液相方法
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
50/50、40/60，由强渐弱
–流速：2ml/min
样品：
–① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) –② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) –③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)
©2007 Waters Corporation 14
实例1:改变保留因子 k'
W σ –Wtan –Wh –W3σ –W4σ –W5σ
方法
16 切线法
5.54 半峰高
9
3σ
16
4σ
25
5σ
©2007 Waters Corporation 8
α，k'，N:如何控制分离度?
©2007 Waters Corporation 9
开发方法的其它考虑因素
分离度是色谱分离中主要考虑的因素
梯度平衡时间的影响
10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱
图不重复
©2007 Waters Corporation 35
梯度平衡时间的影响
平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的
变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变 化不大因而大于这个时间时，平衡充足
平衡时间∶6分钟 平衡时间∶7分钟 平衡时间∶8分钟 平衡时间∶9分钟
=
tR2
− t0
=
k'
2
tR1 − t0 k ' 1
– α=1 时两组分分不开
改变α的途径
– 改变固定相
– 改变流动相 – 改变温度 – 改变样品的本身性质
R
∝
α −1 α
©2007 Waters Corporation 7
色谱柱的柱效 N
理论塔板数计算公式：
N = σ ⎜⎛ V1 ⎟⎞2
⎝W ⎠
系统(泵)
度 溶剂输送
系统(泵)
进样器
梯度混合器
死体积/谱带展宽体积 (无色谱柱时)
色谱柱
检测器
©2007 Waters Corporation 30
滞后体积大小的影响
滞后体积太大会引起梯度变化的延迟
– 例如∶滞后体积为 2.0ml，流速 1.0ml/min o 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题
©2007 Waters Corporation 19
离子对色谱法
在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂
– 与样品中可电离的组份形成“对离子” – 目的:在反相色谱柱上分离离子型化合物
离子对试剂的类型
– PIC A：磷酸季丁铵，适用于酸性组份 – PIC B：烷基磺酸盐，适用于碱性组份
o 烷基长度不同，形成对离子的能力不同 o 通常有：B5，B6，B7，B8 – PIC D4：磷酸二丁胺，适用于弱碱
CH3CN / Hຫໍສະໝຸດ BaiduO CH3OH / H2O
(R4N+)-
R3 N
R2 NH
O
CH3OH / 1%HAc
R O P OH
O 离子抑制
CH3CN / NaH2PO4
R NH2
CH3OH / 0.01M (NH4)2HPO4
磺酸 染料
多巴胺
可待因
苯甲酸 马来酸 磷酸地塞米松
雌酮
氢氢化化可可的的松松 对苯二二甲甲酸酸
4. Thiamine 硫胺素，VB1
©2007 Waters Corporation 22
用不同的离子对试剂
②
②④
①
③ ①
④
③
② ①④
③
色谱柱∶ μ BondaPak C18 3.9mm×300mm
溶剂∶1.MeOH/H2O,PIC-B7 2.MeOH/H2O,PIC-B5
3.MeOH/H2O,PIC-B7/B5
优点
– 单位时间的分离能力增加 – 检测灵敏度提高
缺点
– 仪器设备要求高 – 不适合某些检测方式 – 色谱柱需再生 – 定量分析的重复性较低
©2007 Waters Corporation 28
梯度洗脱的方式
高压梯度及低压梯度
溶剂 A
溶剂 A
泵A
混合器
（溶剂混合点）
比例阀（溶剂混合点） 混合器
CH2OH
N
1. Niacinamide
HO CH
CONH2
烟酰胺
HO CH HO CH
CH2
H3C N
2. Pyridoxine H3C
NNO
HO
CH2OH
CH2OH
吡哆素， VB6
N
H3C
N
O
3. Riboflavin
{ H3C
N
N
NH2 S
}+
CH2CH2OH Cl-
CH2N
CH3
核黄素， VB2
析方法
– 查文献，如CA(化学文摘) – 仪器制造商的文献，如Waters
对色谱柱有足够的了解
– 掌握分离机理，自己开发方法
充分了解自己的样品
©2007 Waters Corporation 11
参照文献方法时的注意事项
采用与文献方法相同的色谱柱(品牌,固定相,内径,长度…), 否则不能重现文献结果
