＧＦＰ表达水平；３．程序Ｔ－２０的ＧＦＰ表达水平图４ 流式细胞仪定量分析两种电转染程序的转染效率Ｆｉｇ．４ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｆｆｉｃｅｎｃｙ ｏｆ ｔｗｏ ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍｓ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．鉴定人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ中ｈＴＥＲＴ基因．Ｍ１：ＤＬ１００００ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；Ｍ２：ＤＬ２０００ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１，２：经电转ｈＴＥＲＴ基因的人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ；３：未经电转ｈＴＥＲＴ基因的人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ；４：ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ作为ＰＣＲ阳性对照．Ｂ．鉴定人"#Ｔ细胞ＲＮＡ中ｈＴＥＲＴ基因转录产物．Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１：未经电转ｈＴＥＲＴ基因的人"#Ｔ细胞ＲＮＡ经ＲＴ－ＰＣＲ；２：ｐＲｅｖＴＲＥ－ｈＴＥＲＴ作为ＰＣＲ阳性对照；３－９：经电转ｈＴＥＲＴ基因的人"#Ｔ细胞ｍＲＮＡ经ＲＴ－ＰＣＲ．图５ 鉴定人"#Ｔ细胞中ｈＴＥＲＴ基因及其表达产物Ｆｉｇ．５ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈＴＥＲＴａｎｄ ｉｔｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ"#Ｔ ｃｅｌｌｓ２．６ 讨论原代细胞难以长期培养一直都是原代细胞研究的一个瓶颈．长期以来，研究者一直试图对原代细胞进行永生化．目前对原代细胞进行永生化的方法主要有：１．肿瘤标本直接培养建系法．采用原代肿瘤细胞体外培养建立永生化的细胞系；２．生物学方法．如通过病毒感染使原代正常细胞永生化．Ｂ淋巴细胞通过被ＥＢＶ病毒感染就可以实现永生化；３．物理学方法．将外源永生化相关基因直接导入原代正常细胞使之永生．电转染即是一种通过电击造成细胞膜形成空隙而使外源基因进入细胞的方法．因为该方法有着转染效率高、适用范围广的特点，所以本实验小组对于转染难度较大的人"#Ｔ细胞采用电转染方法使之永生化．本研究使用目前文献报道较多的ＬＯＮＺＡ公司的电转染仪器进行电转染，将可以抑制端粒缩短的人端粒酶逆转录酶亚单位基因ｈＴＥＲＴ和Ｔｅｔ－ｏｎ诱导表达系统共同导入人"#Ｔ细胞，经强力霉素６０５内蒙古大学学报（自然科学版）２０１２年诱导后，ｈＴＥＲＴ基因能够表达．本实验目前只在ＤＮＡ和ＲＮＡ两个水平上进行了初步鉴定，并且对电转染后细胞的生长状态只作了初步观察，正常未经转染的人"#Ｔ细胞，经ｐａｎ－ａｎｔｉ"#ＴＣＲ的抗体体外刺激后，能够在体外连续培养至２８天，以后便迅速凋亡，无细胞克隆团存在．在本实验中，经电转染的人"#Ｔ细胞在体外可以连续培养至第５６天，并且在大量凋亡细胞附近有明显的细胞克隆团存在，说明这些细胞的生长状态可能发生了一定的变化．本实验对蛋白水平转录产物的鉴定还未完成，对转染后细胞的核型及生长曲线等生理指标尚未进行鉴定，并且在去除强力霉素的诱导后该基因是否停止表达还有待进一步鉴定．通过使用文献报道的两个不同的电转染程序、设置不同的强力霉素诱导浓度、选择电转染后细胞培养所用血清类型及浓度大小，本实验小组认为对人"#Ｔ细胞进行电转染的优化条件是：优先使用Ｔ－２３电转染程序，利用浓度为６００ｎｇ／ｍＬ的强力霉素诱导表达和使用１０％的志愿者本人的血清进行培养．在电转染刚刚结束时使用志愿者本人的血清来培养细胞，更利于经受电击创伤的细胞存活下来，细胞的死亡率更低，生长状态更好．这与文献中报道的相似〔８〕．本研究中使用的Ｔｅｔ－ｏｎ诱导表达系统为以后人"#Ｔ细胞的临床应用打下了基础；此外，本研究为原代淋巴细胞的电转染研究提供了一定借鉴．３ 结论用电转染方法可以将外源ｈＴＥＲＴ基因转染入人"#Ｔ细胞，电转染程序Ｔ－２３比Ｔ－２０的转染效率更高；经鉴定，转入的基因能够整合到人"#Ｔ细胞基因组ＤＮＡ中，并且在６００ｎｇ／ｍＬ强力霉素的诱导下可以有效表达．在培养电转染后的人"#Ｔ细胞时，使用１０％志愿者本人的血清比使用１０％胎牛血清更有利于电击后细胞的存活．本实验为以后使用电转染方法建立人"#Ｔ细胞永生化细胞系奠定了基础．参考文献：［１］ Ｈａｙｆｌｉｃｋ Ｌ，Ｈａｙｆｌｉｃｋ Ｐ Ｓ，Ｍｏｏｒｈｅａｄ．Ｔｈｅ ｓｅｒｉａｌ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｉｐｌｏｉｄ ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，１９６１，２５（３）：５８５－６２１．