液相色谱分析仪法
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2015/11/22
㈡.色谱法分类
• 按两相的物理状态可分为： • 气相色谱法(GC): 适用于分离挥发性化合物。有 机物质中分子量小于400的采用气相色谱法分析， 此范围的物质约占有机物质总数15%~20%. • 液相色谱法(LC): 适用于分离低挥发性或非挥发 性、热稳定性差的物质。 • 分子量为400~2000的有机物质可采用液相色谱法 分析，而分子量大于2000的则须用凝胶色谱法。
固定相：将特定的液态物质涂于担体表面，或化 学键合于担体表面而形成的 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分 为 正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC);
2015/11/22
正相色谱法（ normal phase NPC ） ： 流动相的极性小于
固定液的极性。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱、 氨基柱等，代表性的流动相是正己烷。用于分离中等极性 和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 等）。吸附色谱也属于正相色谱
式中Cs、Cm分别是组分在固定相和流动相中溶 质的浓度。
2015/11/22
分配系数与组分、流动相和固定相的热 力学性质有关，也与温度、压力有关。 在不同的色谱分离机制中，K有不同的概 念：吸附色谱法为吸附系数；离子交换 色谱法为选择性系数(或称交换系数)；凝 胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用 分配系数来表示。 理论塔板数(theoretical plate numberN)— —用于定量表示色谱柱的分离效率（简 称柱效）。
2015/11/22
根据溶解性可分为： 凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography, GFC）：以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱 法。主要适合于水溶性高分子的分离。 凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography, GPC）： 以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。 主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四 氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要 用于合成高分子的分子量（分布）的测定。
2015/11/22
2. 液-液分配色谱 （liquid- liquid partition chromatography）
固定相与流动相均为液体，流动相与固定相之间应互不相 溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界 面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到 平衡时，服从于下式：
•
高效液相色谱分析法
high performance liquid chromatograph
主讲:王庆俐
feature and instrument of HPLC
一、高效液相色谱仪 HPLC 二、高效液相色谱法的特点 feature of HPLC 三、流程及主要部件 general process and main assembly of HPLC 四。固定相和流动相
2015/11/22
1. 应用了颗粒极细（一般为10μm下） 规则均匀的固定相，柱效高，分离效 率高； 2. 采用高压输液泵输送流动相，流速快， 一般试样的分析需数分钟，复杂试样 分析在数十分钟内即可完成； 3. 广泛使用了高灵敏检测器，大大提高 了灵敏度。目前，已发展了多种固定 相，有多种不同的分离模式，使高效 液相色谱法的应用范围不断扩大。
固定相：化学惰性的多孔性材料 ，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶 、无机多孔材料 , 是有一定孔径 的多孔性填料。 流动相： 在凝胶色谱中，流动相 的作用不是为了控制分离，而 是为了溶解样品或减小流动相 粘度。 2015/11/22
基本原理：按分子大小分离。小分子可以扩 散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢； 中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通 过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶 剂分子小，故在最后出峰。 常用的流动相为水、四腈呋喃等 可对相对分子质量在2000以上范围内的化 合 物按质量分离,如多肽、蛋白质、核酸 等。
Cs K= Cm
• 式中，Cs—溶质在固定相中浓度；Cm--溶质在流动相中 的浓度；在同一色谱条件下，样品中K值大的组分保留值 大；后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出 色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易 分离。
2015/11Baidu Nhomakorabea22
基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；是 根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度 不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。
2015/11/22
一、液相色谱仪器
high performance liquid chromatograph
•
目前常见的HPLC仪生产厂家 国外有Waters公司、Agilent公司 （原HP公司）、岛津公司等， 国内有大连依利特公司、上海分 析仪器厂、北京分析仪器厂等。
2015/11/22
液相色谱仪（1）
2015/11/22
液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流动 相中去，所以重现性很差，后来在此基础上发展 了一种新型固定相---化学键合固定相 。 化学键合固定相：通过化学反应将固定液（各种不同基
团）键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。在HPLC整 个应用中占80%以上。 键合固定相的载体主要是硅胶，根据在硅胶表面（具有-≡Si -- OH基团）化学反应不同可制成四种键合相： （1）硅氧碳型（ ≡Si—O—C=，硅胶与醇类发生酯化反 应）。 （2）硅碳型（ ≡Si—C= ，硅胶与卤代烷反应）。 （3）硅氮型（ ≡Si—N= ，硅胶与胺类反应）。 （4）硅氧烷型（ ≡Si —O—Si—C= ，硅胶与有机硅烷反 应）。稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广
2015/11/22
分离类型选择
choice of separation types
2015/11/22
基本概念和术语：
