液相色谱基础知识及方法开发
液相色谱教程液相色谱方法开发
液相色谱教程液相色谱方法开发液相色谱(Liquid Chromatography，简称LC)是一种常用的分离和分析技术，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
液相色谱方法的开发是为了解决特定问题和满足特定需求而进行的，本文将介绍液相色谱方法开发的一般步骤和注意事项。
液相色谱方法的开发步骤如下：1.确定分离目标：首先确定需要分离和分析的目标化合物，包括确定化合物的物理化学性质和分离特性等。
2.选择色谱柱：根据分离目标，选择合适的色谱柱。
色谱柱的选择应考虑样品的性质、分离机理、应用要求等因素。
3.选择流动相和梯度条件：根据分离目标，选择合适的流动相（包括溶剂和缓冲剂等）和梯度条件（包括流动相的组成和梯度程序等）。
4.优化色谱条件：通过改变流动相组成、流速、柱温等参数，优化色谱条件，达到最佳分离效果。
5.建立分析方法：根据样品的特点和分析需求，建立分析方法。
包括确定检测器的波长或离子选择器、设置进样量和检测浓度范围等。
6.方法验证：对开发的液相色谱方法进行验证，包括准确度、精密度、线性范围、检出限等指标的确定。
液相色谱方法开发过程中需要注意的事项如下：1.样品制备：样品的制备要充分考虑到样品的性质和分析方法的要求，如需要进行前处理、提取、洗脱、浓缩等。
2.色谱柱保养：液相色谱柱的保养对于保证色谱方法的重复性和稳定性至关重要。
包括定期清洁、适当的保存和使用。
3.流动相准备：流动相的配制要严格按照要求，注意流向的调整、PHA值的调节、气泡和杂质的排除等。
4.柱温控制：柱温对色谱分离的效果有很大影响，需要根据分析需求对柱温进行控制和调节。
5.检测器选择：根据分析的目标和样品的特性，选择合适的检测器，如紫外检测器、荧光检测器、质谱检测器等。
6.数据处理：对色谱结果进行正确的数据处理和解释，包括峰面积计算、峰识别和归一化等。
总结来说，液相色谱方法的开发是一个系统的工程，需要综合考虑样品特性、分析需求和分离机理等因素。
液相色谱基础知识
原理： ☼ 原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电 导变化来测定电离物质含量。 导变化来测定电离物质含量。广泛应用于 离子色谱法。 离子色谱法。
☼ 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，
梯度洗脱。 梯度洗脱。 缺点：对温度变化敏感，每升高1℃, ℃,电导率增加 ☼ 缺点：对温度变化敏感，每升高 ℃,电导率增加 2%-2.5%。
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
☼鬼峰的出现
洗脱曲线
☺水/MeOH梯度 ODS ODS柱 1ml/min在 0~10Mins内 MeOH 0~100% 线性变化后 保持15Min
鬼峰
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
在微量分析和梯度洗脱时建议使用HPLC级溶剂和纯化水 级溶剂和纯化水 在微量分析和梯度洗脱时建议使用
0.001~9.999
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
柱塞和密封圈的关系
水 出口单 向阀 密封圈 吸液移动 柱塞杆 送液移动 入口单 向阀 泵头清洗流路 流动相
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
手动进样阀7725i原理
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
☺无在线脱气机应注意：
1 每天脱气 2 如使用氦脱气，对混合好的溶剂脱气时间不能过长。
液相色谱基础知识
梯度形式的选择
洗脱模式：高压梯度
低压梯度 用两台输液泵将两种流动相混合并进入系统 常压下用比例阀将流动相混合，单泵进入系统
☺线性梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成线性变化（增或减） ☺指数梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成指数关系（增或减） ☺折线梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间无规则变化
《液相色谱方法开发》课件
液相色谱法可用于分析有机化合物、金属离子、手性化合物等，具有 高分离度和高灵敏度的优点。
生物医药
液相色谱法在生物医药领域中应用广泛，如蛋白质、多肽、核酸等生 物大分子的分离和纯化，以及药物成分的分析和质量控制。
环境监测
液相色谱法可用于环境样品中有机污染物的检测和分析，如水体、土 壤、大气等中的有害物质。
便携式检测器
开发适用于现场快速检测的便携式检测器，满足实时监测需求。
THANKS
感谢观看
REPORTING
02
它是一种高效、高分辨率的分离 技术，广泛应用于化学、生物、 医药等领域。
液相色谱法的原理
