EB病毒永生化细胞模型

◆ 1997年世界卫生组织在国际抗癌联盟年会上
把EBV归类为第一类致癌物（特别是鼻咽癌） 。
二、EB病毒携带者与鼻咽癌病人 血清中EBV抗体的不同
◆ EBV血清学诊断利用NPC的一个特征，即
患者多种EBV抗体的水平较非患者高（Werner Henle et al.,1976.）。
◆ EBV血清学诊断已用于NPC高危人群的筛
1、病人的肿瘤细胞中隐匿着EB病毒
◆ 证据（1）：
1969年de-the从鼻咽癌活检培养的类淋 巴细胞中分离出EB病毒。 国内也已经从鼻咽癌组织培养所建立的 类淋巴母细胞株中证明带有EB病毒壳抗原 （VCA）和早期抗原（EA），并在电镜下找 到了典型的疱疹病毒颗粒，其形态与EB病 毒相同。
LCLs在NO-SCID小鼠腹 腔 内 成 瘤 肿瘤发生数（p>0.05）
细胞株 NO-SCID 小鼠（只） 肿瘤发生的 鼠数（只） LCL1-5 LCL2-5 LCL3-5 LCL4-30 LCL5-30 4 4 4 5 5 4 4 3 5 5 腹 腔 内 成 瘤 实验20天时 小鼠腹腔触诊 腹腔柔软 腹腔柔软 腹腔柔软 可触及腹腔包块 可触及腹腔包块 实验30天时小鼠 腹腔触诊 可触及腹腔包块 可触及腹腔包块 可触及腹腔包块 腹壁明显隆起 腹壁明显隆起
◆溶解性感染(lytic infection)
在EBV潜伏感染的淋巴细胞中有小部分（约15%～20%）出现溶解 性感染，溶解性感染出现三个时相（phase）。 立即早期: 表达Zta(ZEBRA)、EBNA1等 早期: 表达EA(D)、EA (R) 、 EBNA1等 晚期: 表达VCA、EBNA1等
1、病人的肿瘤细胞中隐匿着EB病毒
◆ 证据（2）：
Kottaridis SD等（1996年）认为鼻咽 癌患者血清中抗EBNA的水平反映肿瘤的大 小 。[Anticancer Res,1996,16(2):785-789] Vera-Sempere FJ等（1996年）采用巢 式PCR和免疫组化分析说明了不论组织学 类型，鼻咽癌中均有EB病毒感染。
通过对细胞的适当处理使其在保留原 来细胞某些特性的前提下无限增殖。由于 可以用于长期稳定的保存疾病相关信息， 便于多年后开展回顾性对比研究，从而更 有利于对疾病的病因、发病机制的阐明， 目前该技术已广泛应用于诸如白血病、鼻 咽癌、肉瘤以及登革热等多种临床疾病的 研究
本实验室长期从事EB病毒致B 淋巴细胞永生化的研究，已经成功 建立了病毒相关人外周血淋巴细胞 永生化细胞模型并开展了相关研究。
EB病毒在人类普遍易感,多种疾病相关， 如传染性单核细胞增多症、Birkitt，s淋巴 瘤、非何杰金淋巴瘤等 体外只能感染人B淋巴细胞
其致病机制仍不清楚，原因可能与 病毒在体外对大多数细胞都不易感 染有关 上皮细胞内可以表现为裂解感染， 在淋巴细胞内主要表现为潜伏感染
EB病毒是DNA病毒，其基因组是线性 双链DNA，长172Kb，由末端直接重复 序列（terminal direct repeats TR）、 内部直接重复序列(internal direct repeats IR)、DL、DR和重复序列之间 的单一序列构成
EB病毒永生化细胞模型在
人类疾病基因研究中的应用
朱 振 宇 教授 博士生导师
中山大学 中山医学院
达安基因股份有限公司
EB病毒相关人淋巴母 细胞系的蛋白质表达谱研究
国家自然基金30672358 （负责人）
1、病人的肿瘤细胞中隐匿着EB病毒
◆ 发现
