Prescission蛋白酶制作及使用方法

Prescission蛋白酶制作及使用方法

柱下酶切用酶的制作方法

1L TB菌体用PBS重悬至35ml做高压裂解，最终40ml总量。上清用0.5ml流速，挂3-4ml柱子，PBS 漂洗30ml。用含有10%甘油的洗脱液洗脱，每管收集体积为2ml，只取主峰，可以粗略定量，也可以取百分之一的量在Akta上用上样泵来做积分定量（参考下面的积分定量方法举例）。也可以用分光光度计定量，一般可用稀释20倍定量。马上分装成0.25mg每管，可切5ml介质。

柱上酶切用酶的制作方法

亲和纯化方法同柱下酶切，洗脱液不含甘油，得到10ml左右洗脱液，浓缩10倍，再加入10ml 含有10%甘油和2mM DTT的PBS稀释，一共浓缩三次换buffer，每次浓缩时间一般在30分钟以内。最终浓缩至10mg/ml，浓缩10分钟混匀一次。尽快分装成0.25mg每管，可切5ml介质。

柱上酶切用酶的Q纯化制作方法

亲和纯化方法同柱下酶切，洗脱液不含甘油，收集后加水大于三分之一。过Q柱，AB液配方中含有10%甘油，8%B洗脱，50%B？直接洗下后积分定量，分装。

粗略定量参考

2000峰宽为10.5ml，蛋白质总量为24mg，取了12ml，浓度为2mg/ml，直接分装的话，可以用125ul 和250ul每份。

积分定量方法举例

取10ul ppase浓缩液，用本底缓冲液（PBS）稀释到500ul，用上样泵做积分定量，积分体积为325mAu*ml，可知浓缩好的蛋白质光吸收为每毫升为32.5Au，光吸收为1，浓缩好的蛋白质浓度为32.5mg/ml，一共24mg蛋白。

表达

1.取-80度保存的质粒pGEX-PPase转化BL21（DE3）感受态，涂布，37度孵箱培养12~16 h。

2.挑取单克隆到50ml LBA培养基37度培养12-15小时。

3.1%接种到1L TBA中，培养3小时，4度水浴降温，加终浓度为0.2mM的IPTG，15.3度诱导培养

18小时。

4.4000rpm离心20分钟收菌。加入PBSE（1mM EDTA）至终体积30-40ml重悬。

纯化

1．高压裂解2-3次。

2．1.5万转离心30分钟，留上清。

3．PBSS平衡5ml的GST柱，上样，PBSS漂洗，4℃放置过夜，等RNA降解，再用含有10%甘油和

0.1% Tween20的酶切buffer漂洗干净。洗脱用含10%甘油的还原性谷胱甘肽溶液，2ml每管收集，

取峰尖3*1.5ml。

4．上样泵灌盐酸胍再生柱子，重力流灌水，灌20%乙醇，4℃保存柱子。

酶切效率确定

5ul，10ul，20ul酶切PH35C蛋白3-4天，电泳检测酶切产物，全部切开了。估计10ul过夜酶切1L的培养产物足够，下次实验再做验证。

保存

用PCR管，分装50ul每管，冻存于-80度。

使用

谷胱甘肽洗脱的融合蛋白，加入1份PPase，混匀后4度过夜酶切。

缓冲液

1．10*PBSS（欧蒙基础）

配方：5包PBS粉剂（欧蒙），加入360ml 5M NaCl，定容到500ml，4℃保存。

2．500ml 2M Tris（pH8.0），500ml 2M Tris（pH7.4）

350ml水溶解121.1g Tris碱，加转子搅拌或振荡下溶解（需要10分钟左右），加浓盐酸调pH至所需值，抽滤后4℃保存。

如温度升高，可加入预冷的水降温，温度下降1度pH升高0.03。pH6.8约需盐酸160 ml，pH7.4约需盐酸70 ml，7.6约需60ml，8.0约需42ml，8.0约需40ml。

Tris缓冲液稀释10倍pH下降0.1，故如稀释为20mM使用，则pH下降0.2。

3．1L 2M Tris不调pH

800ml水溶解242.2g Tris碱，加转子搅拌，定容至1L，抽滤后4℃保存。

4．500ml 0.5 mM EDTA

将93.05g二水乙二胺四乙酸二钠加入400ml水中，加入氢氧化钠颗粒调节pH（约需10g氢氧化钠颗粒），先加入7g左右，用搅拌棒彻底搅匀，在转子搅拌下，使其大部分溶解，静置一会儿，使气泡排出，并观察沉淀量。再继续搅拌，少量加入氢氧化钠颗粒，观察pH变化，勿使其变化过快，完全溶解后，加入4℃预冷的水（此时pH升高），继续调节pH为8.0，最终定容至1L，抽滤除去杂质，避光保存于4℃。

5．10% Tween 20

2ml Tween 20，溶于20ml水，避光保存，千分之一稀释使用（根据GE资料）。

6．250ml 20*酶切buffer储存液

400mM Tris-HCl (pH 7.0-pH 8.5), 3 M NaCl, 20 mM EDTA

配方：

2M Tris-HCL 50 ml

5M NaCL 150 ml

0.5M EDTA 10 ml

工作液成分（2M Tris稀释100倍使用，pH值会下降0.2）：

20mM Tris-HCl，150mM NaCl, 1 mM EDTA

作为漂洗液，使用前添加0.1% Triton X100（或者Tween20），做为酶切液使用前添加0.01% Triton （或者Tween20）和1mM DTT。

7．100ml 20×还原性谷胱甘肽储液

成分：200mM还原型谷胱甘肽，50mM NaCl，1mM EDTA，0.01% Triton X-100（用欧蒙Tween20替代），100mM Tris（pH8.0）

50ml离心管1支，称取6.14g还原型谷胱甘肽，加20ml 5M NaCl，4ml 0.5M EDTA，0.2ml 10% Tween20再加水溶解至50ml，倒入100ml烧杯，再量取50ml 2M Tris（pH8.0），倒入100ml烧杯，搅拌溶解，滤器过滤至50ml离心管，1ml分装冻存于-20度。

8．500ml 7M盐酸胍

称取334.4g盐酸胍，加水到450ml。定容，抽滤，室温保存。

PPase信息

1．PPase是人类鼻病毒蛋白酶Human rhinovirus B从11号氨基酸（G P N T E F A L S L L R ），N端接入为BamH，尾端为EcoR。所用载体为pGEX4t

2．pGEX4t-HR14载体表达蛋白质序列

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHL YERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKL TQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGA VLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLK MFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFML YDALDVVL YMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKS SKYIAWPLQGWQA TFGGGDHPPKSDLVPRGSGGGPNTEFALSLLRKNIMTITTSKGEFTGLGIHDR VCVIPTHAQPGDDVLVNGQKIRVKDKYKLVDPENINLELTVLTLDRNEKFRDIRGFISEDLEGVDA T LVVHSNNFTNTILEVGPVTMAGLINLSSTPTNRMIRYDYATKTGQCGGVLCATGKIFGIHVGGNGR QGFSAQLKKQYFVEKQ

3．蛋白质参数

Number of amino acids: 410

Molecular weight: 46403.5