液相色谱法的原理基于物质在固定相和流动相之间的分配平 衡，不同组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，因此 会按照一定顺序流出色谱柱。
通过检测器检测各组分的浓度或质量，可以得到各组分的分 离效果和含量。
液相色谱法的应用领域
食品检测
液相色谱法可用于食品中添加剂、农药残留、重金属等有害物质的检 测和分析，保障食品安全。
PART 02
液相色谱方法开发流程
REPORTING
确定分析目标
明确分析目的
确定液相色谱分析的目标，例如分离 、纯化、检测或鉴定某物质。
了解样品特性
了解待分析样品的性质、组成和结构 ，以便选择合适的色谱条件和固定相 。
选择色谱柱和流动相
选择固定相
根据样品性质和分离需求选择合适的固定相，如硅胶、聚合物等。
确定流动相
选择合适的流动相，如有机溶剂、缓冲液等，以实现有效的样品分离。
优化色谱条件
调整流动相比例
通过调整流动相中各组分的比例，优化样品在固定相上的保留行为。
液相色谱的方法开发
液相色谱的分类和应用领域
正相色谱和反相色谱
根据固定相与流动相的极性差异进行分类， 广泛应用于药物分析、环境监测等领域。
离子交换色谱
利用固定相上的固定离子与流动相中的离子 进行交换，用于分离带电化合物。
手性色谱
利用固定相上的手性选择性分离手性化合物， 广泛应用于药物研发等领域。
其他应用领域
包括食品分析、生物分析、环境监测等多个 领域。
液相色谱的方法开发
液相色谱是一种用于分离和分析化合物的重要技术。本演示文稿将介绍液相 色谱的原理、分类和应用领域，并深入讨论该方法的开发步骤、挑战和解决 方案，以及方法验证和验证参数。
什么是液相色谱
液相色谱是一种基于液相的分离技术，利用不同化学性质的化合物在流动相 和固定相之间的相互作用力差异来进行分离。
5
数据处理和解释
使用适当的数据处理方法，对得到的色谱图进行分析和解释。
液相色谱方法开发的挑战和解决方案
分离性能和选择性的优化
针对复杂样品，优化分离条件以实现高效的 分离和良好的选择性。
方法可重复性和可扩展性
确保方法的重复性和可靠性，使其适用于不 同样品和不同实验环境。
分析时间和分析准确度的平衡
在保证分析准确度的前提下，通过优化分析 条件降低分析时间。
液相色谱方法开发的步骤
1
样品准备
准备样品，包括前处理和提取等步骤，以使其适合进行液相色谱分析。
2
色谱柱选择
根据待分离化合物的性质选择合适的色谱柱，如C18柱、离子交换柱等。
3
流动相选择和优化
选择合适的流动相，调整流动相的组成、pH值和流速等参数，优化分离效果。
4
柱温和压力控制
优化柱温和压力，平衡分析时间和分离效果。
液相色谱分析方法建立-系列一基本理论及色谱介绍
硅 胶 的 溶 解 曲 线
1 2 3 4 5 6 7 8 9 p H
硅胶表面键合相的水解（PH<2）
O
OH
Si
O
+
O
“Column Bleed”
H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH3
Cl
CH3
O
+ H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH
O 硅胶表面未被键合的酸性硅羟基将会与被分析物相互作用，特别是在 中性条件下会对强碱性化合物产生严重的峰形拖尾。
O 封尾工艺使得表面残余的硅羟基被进一步的消除，为小分子所取代。 O 封尾工艺能促使色谱柱对极性和碱性化合物的分离具有良好的峰形。
50
色谱柱的pH值
O 填料的pH稳定性 O 硅胶填料 pH：2-8 O 聚合物填料 pH：2-12 O 杂化硅胶填料 pH：2-12
O
Low pH (hydrolysis of ligand)
O Si
O
O
OH
+
H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH3
HO
CH3
硅胶的溶解（PH>8）
Nucleophilic attack
• Complete dissolution of Silica
• Catastrophic column failure
蒸发光散射
任何挥发性低于流动相的样 品均能被 检测
可检测所有物质。
(干货)液相色谱基础知识大全
一、基本原理高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。
高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。
在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。
高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。
二、高效液相色谱分析原理（1）、高效液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
（2）、高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。
液相色谱的方法开发
分离机理及色谱柱
选HPLC参数时的基本考虑
溶解度 - 选择流动相的条件 分子量 - 在样品预处理或GPC分析时有用 官能团 - 有否离子化基团? 保留特性如何? 样品的基质 - 考虑如何前处理 在基质中样品的含量 - 分析、制备都考虑 检测特性 - 有否紫外吸收? 荧光? 找出样品中不同组份之间的差异 摸索条件的重要线索