R: 分离程度的量度
©2007 Waters Corporation 4
影响分离度的因素k′,α,N
分离度方程∶
R
=
⎜⎛ ⎝
k
k' '+
1
⎟⎞ ⎠
⎜⎛ ⎝
α
−
α
1
⎟⎞ ⎠
⎜⎜⎝⎛
N 4
⎟⎟⎠⎞
– k′是保留因子,表达了被分离组分与柱填料
的作用强弱
– α 是分离因子,描述两个组分分离的好坏程度,
实例1谱图
①
①
②
50/50
② ③
③ 60/40
① 40/60
② ③
©2007 Waters Corporation 15
实例2:改变选择性(α)
通过改变流动相改变选择性
– 同样强度的不同溶剂
①
②
③
改变色谱柱的影响会更大
①THF / H 2O，28 : 72 ②MeOH / H 2O，58 : 42 ③CH 3CN / H 2O，38 : 62
液相色谱教程
液相色谱方法开发
©2007 Waters Corporation
开发液相色谱方法
液相色谱方法即液相色谱实验所需的基本参数,包括以 下各项内容:
— 流动相:种类及配比(等度或梯度) — 固定相:色谱柱类型及内径,长短 — 流动相输送系统参数:流速 — 检测器参数:检测波长,灵敏度等 — 温度控制 — 进样量
Curve 6 30 - 100%
Curve 7 30 - 100%
Curve 8 30 - 100%
©2007 Waters Corporation 33
梯度曲线的变化∶凸线
Curve 6 30 - 100%
Curve 5 30 - 100% Curve 4 30 - 100%
©2007 Waters Corporation 34
溶剂 B
泵B
溶剂 B
A 高压梯度
泵
B 低压梯度
©2007 Waters Corporation 29
梯度滞后:系统体积的影响
低
压 梯
B AC
度
D
比例阀
溶剂输送 系统(泵)
阻尼器 混合器
进样器
色谱柱
检测器
滞后(系统)体积
注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路
滞后(系统)体积
高 溶剂输送
压 梯
– 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）之间
©2007 Waters Corporation 17
离子抑制色谱实例
在乙腈/水及pH=7时， 多数保留时间很短，无 法完全分离。
CHO
COONa
CHO
COOH
OCH3 OH
1
2
OCH3
3
4
©2007 Waters Corporation 18
常用缓冲液及其pH值
©2007 Waters Corporation 20
离子对色谱机理
O
O加
(C~C)n
流动相加0.01M的 C 4
+
N
C4
-
OH
C4
C4
PIC-A试剂
-
SO3
+
Na
(C~C)n
C4 -
SO3
+
N
C4
C4 C4
Si O Si C 18
O
O
©2007 Waters Corporation 21
离子对色谱分析水溶性维生素
名
称
Phosphoric Acid 磷酸
Formic Acid 甲酸
Succinic Acid 琥珀酸
Acetic Acid 乙酸
Succinic Acid 琥珀酸
Phosphoric Acid 磷酸
Boric Acid 硼酸
Phosphoric Acid 磷酸
pKa 2.12 (pKa1) 3.75 4.19 (pKa1) 4.75 5.57 (pKa2) 7.21 (pKa2) 9.24 12.32 (pKa3)
先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能高纯度的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k′值改变保留值 调节α值改变选择性 调节柱长度改变柱效及分离速度
请记住∶ 每次改变一个参数
©2007 Waters Corporation 13
反相色谱方法开发实例
色谱条件∶
–色谱柱：C18，4mm×30mm –流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、
©2007 Waters Corporation 16
离子抑制色谱
在稀溶液中: HAc
H+ + Ac-
离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离
适用于弱酸性化合物的分离
– 降低流动相的pH值，使样品降低离子化 – 使用硅胶基质C18填料
使用条件应在填料基质的安全范围内
注意不同HPLC系统体积的差异,若系统体积不同,则不能 重现文献的梯度方法
注意尽量避免流动相对色谱柱的损害(pH,缓冲盐的种类 和浓度…)
注意文献方法发表的年代背景,不要机械照搬,而应立足创 新,尽可能采用HPLC新技术
©2007 Waters Corporation 12
一般的具体步骤
以上参数即构成一个具体的HPLC方法,亦称 色谱条件
©2007 Waters Corporation 2
评价液相色谱方法的标准
问题∶什么样的分离结果是好的?分离度?