色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续 信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常 色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss 曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见 色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检 测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出 曲线(elution profile)。 基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达 到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一 般应平行于时间轴。
2015/11/22
化学键合固定相的特点
（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相 传质快； （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动 相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （3）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性； （4）有利于梯度洗脱；
2015/11/22
正相色谱法与反相色谱法比较表 • 正相色谱法 • 固定相极性 高～中 • 流动相极性 低～中
• 组分洗脱次序 极性小的先洗出
反相色谱法 中～低 中～高
极性大的先洗出
从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反 相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）
2015/11/22
3. 离子交换色谱 （ion-exchange chromatography）
固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶 液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应； 组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、 存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；
2015/11/22
三.高效液相色谱法的特点
feature of HPLC
特点：高压、高效、高速 高灵敏度 流动相选择范围广。
2015/11/22
• 化学键合色谱与液液分配色谱一样，也可分为 正相和反相色谱。 • 反相键合色谱采用非极性固定相，键合的基团 有C2、C4、C6、C8、C18、C22烷基和苯基。其 中最常用的是C18，又称ODS一十八烷基硅烷 键合相。所用的流动相为极性溶剂，以水为底 溶剂,再加入有机溶剂,最常用的是甲醇-水、乙 腈-水和四腈呋喃-水。 • 正相键合色谱采用极性固定相，如氨基、腈基 等极性基团；非极性或弱极性流动相，一般为 烃类溶剂，如己烷、庚烷等。
2015/11/22
按固定相性质及外形分类
• 柱色谱: 固定相装在柱管内的色谱分析法
• 纸色谱: 固定相为滤纸的色谱分析法
• 薄层色谱: 固定相压成或涂成薄膜的色谱 分析法
2015/11/22
（三）HPLC的主要分离类型和原理：
高效液相色谱法按分离机理的不同主要分为四类： 1. 液-固吸附色谱（liquid-solid adsorption chromatography） • 固定相：固体吸附剂。如硅胶、氧化铝等，较常使用的是 5～10μm的硅胶吸附剂； • 流动相：主要是非极性的烃类（如己烷、庚烷）并加入少 量极性溶剂作缓和剂（如水、甲醇）。 • 基本原理：组分在固定相吸附剂表面对不同物质吸附能力 不同使混合物分离的；吸附力越强,保留时间越长,反之,保 留时间短,。 • 适用于分离分子质量中等 （200~1000 ）的油溶性试样或 极性较小的植物色素等组分，大多数用于非离子型化合 物，。常用于分离同分异构体不适宜于分离强极性的离子 型化和物和同系物。 • 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾（离子型化合物易 产生拖尾）；
反相色谱法（ reverse phase RPC ）：流动相的极性大于固
定液的极性。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS 柱、 C18、C8 ），代表性的流动相是甲醇-水和乙腈-水或 水的缓冲液。是当今液相色谱的最主要分离模式。 适用于分离非极性和极性较弱的化合物。为控制样品在分 析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注 意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太 高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱 落。
2015/11/22
噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接 触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有 气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由 于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳 定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下 来也会产生漂移。 拖尾因子(tailing factor，T)—T＝，用以衡量色谱 峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor) 或不对称因子(asymmetry factor)。《中国药典》 规定T应为0.95~1.05。T＜0.95为前延峰，T＞ 1.05为拖尾峰。
2015/11/22
Cs Cm
保留时间(retention time，tR)——从进样开始到某 个组分在柱后出现浓度极大值的时间。 分配系数(distribution coefficient，K)——在一定温 度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定 相与流动相中的浓度之比。
Cs K＝ Cm
阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH应用：碱金属、碱土金属等离子混合物的分离；食品中 添加剂和污染物的分离；生物大分子如氨基酸、核酸等。
2015/11/22
4.体积排阻色谱 （size- exclusion chromatography） 凝胶 (具有一定大小孔隙分布 )
high performance liquid chromatograph
2015/11/22
液相色谱仪（2）
2015/11/22
液相色谱仪（3）
2015/11/22
液相色谱仪（4）
2015/11/22
高效液相色谱仪
2015/11/22
二.概论：
㈠定义： • 以液体为流动相的色谱法称为液相色法。 用常压输送流动相的方法为经典液相色谱 法，这种色谱法的柱效能低、分离周长。 高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，简称HPLC）是在经典 液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方 法。与经典的液相色谱法相比，高效液相 色谱法具有下列主要优点：