不同色谱柱的含碳量
色谱柱 C% k‘苊 (50/50的乙腈/水) Symmetry C18 19 17 Zorbax ODS 17 15.7 LiChrosorb RP-18 15 10.3 Symmetry C8 12 12.5 Resolve C-18 12 12.4 Ultrasphere ODS 11 11.3 Partisil ODS-3 11 12.0 mBondpak C-18 10 7.9 Nova-Pak C-18 7 5.5
极性问题
液相色谱的分离机理
正相 反相 体积排除 离子交换 其他 不同的分离模式是不同的机理
吸附色谱的分离机理
随着样品在固定相上的吸附能力由大到小 在色谱柱上的保留由长到短
吸附色谱概述
分离基于样品的极性差异。 洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱 常用的流动相∶ 非极性有机溶剂，如己烷 乙酸等为添加剂 常用固定相∶ 硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等。
Waters不同品牌的色谱柱
Resolve 平均孔径90A，5/10m低活性硅胶 非常高的疏水性，无端基封口 有利于低保留的中性及酸性化合物分离 Delta-Pak 有100A和300A两种孔径，5/15m硅胶 中到高的疏水性，端基封口 适合于多肽、蛋白的分离及制备色谱
新一代硅胶基质的色谱柱
Symmetry 高纯度硅胶：Fe，Al，Mg等均<10ppm 孔径100A，5m球形颗粒，端基封口 超高含碳量：C18/19%，C8/12% 表面积：300 m2/g 孔体积：1mL/g 特点 好峰形，好重现性，不同的选择性，使用寿命长
液相基础知识
• 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离 技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段， 就成为色谱分析法。 • 色谱法（Chromatography）溯源
– 色谱法 色谱法又称色谱分析 色谱分析法 层析法 色谱分析、色谱分析法 层析法，是一种 色谱分析 色谱分析法、层析法 分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学 等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在 不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合 物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿 固定相移动，最终达到分离的效果。
－－经典的液相色谱 液相色谱法，流动相在常压下输送，所 液相色谱 用的固定相柱效低，分析周期长。 －－而现代液相色谱 液相色谱法引用了气相色谱的理论，流 液相色谱 动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的 填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色 液相色 谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后 连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检 测。因此，高效液相色谱 液相色谱具有分析速度快、分离 液相色谱 效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、 高速、高效或现代液相色谱 液相色谱法。 液相色谱
缺乏灵敏度 － 和其他检测器相比，RI检测器一般灵敏度较低 和其他检测器相比， 检测器一般灵敏度较低
0.14 0.12 0.10 AU 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 15.00 10.00 5.00 0.00 -5.00 -10.00 -15.00 -20.00 -25.00 -30.00
返回
液相色谱的检测器
• 常规检测器
– 示差折光检测器（Refractive Index） – 紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis） – 荧光检测器（Fluorescence） – 蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering） – 其他检测器（Other Detectors）
液相色谱基础知识
分辨率是色谱分离中主要考虑的因素
在开发色谱方法时，有很多因素是很重要
的。除分辨率之外，以下几个因素都要考
虑。
灵敏度
成本
载样量
容易使用
分析速度
色谱柱寿命
溶剂损耗
效率
Good Column
Inject
4.4% height
W1.44
Bad Column
提高柱效的方法
色谱柱本身
减小填料的颗粒度 找到最佳的流速(根据不同内径) 合适的温度 降低溶剂的粘度 增加柱长