©2007 Waters Corporation 3
什么是液相色谱的分离度？
分离度的定义：
R
=
v2 −v1
1 2
(w
2
+w1)
除分离度之外,在开发色谱方法时,以下几个因素也都要考
虑:
– 灵敏度 – 载样量 – 分析速度 – 溶剂损耗
– 成本 – 容易使用 – 色谱柱寿命 – 效率
©2007 Waters Corporation 10
方法开发:第一步干什么?
想办法得到各种信息
– 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分
色谱仪，以适应梯度实验
©2007 Waters Corporation 31
梯度洗脱的可变参数
A,B液的化学特性 和配比
梯度的起终点及陡度 梯度变化的路径
(梯度曲线形状)
1 2 3 45
6 7 8 9 10 11
©2007 Waters Corporation 32
梯度曲线的变化∶凹线
– 对微柱色谱影响更大，如上例，流速0.1ml/min o 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受
滞后体积的不同会使方法转换麻烦
– 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现
普通HPLC的滞后体积为2~4ml
– 对分析型HPLC没有影响 – 对作微柱实验用梯度时影响较大，因此应选滞后体积小的液相
二乙脂酯，，苊苊
VB2， 肾上腺素
洁尔灭
©2007 Waters Corporation 26
什么是梯度方法
梯度:流动相的组成或流速随洗脱时间的变化而变化
90/10, CH 3CN/H 2O 80/20, CH 3CN/H 2O
©2007 Waters Corporation 27
梯度洗脱的特点
吡哆素(VB6) 烟酰胺
4ml
B5 50%(B5/B7) B7
©2007 Waters Corporation 24
离子对色谱的优缺点
优点:
– 可用反相色谱分析离子 – 离子和中性化合物可在同一次色谱分析中完成 – 通过选择不同的PIC试剂可使选择性得到惊人的改善,特别是对中
性和离子型溶质
缺点:
是化学因素
– N 是理论塔板数,描述色谱峰的谱带展宽程度
©2007 Waters Corporation 5
保留因子 k′
与峰高的关系
与R的关系
改变k'值的方法∶
– 调节流动相的极性、pH、离子强度等 – 梯度淋洗
©2007 Waters Corporation 6
分离因子 α
定义∶
α
1.如用PIC-B7， 在②③分开的情 况下，保留时间 太长
2.如用PIC-B5， 峰①②④分不 开
3.如用PIC-B7 加B5，各组份 分开，且保留 时间合适
©2007 Waters Corporation 23
保留体积 ml
离子对色谱 - 水溶性维生素
保留时间与PIC试剂B之间的关系
36ml 硫胺(VB1) 核黄素(VB2)
– PIC 试剂的平衡较慢
o 推荐专用色谱柱作离子对分析
– 当心 PIC 试剂在甲醇,乙腈等溶剂中沉淀 – 当心用过的离子对试剂的化学污染
©2007 Waters Corporation 25
用离子对？还是离子抑制？
PIC A 酸性物质
中性物质
PIC B 碱性物质
R SO3H O
R C OH O R O S OH O
–流速：2ml/min
样品：
–① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) –② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) –③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)
©2007 Waters Corporation 14
实例1:改变保留因子 k'
W σ –Wtan –Wh –W3σ –W4σ –W5σ
方法
16 切线法
5.54 半峰高
9
3σ
16
4σ
25
5σ
©2007 Waters Corporation 8
α，k'，N:如何控制分离度?