［２］ Ｂｏｄｎａｒ Ａ Ｇ，Ｏｕｅｌｅｔｔｅ Ｍ，Ｆｒｏｌｋｉｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｌｉｆｅ－ｓｐａｎ ｂｙ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｉｎｔｏ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２７９（５３４９）：３４９－３５２．［３］ Ｋｉｔａｇａｗａ Ｍａｓａｅ，Ｏｇａｗａ Ｉｋｕｋｏ，Ｓｈｉｍａ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃ ａｄｅｎｏｍａ ｃｅｌｌｓｂｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈＴＥＲＴ ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００７，３１（２）：３３９－３４４．［４］ 刘学强，杨辉，何家全，等．ｈＴＥＲＴ基因转染人神经干细胞向永生化细胞转变实验研究［Ｊ］．中华神经外科疾病研究杂志，２００６，５（１）：１３－１５．［５］ Ｈｕａｎｇ Ｑｉｎ，Ｃｈｅｎ Ｍｅｉｚｈｅｎ，Ｌｉａｎｇ Ｓｉｔａｉ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ－ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ－ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｍｅｃｈ Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ，２００７，１２８（１）：２５－３０．［６］ Ｃｈｕ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｈａｙａｋａｗａ Ｈｉｒｏｓｈｉ，Ｂｅｒｇ Ｐａｕｌ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈＤＮＡ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８７，１５（３）：１３１１－２６．［７］ 王伟佳，张秀明，王前，等．急性早幼粒白血病ＨＬ６０细胞电转染条件的优化［Ｊ］．中国生物工程杂志，２０１０，３０（４）：７７－８２．［８］ Ｓｃｈｎｏｏｒ Ｍ，Ｂｕｅｒｓ Ｉ，Ｓｉｅｔｍａｎｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＨＰ－１ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＪＩＭ，２００９，３４４（２）：１０９－１１５．（责任编委 李光鹏）７０５第５期庞永胜等 ｈＴＥＲＴ基因电转染人"#Ｔ细胞建立可诱导的永生化细胞系Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ Ｈｕｍａｎ"#Ｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈｈＴＥＲＴＧｅｎｅｓ ｂｙ ＥｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＰＡＮＧ Ｙｏｎｇ－ｓｈｅｎｇ，ＨＥ Ｗｅｉ，ＷＡＮＧ Ｈａｏ，ＣＵＩ Ｌｉａｎ－ｘｉａｎ（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００００５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍ ｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｏｎ ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００００５，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ"#Ｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｈＴＥＲＴｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｐＴｅｔ－ｏｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｅａｌｔｈｙ ｄｏ－ｎｏｒｓ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｏｒ ７ｄａｙｓ，ｈｕｍａｎ"#Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ．Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ"#Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ ｈｉｇｈｅｒ 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ｂｅｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｈＴＥＲＴｇｅｎｅ；ｈｕｍａｎ"#Ｔ ｃｅｌｌ；ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ；ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ８０５内蒙古大学学报（自然科学版）２０１２年。