其他影响柱效的因素
柱外效应
连接管路 进样器、检测器
进样体积 进样量
容量因子 k'
与峰高的关系
与R的关系
示差折光 电导
响应
通用 选择性
灵敏度 毫克 纳克
线性范围 104
106
流速敏感 是
是
温度敏感 是
是
梯度淋洗 不可 有限制
紫外 荧光 电化学
选择性 选择性 选择性
纳克 Picogram Picogram
105 10~103
106
否
否
是
否
否
是
可以 可以 脉冲的可以
色谱条件的优化
分离度
速度
容量
开发液相色谱方法
进样器
液相色谱的应用（一）
“分析型液相色谱” 定性及定量分析
灵敏度的要求 样品的复杂性 样品量的要求 精度及准确度的要求 容易使用
液相色谱的应用（二）
“制备型液相色谱” 分离及纯化
化合物的稳定性 样品的复杂性 制备量的要求 纯度的要求，及纯度的鉴定 方法的安全性
开发液相色谱方法
问题∶什么样的分离结果是好的?分辨率?
HPLC(液相色谱)常识及疑难详解(附实际操作图解)
1 液相色谱基础知识1.1 液相色谱名词术语Mobile phase：流动相，在色谱柱中存在着相对运动的两相，一相为固定相，一相为流动相。
流动相是指在色谱过程中载带样品（组分）向前移动的那一相。
Stationary phase：固定相，柱色谱或平板色谱中既起分离作用又不移动的那一相。
Gradient elution: 梯度洗脱,一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比, 使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。
Detection wavelength：检测波长，retention time：保留时间，被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间Peak:峰Peak Base：峰基线，经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴Peak Height：峰高，色谱峰顶点至峰底的距离。
Peak Width：峰宽，色谱峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离Peak Width at Half Height：半峰高宽Peak Area：峰面积Tailing Peak: 后沿较前沿平缓的不对称峰Leading Peak:前沿较后沿平缓的不对称峰Ghost Peak: 假峰，并非由试样所产生的峰Baseline Drift:基线漂移Baseline Noise:基线噪音Band Broadening:组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象. 1.2 流动相1.2.1 流动相类型正相液相色谱流动相：一般正相色谱固定相极性大于流动相极性，采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），极性小的组分先出柱。
反相液相色谱流动相：一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
液相色谱基础知识
梯度洗脱形式： 梯度洗脱形式：
线性梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化和时间成线性比例 指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈指数关系 折线梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈跳跃关系
梯度洗脱形式的选择
液相色谱基础知识
梯度洗脱： 梯度洗脱：
优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和 提高分离精度，提高检测器的灵敏度
液相色谱基础知识
液相色谱基础知识
液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法 液相色谱：
适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的 适用于高沸点、大分子、 分析 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用
气相色谱： 气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法
适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析 适用于沸点较低、 流动相只起运载样品分子的能力
注意事项： 注意事项：
溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器 （如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动 相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）
样 品
1.