©2007 Waters Corporation 9
开发方法的其它考虑因素
分离度是色谱分离中主要考虑的因素
梯度平衡时间的影响
10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱
图不重复
©2007 Waters Corporation 35
梯度平衡时间的影响
平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的
变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变 化不大因而大于这个时间时，平衡充足
平衡时间∶6分钟 平衡时间∶7分钟 平衡时间∶8分钟 平衡时间∶9分钟
=
tR2
− t0
=
k'
2
tR1 − t0 k ' 1
– α=1 时两组分分不开
改变α的途径
– 改变固定相
– 改变流动相 – 改变温度 – 改变样品的本身性质
R
∝
α −1 α
©2007 Waters Corporation 7
色谱柱的柱效 N
理论塔板数计算公式：
N = σ ⎜⎛ V1 ⎟⎞2
⎝W ⎠
系统(泵)
度 溶剂输送
系统(泵)
进样器
梯度混合器
死体积/谱带展宽体积 (无色谱柱时)
色谱柱
检测器
©2007 Waters Corporation 30
滞后体积大小的影响
滞后体积太大会引起梯度变化的延迟
– 例如∶滞后体积为 2.0ml，流速 1.0ml/min o 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题
©2007 Waters Corporation 19
离子对色谱法
在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂
– 与样品中可电离的组份形成“对离子” – 目的:在反相色谱柱上分离离子型化合物
离子对试剂的类型
– PIC A：磷酸季丁铵，适用于酸性组份 – PIC B：烷基磺酸盐，适用于碱性组份
o 烷基长度不同，形成对离子的能力不同 o 通常有：B5，B6，B7，B8 – PIC D4：磷酸二丁胺，适用于弱碱
CH3CN / Hຫໍສະໝຸດ BaiduO CH3OH / H2O
(R4N+)-
R3 N
R2 NH
O
CH3OH / 1%HAc
R O P OH
O 离子抑制
CH3CN / NaH2PO4
R NH2
CH3OH / 0.01M (NH4)2HPO4
磺酸 染料
多巴胺
可待因
苯甲酸 马来酸 磷酸地塞米松
雌酮
氢氢化化可可的的松松 对苯二二甲甲酸酸
4. Thiamine 硫胺素，VB1
©2007 Waters Corporation 22
用不同的离子对试剂
②
②④
①
③ ①
④
③
② ①④
③
色谱柱∶ μ BondaPak C18 3.9mm×300mm
溶剂∶1.MeOH/H2O,PIC-B7 2.MeOH/H2O,PIC-B5
3.MeOH/H2O,PIC-B7/B5
优点
– 单位时间的分离能力增加 – 检测灵敏度提高
缺点
– 仪器设备要求高 – 不适合某些检测方式 – 色谱柱需再生 – 定量分析的重复性较低
©2007 Waters Corporation 28
梯度洗脱的方式
高压梯度及低压梯度
溶剂 A
溶剂 A
泵A
混合器
（溶剂混合点）
比例阀（溶剂混合点） 混合器
CH2OH
N
1. Niacinamide
HO CH
CONH2
烟酰胺
HO CH HO CH
CH2
H3C N
2. Pyridoxine H3C
NNO
HO
CH2OH
CH2OH
吡哆素， VB6
N
H3C
N
O
3. Riboflavin
{ H3C
N
N
NH2 S
}+
CH2CH2OH Cl-
CH2N
CH3
核黄素， VB2
析方法
– 查文献，如CA(化学文摘) – 仪器制造商的文献，如Waters
对色谱柱有足够的了解
– 掌握分离机理，自己开发方法
充分了解自己的样品
©2007 Waters Corporation 11
参照文献方法时的注意事项
采用与文献方法相同的色谱柱(品牌,固定相,内径,长度…), 否则不能重现文献结果
R: 分离程度的量度
©2007 Waters Corporation 4
影响分离度的因素k′,α,N
分离度方程∶
R
=
⎜⎛ ⎝
k
k' '+
1
⎟⎞ ⎠
⎜⎛ ⎝
α
−
α
1
⎟⎞ ⎠
⎜⎜⎝⎛
N 4
⎟⎟⎠⎞
– k′是保留因子,表达了被分离组分与柱填料
的作用强弱
– α 是分离因子,描述两个组分分离的好坏程度,
实例1谱图
①
①
②
50/50
② ③
③ 60/40
① 40/60