EB病毒是1964年Epstein与Barr在非洲 儿童恶性淋巴瘤的瘤细胞中观察到的一种 疱疹病毒。 1966年Old等采用免疫扩散法发现鼻 咽癌病人的血清能与非洲儿童淋巴细胞的 抽提液起反应。
LCLs的LMP1基因 mRNA水平的检测, 扩增片断长度为 424bp. LCL1-5、 LCL2-5 、LCL35、LCL4-30、 LCL5-30都有 LMP1基因mRNA水 平的表达
100bp
LCLsCD19，CD20抗体的表达
正常外周血淋巴细胞 CD19阳性率为9.6%
LCLsCD19，CD20抗体的表达
一、鼻咽癌与EB病毒感染的关系 小结： 流行病学、血清学和分子生物学的资
料证实, EBV感染与NPC有密切关系。
◆鼻咽癌患者癌细胞中证实有EB病毒的DNA，
经原位杂交，多数癌细胞呈EBERs阳性、核抗原 （EBNA-1）阳性。
◆ 鼻咽癌患者肿瘤细胞中有EB病毒，血清有一
套抗EB病毒的抗体，血清中的EBV抗体水平普遍 升高。
1、 EB病毒的潜伏感染
上皮细胞中病毒复制→循环中的B淋巴细胞池→ 长期潜伏感染 ↑ ↑ 如果感染了无复制缺陷突变的病毒 ↑ EB病毒→感染口咽上皮细胞 ↑ 如果感染了复制缺陷突变的病毒 ↑ ↓ ↑ 待上皮细胞增生后→个别细胞死亡→EB病毒
引自: J Immmunol. 2005; 17498:4972-8
LCLs端粒酶活性和NOD-SCID小鼠体内成瘤的关系
2、两种形式的EB病毒感染
◆潜伏性感染(latent infection)
I型潜伏性感染: 表达EBNA1，病征为 Burkitt 淋巴瘤 II型潜伏性感染:表达EBNA1和LMP1、LMP2A、LMP2B，病征为Hodgkin 淋巴瘤、鼻咽癌、鼻型 NK/T-细胞淋巴瘤、 T-细胞淋巴瘤 III型潜伏性感染:表达EBNA1、EBNA2、EBNA3、EBNA4、EBNA5、 EBNA6，病征为传染性单核细胞增多症、移植后淋巴 组织增生性疾病
◆EBNA-1 是在所有不同EBV感染细胞中都出现的唯一抗原。
EBNA 1 IgA 的抗体水平 在NPC患者中高于正常的EBV携带者
EBNA1-IgA检测的OD值范围分布图
35 % Normal %NPC 30
25
20
%
15 10 5 0
-(0.8-0.7) -(0.6-0.5) -(0.4-0.3) -(0.2-0.1) 0-0.1 0.2-0.3 0.4-0.5 0.6-0.7 0.8-0.9
部分瘤细胞Lmp1阳性，定位于胞膜 (a×50 b×400)
B淋巴细胞标记(L26)免疫组织化学染色
b
a
瘤组织B淋巴细胞标记(L26)阳性, 定位于 胞膜。因此，肿瘤的免疫病理类型是人源B 细胞性淋巴瘤 (a×50 b×400)
五个LCLs细胞株中LCL1-5、LCL2-5、 LCL3-5检测不到端粒酶的活性，LCL430和LCL5-30则有较强的端粒酶活性
LCL1-5
CD19阳性率为97.1%
LCLsCD19，CD20抗体的表达
正常外周血淋巴细胞 CD20阳性率为12.2%
LCLsCD19，CD20抗体的表达
LCL1-5 CD20阳性率为85.3%
空白对照
结论：LCLs细胞来源于B细胞
在转化实验的初期，细胞培养瓶中 出现梭形的贴壁生长的细胞，胞体透亮， 散在分布。实验中观察发现，这种贴壁 细胞是LCLs生长的种子，但不是每个贴 壁细胞都能长出细胞克隆，其中部分细 胞渐渐死亡。大部分文献都将这种贴壁 细胞描述为感染了EBV的淋巴母细胞， 但尚未提出有力证据
OD Range
Cutoff OD?