㈡.色谱法分类
• 按两相的物理状态可分为： • 气相色谱法(GC): 适用于分离挥发性化合物。有 机物质中分子量小于400的采用气相色谱法分析， 此范围的物质约占有机物质总数15%~20%. • 液相色谱法(LC): 适用于分离低挥发性或非挥发 性、热稳定性差的物质。 • 分子量为400~2000的有机物质可采用液相色谱法 分析，而分子量大于2000的则须用凝胶色谱法。
固定相：将特定的液态物质涂于担体表面，或化 学键合于担体表面而形成的 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分 为 正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC);
2015/11/22
正相色谱法（ normal phase NPC ） ： 流动相的极性小于
固定液的极性。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱、 氨基柱等，代表性的流动相是正己烷。用于分离中等极性 和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 等）。吸附色谱也属于正相色谱
式中Cs、Cm分别是组分在固定相和流动相中溶 质的浓度。
2015/11/22
分配系数与组分、流动相和固定相的热 力学性质有关，也与温度、压力有关。 在不同的色谱分离机制中，K有不同的概 念：吸附色谱法为吸附系数；离子交换 色谱法为选择性系数(或称交换系数)；凝 胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用 分配系数来表示。 理论塔板数(theoretical plate numberN)— —用于定量表示色谱柱的分离效率（简 称柱效）。
2015/11/22
根据溶解性可分为： 凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography, GFC）：以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱 法。主要适合于水溶性高分子的分离。 凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography, GPC）： 以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。 主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四 氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要 用于合成高分子的分子量（分布）的测定。
2015/11/22
2. 液-液分配色谱 （liquid- liquid partition chromatography）
固定相与流动相均为液体，流动相与固定相之间应互不相 溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界 面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到 平衡时，服从于下式：
•
高效液相色谱分析法
high performance liquid chromatograph
主讲:王庆俐
feature and instrument of HPLC
一、高效液相色谱仪 HPLC 二、高效液相色谱法的特点 feature of HPLC 三、流程及主要部件 general process and main assembly of HPLC 四。固定相和流动相
2015/11/22
1. 应用了颗粒极细（一般为10μm下） 规则均匀的固定相，柱效高，分离效 率高； 2. 采用高压输液泵输送流动相，流速快， 一般试样的分析需数分钟，复杂试样 分析在数十分钟内即可完成； 3. 广泛使用了高灵敏检测器，大大提高 了灵敏度。目前，已发展了多种固定 相，有多种不同的分离模式，使高效 液相色谱法的应用范围不断扩大。
固定相：化学惰性的多孔性材料 ，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶 、无机多孔材料 , 是有一定孔径 的多孔性填料。 流动相： 在凝胶色谱中，流动相 的作用不是为了控制分离，而 是为了溶解样品或减小流动相 粘度。 2015/11/22
基本原理：按分子大小分离。小分子可以扩 散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢； 中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通 过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶 剂分子小，故在最后出峰。 常用的流动相为水、四腈呋喃等 可对相对分子质量在2000以上范围内的化 合 物按质量分离,如多肽、蛋白质、核酸 等。
Cs K= Cm
• 式中，Cs—溶质在固定相中浓度；Cm--溶质在流动相中 的浓度；在同一色谱条件下，样品中K值大的组分保留值 大；后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出 色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易 分离。
2015/11Baidu Nhomakorabea22
基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；是 根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度 不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。
2015/11/22
一、液相色谱仪器
high performance liquid chromatograph
•
目前常见的HPLC仪生产厂家 国外有Waters公司、Agilent公司 （原HP公司）、岛津公司等， 国内有大连依利特公司、上海分 析仪器厂、北京分析仪器厂等。
2015/11/22
液相色谱仪（1）
2015/11/22
液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流动 相中去，所以重现性很差，后来在此基础上发展 了一种新型固定相---化学键合固定相 。 化学键合固定相：通过化学反应将固定液（各种不同基
团）键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。在HPLC整 个应用中占80%以上。 键合固定相的载体主要是硅胶，根据在硅胶表面（具有-≡Si -- OH基团）化学反应不同可制成四种键合相： （1）硅氧碳型（ ≡Si—O—C=，硅胶与醇类发生酯化反 应）。 （2）硅碳型（ ≡Si—C= ，硅胶与卤代烷反应）。 （3）硅氮型（ ≡Si—N= ，硅胶与胺类反应）。 （4）硅氧烷型（ ≡Si —O—Si—C= ，硅胶与有机硅烷反 应）。稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广
2015/11/22
分离类型选择
choice of separation types
2015/11/22
基本概念和术语：