② ③
©2007 Waters Corporation 15
实例2:改变选择性(α)
通过改变流动相改变选择性
– 同样强度的不同溶剂
①
②
③
改变色谱柱的影响会更大
①THF / H 2O，28 : 72 ②MeOH / H 2O，58 : 42 ③CH 3CN / H 2O，38 : 62
液相色谱教程
液相色谱方法开发
©2007 Waters Corporation
开发液相色谱方法
液相色谱方法即液相色谱实验所需的基本参数,包括以 下各项内容:
— 流动相:种类及配比(等度或梯度) — 固定相:色谱柱类型及内径,长短 — 流动相输送系统参数:流速 — 检测器参数:检测波长,灵敏度等 — 温度控制 — 进样量
Curve 6 30 - 100%
Curve 7 30 - 100%
Curve 8 30 - 100%
©2007 Waters Corporation 33
梯度曲线的变化∶凸线
Curve 6 30 - 100%
Curve 5 30 - 100% Curve 4 30 - 100%
©2007 Waters Corporation 34
溶剂 B
泵B
溶剂 B
A 高压梯度
泵
B 低压梯度
©2007 Waters Corporation 29
梯度滞后:系统体积的影响
低
压 梯
B AC
度
D
比例阀
溶剂输送 系统(泵)
阻尼器 混合器
进样器
色谱柱
检测器
滞后(系统)体积
注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路
滞后(系统)体积
高 溶剂输送
压 梯
– 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）之间
©2007 Waters Corporation 17
离子抑制色谱实例
在乙腈/水及pH=7时， 多数保留时间很短，无 法完全分离。
CHO
COONa
CHO
COOH
OCH3 OH
1
2
OCH3
3
4
©2007 Waters Corporation 18
常用缓冲液及其pH值
©2007 Waters Corporation 20
离子对色谱机理
O
O加
(C~C)n
流动相加0.01M的 C 4
+
N
C4
-
OH
C4
C4
PIC-A试剂
-
SO3
+
Na
(C~C)n
C4 -
SO3
+
N
C4
C4 C4
Si O Si C 18
O
O
©2007 Waters Corporation 21
离子对色谱分析水溶性维生素
名
称
Phosphoric Acid 磷酸
Formic Acid 甲酸
Succinic Acid 琥珀酸
Acetic Acid 乙酸
Succinic Acid 琥珀酸
Phosphoric Acid 磷酸
Boric Acid 硼酸
Phosphoric Acid 磷酸
pKa 2.12 (pKa1) 3.75 4.19 (pKa1) 4.75 5.57 (pKa2) 7.21 (pKa2) 9.24 12.32 (pKa3)
先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能高纯度的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k′值改变保留值 调节α值改变选择性 调节柱长度改变柱效及分离速度
请记住∶ 每次改变一个参数
©2007 Waters Corporation 13
反相色谱方法开发实例
色谱条件∶
–色谱柱：C18，4mm×30mm –流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、
©2007 Waters Corporation 16
离子抑制色谱
在稀溶液中: HAc
H+ + Ac-
离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离
适用于弱酸性化合物的分离
– 降低流动相的pH值，使样品降低离子化 – 使用硅胶基质C18填料
使用条件应在填料基质的安全范围内
注意不同HPLC系统体积的差异,若系统体积不同,则不能 重现文献的梯度方法
注意尽量避免流动相对色谱柱的损害(pH,缓冲盐的种类 和浓度…)
注意文献方法发表的年代背景,不要机械照搬,而应立足创 新,尽可能采用HPLC新技术
©2007 Waters Corporation 12
一般的具体步骤
以上参数即构成一个具体的HPLC方法,亦称 色谱条件
©2007 Waters Corporation 2
评价液相色谱方法的标准
问题∶什么样的分离结果是好的?分离度?