小结
◆NPC主要表现是EBV潜伏感染伴少量溶解性感 染。 EBNA-1 是在所有不同EBV感染细胞中都出 现的唯一抗原。 ◆NPC是来源于鼻咽粘膜上皮细胞，检测上皮细 胞的分泌型IgA抗体水平对NPC较有诊断意义。 ◆ NPC的显著特征是病人血清中的EBV抗体（尤 其是IgA亚型）水平普遍升高，这种变化在NPC发 病前期将先于症状出现，借此可区分NPC与其它 EB病毒感染相关疾病或健康携带者。 ◆我们认为EBNA1/IgA抗体水平的检测对NPC高 危人群的筛查可作为早期发现鼻咽癌的有效手段 之一。
[Eur J Cancer B Oral Oncol,1996,32B(3):163-168]
2、几乎100%鼻咽非角化性癌均有EBV感染。
在我国，几乎所有四岁以上的人群均已感染 过EBV，80%以上的健康成人是EBV携带者。特 别在珠江三角洲及香港地区，是世界上NPC的高 发区。 根据中山市的肿瘤统计资料（流行病学 ）， NPC的年龄和性别的校正发病率为18.12/10万 (男：25.60 /10万；女：11.05/10万)。97%的 NPC为非角化性癌。经EBER1原位杂交（所谓 “金标准” ）证实癌细胞中有EBV感染。
Байду номын сангаас
本项目旨在通过建立稳定的携带 疾病相关信息的永生化细胞系而使珍 贵标本得以长期保存，从而为疾病相 关基因的发现和鉴定提供得力保障
细胞永生化技术路线：
培养B95.8细胞 收集EB病毒 分离外周血 淋巴细胞
病毒液和淋巴细胞共培养2小时
离心收集细胞 RPMI1640培养约2月
2000bp
600bp 500bp 400bp 300bp 200bp
1、“hit-and-run”：癌变早期有较多基 因表达，在最终的肿瘤组织中某些基因 的表达被下调或消失 2、细胞遗传学异常取代了病毒转化基因 的表达，如在Burkitt’s淋巴瘤中染色体移 位使得c-myc的表达下调 3、除B细胞以外其他类型的细胞转化或 许需要不同的病毒基因表达谱
对人类基因或基因组的研究是阐 明疾病病因、发病机理，建立新型诊 断方法，并找寻有效的个体化治疗途 径的重要环节
a
b
c
30d时处死小鼠，解剖观察瘤体。LCLs在NOD-SCID小鼠 腹腔内形成的肿瘤和周围组织粘连，累及肠系膜等。瘤 体积虽大，但仅见少量腹水，未见有肝脏、肺的转移(图 a)。发生在小鼠大腿皮下的肿瘤同样与附近的皮下组织 和横纹肌粘连(图b)。离体的瘤组织呈结节状，界限清楚， 无包膜
肿瘤组织病理学
a b
瘤组织的HE染色切片(a×50 b×400) 肿瘤细胞弥漫排列，间质纤维稀少。瘤细胞较 大，形态多样，呈现大裂-无裂混合细胞，浆样 淋巴细胞和免疫母细胞样形态，核分裂常见，可 见瘤巨细胞。胞浆丰富淡红染，核膜清楚，核染 色质呈粗颗粒状，可见1-3个大小不等的核仁
Lmp1的免疫组织化学染色
a
b
发现鉴定某些疾病相关基因的经典 路线是：提取细胞/组织的DNA或RNA ， PCR/RT-PCR后电泳，对特异性条带测序。 对于某些家族多发性疾病而言这条路线的 工作量之大是不言而喻的，因此标本的预 处理和保存就是一个不可回避的重要课题
超低温冰箱和液氮都不能很好的长 期保存标本 细胞永生化是一种使细胞获得无限 传代能力的技术
梭形的贴壁生长的细胞,胞体透亮,散在分布, 是LCLs生长的种子
LCL1-5、LCL2-5、LCL3-5、LCL4-30、 LCL5-30均能在软琼脂上生长形成集落 100倍
5株LCLs接种在22只（不包括治疗组） NOD-SCID小鼠的腹腔和右侧大腿皮下。 有21只小鼠在腹腔形成了肿瘤，腹腔肿 瘤发生率达95%；有9只小鼠在大腿皮下 形成了肿瘤，皮下的肿瘤发生率为41%。 所有的实验小鼠的存活天数都在28d以上
研究现状
目前对病毒的致病机制的了解均来源 于EB病毒在体外感染B淋巴细胞而建 立的淋巴母细胞系 其致病基因主要有细胞源性基因和病 毒的潜伏感染基因
EB病毒在B细胞内以潜伏感染方式存在， 此时，病毒基因组中只有约9种基因表达， 编码病毒核抗原（6种）以及潜伏膜蛋白 （3种）和一些非信使RNA
9种病毒蛋白对于病毒转化细胞 起到必需或重要作用 不同病理组织来源的EB病毒阳性 细胞中病毒的基因表达谱有差别（三 种假说解释）
查和对NPC可疑病例的诊断。根据从70年代后 期以来的研究结果，VCA-IgA检测通常被用于 筛查以排除NPC的诊断 ；EA-IgA检测目前被用 于NPC的确定性检测。
二、EB病毒携带者与鼻咽癌病人 血清中EBV抗体的不同
检测哪种抗体？ 检测抗体哪种类型？ 因为鼻咽癌（NPC）是来源于鼻咽 粘膜上皮细胞的低分化或未分化癌。 所 以我们可以先了解EB病毒在上皮细胞中 的潜伏感染以及两种形式的EB病毒感染 所表达的各种抗原。 各种抗原相应产生不同的特异性抗 体中哪种有代表性？