色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续 信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常 色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss 曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见 色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检 测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出 曲线(elution profile)。 基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达 到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一 般应平行于时间轴。
2015/11/22
化学键合固定相的特点
（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相 传质快； （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动 相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （3）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性； （4）有利于梯度洗脱；
2015/11/22
正相色谱法与反相色谱法比较表 • 正相色谱法 • 固定相极性 高～中 • 流动相极性 低～中
• 组分洗脱次序 极性小的先洗出
反相色谱法 中～低 中～高
极性大的先洗出
从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反 相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）
2015/11/22
3. 离子交换色谱 （ion-exchange chromatography）
固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶 液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应； 组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、 存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；
2015/11/22
三.高效液相色谱法的特点
feature of HPLC
特点：高压、高效、高速 高灵敏度 流动相选择范围广。
2015/11/22
• 化学键合色谱与液液分配色谱一样，也可分为 正相和反相色谱。 • 反相键合色谱采用非极性固定相，键合的基团 有C2、C4、C6、C8、C18、C22烷基和苯基。其 中最常用的是C18，又称ODS一十八烷基硅烷 键合相。所用的流动相为极性溶剂，以水为底 溶剂,再加入有机溶剂,最常用的是甲醇-水、乙 腈-水和四腈呋喃-水。 • 正相键合色谱采用极性固定相，如氨基、腈基 等极性基团；非极性或弱极性流动相，一般为 烃类溶剂，如己烷、庚烷等。
2015/11/22
按固定相性质及外形分类
• 柱色谱: 固定相装在柱管内的色谱分析法
• 纸色谱: 固定相为滤纸的色谱分析法
• 薄层色谱: 固定相压成或涂成薄膜的色谱 分析法
2015/11/22
（三）HPLC的主要分离类型和原理：
高效液相色谱法按分离机理的不同主要分为四类： 1. 液-固吸附色谱（liquid-solid adsorption chromatography） • 固定相：固体吸附剂。如硅胶、氧化铝等，较常使用的是 5～10μm的硅胶吸附剂； • 流动相：主要是非极性的烃类（如己烷、庚烷）并加入少 量极性溶剂作缓和剂（如水、甲醇）。 • 基本原理：组分在固定相吸附剂表面对不同物质吸附能力 不同使混合物分离的；吸附力越强,保留时间越长,反之,保 留时间短,。 • 适用于分离分子质量中等 （200~1000 ）的油溶性试样或 极性较小的植物色素等组分，大多数用于非离子型化合 物，。常用于分离同分异构体不适宜于分离强极性的离子 型化和物和同系物。 • 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾（离子型化合物易 产生拖尾）；
反相色谱法（ reverse phase RPC ）：流动相的极性大于固
定液的极性。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS 柱、 C18、C8 ），代表性的流动相是甲醇-水和乙腈-水或 水的缓冲液。是当今液相色谱的最主要分离模式。 适用于分离非极性和极性较弱的化合物。为控制样品在分 析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注 意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太 高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱 落。
2015/11/22
噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接 触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有 气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由 于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳 定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下 来也会产生漂移。 拖尾因子(tailing factor，T)—T＝，用以衡量色谱 峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor) 或不对称因子(asymmetry factor)。《中国药典》 规定T应为0.95~1.05。T＜0.95为前延峰，T＞ 1.05为拖尾峰。
2015/11/22
Cs Cm
保留时间(retention time，tR)——从进样开始到某 个组分在柱后出现浓度极大值的时间。 分配系数(distribution coefficient，K)——在一定温 度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定 相与流动相中的浓度之比。
Cs K＝ Cm
阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH应用：碱金属、碱土金属等离子混合物的分离；食品中 添加剂和污染物的分离；生物大分子如氨基酸、核酸等。
2015/11/22
4.体积排阻色谱 （size- exclusion chromatography） 凝胶 (具有一定大小孔隙分布 )
high performance liquid chromatograph
2015/11/22
液相色谱仪（2）
2015/11/22
液相色谱仪（3）
2015/11/22
液相色谱仪（4）
2015/11/22
高效液相色谱仪
2015/11/22
二.概论：
㈠定义： • 以液体为流动相的色谱法称为液相色法。 用常压输送流动相的方法为经典液相色谱 法，这种色谱法的柱效能低、分离周长。 高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，简称HPLC）是在经典 液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方 法。与经典的液相色谱法相比，高效液相 色谱法具有下列主要优点：