©2007 Waters Corporation 3
什么是液相色谱的分离度？
分离度的定义：
R
=
v2 −v1
1 2
(w
2
+w1)
除分离度之外,在开发色谱方法时,以下几个因素也都要考
虑:
– 灵敏度 – 载样量 – 分析速度 – 溶剂损耗
– 成本 – 容易使用 – 色谱柱寿命 – 效率
©2007 Waters Corporation 10
方法开发:第一步干什么?
想办法得到各种信息
– 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分
色谱仪，以适应梯度实验
©2007 Waters Corporation 31
梯度洗脱的可变参数
A,B液的化学特性 和配比
梯度的起终点及陡度 梯度变化的路径
(梯度曲线形状)
1 2 3 45
6 7 8 9 10 11
©2007 Waters Corporation 32
梯度曲线的变化∶凹线
– 对微柱色谱影响更大，如上例，流速0.1ml/min o 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受
滞后体积的不同会使方法转换麻烦
– 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现
普通HPLC的滞后体积为2~4ml
– 对分析型HPLC没有影响 – 对作微柱实验用梯度时影响较大，因此应选滞后体积小的液相
二乙脂酯，，苊苊
VB2， 肾上腺素
洁尔灭
©2007 Waters Corporation 26
什么是梯度方法
梯度:流动相的组成或流速随洗脱时间的变化而变化
90/10, CH 3CN/H 2O 80/20, CH 3CN/H 2O
©2007 Waters Corporation 27
梯度洗脱的特点
吡哆素(VB6) 烟酰胺
4ml
B5 50%(B5/B7) B7
©2007 Waters Corporation 24
离子对色谱的优缺点
优点:
– 可用反相色谱分析离子 – 离子和中性化合物可在同一次色谱分析中完成 – 通过选择不同的PIC试剂可使选择性得到惊人的改善,特别是对中
性和离子型溶质
缺点:
是化学因素
– N 是理论塔板数,描述色谱峰的谱带展宽程度
©2007 Waters Corporation 5
保留因子 k′
与峰高的关系
与R的关系
改变k'值的方法∶
– 调节流动相的极性、pH、离子强度等 – 梯度淋洗
©2007 Waters Corporation 6
分离因子 α
定义∶
α
1.如用PIC-B7， 在②③分开的情 况下，保留时间 太长
2.如用PIC-B5， 峰①②④分不 开
3.如用PIC-B7 加B5，各组份 分开，且保留 时间合适
©2007 Waters Corporation 23
保留体积 ml
离子对色谱 - 水溶性维生素
保留时间与PIC试剂B之间的关系
36ml 硫胺(VB1) 核黄素(VB2)
– PIC 试剂的平衡较慢
o 推荐专用色谱柱作离子对分析
– 当心 PIC 试剂在甲醇,乙腈等溶剂中沉淀 – 当心用过的离子对试剂的化学污染
©2007 Waters Corporation 25
用离子对？还是离子抑制？
PIC A 酸性物质
中性物质
PIC B 碱性物质
R SO3H O
R C OH O R O S OH O