处
理
使用适宜的流动相溶解样品 在溶剂选择的时候，应注意以下原则： -- 减少溶剂峰，尤其是不可使用组分峰靠近溶剂峰 的流动相 -- 保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统 中尤其在色谱柱中产生沉淀
溶 剂 等 级
分析纯级(实线）和 HPLC 级溶剂（虚线）的吸光度比较
甲醇
乙睛
正己烷
General Maintenance and Troubleshooting
溶 剂 等 级
缓冲液的使用
使用前必须过滤 以免造成腐蚀、 使用后一定要对柱子进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损及 阻塞:首先用纯水冲洗 首先用纯水冲洗30-60min（0.1-0.5ml/min），再用 ），再用 阻塞 首先用纯水冲洗 （ ）， 甲醇冲洗30min(0.1-0.5ml/min) 甲醇冲洗 易受到细菌和霉菌的影响
谈谈液相色谱方法开发
谈谈液相色谱方法开发这次和大家探讨一些关于HPLC方法学开发的问题。
当然，这是很久以前的思路，在今天看来是比较幼稚的，但是，如果能够给大家一点哪怕一点点启示也是好的。
当然文章有很多缺陷，也希望大家批评。
高效液相色谱在极性的角度可以分成正相色谱分析和反相色谱分析。
反相色谱分析一般使用水-甲醇-乙腈体系，一般选用C8，C10，C18 柱子，主要使用C18键合相柱子。
非极性物质一般用氯仿-正己烷体系。
因为qingqingcao没有做过正相HPLC分离，所以，我们主要关注反相HPLC分析。
色谱柱的选择当然，选用的色谱柱一般就是C18柱。
长度呢？如果分析的物质复杂，那么可以选取长一些的，比如250mm╳4.6mm╳5μm。
保证其分离度。
如果物质不是很复杂，那么选取150mm╳4.6mm╳5μm的色谱柱，可以有效地缩短分析时间。
检测器的选择紫外检测器是最通用的检测器之一，所以，本文均以紫外检测器做说明。
对于需要分析的物质，做全波长扫描，由于物质的不同官能团，他们会在不同的地方有吸收。
通过综合选取大家都有吸收的波长。
选择波长需要有权衡。
同时也可以用一些特殊的波长，避免杂质的吸收，也可以提升测试准确度。
或者使用双波长的方法。
流动相的选择对于选取流动相，首先实验一下样品的溶解度。
样品在水中，甲醇，乙腈中溶解程度。
如果，很容易溶解在水中，这就告诉我们，流动相选取，可能有机相要少些，比方说测试维生素C，其极性很强，流动相中有机相比例不能多。
（为了保护色谱柱，有机相比例一般不少于8% ）如果，样品不太容易溶解在水中，那么有机相的比例应高些，比方像维生素E，就可以用90% -95% 的甲醇体系。
其次是样品的酸碱度。
我们知道，C18色谱柱流动相pH在2-8 之间。
太酸，太碱都可能损坏色谱柱。
流动相pH值对于分离有一定作用，所以，酸性物质，一般流动相酸一些，碱性物质可能碱一些。
对于几种物质的分离。
如果不是太多的物质，用等度方法会比较好。
液相色谱方法的开发
液相色谱方法的开发
液相色谱（HPLC）方法的开发通常包括以下几个步骤：
1. 选择合适的色谱柱：根据分析样品的性质和目标成分，选择合适的色谱柱，包括填充物和柱尺寸。
填充物的选择通常考虑分离效果、保留度、选择性等因素。
2. 优化流动相组成：根据样品的特性以及目标成分的极性、溶解度等因素，优化流动相组成，包括溶剂选择、添加剂和缓冲剂的使用等。
通过试错法和理论分析方法，确定最佳的流动相组合。
3. 确定色谱条件：包括进样量、流速、检测波长等。
进样量通常根据分析样品的浓度和柱容量进行确定。
流速的选择与分离效果、分析时间和柱压有关。
检测波长通常根据目标成分的最大吸收波长或最大荧光波长进行选择。
4. 方法验证：对开发的HPLC方法进行验证，包括精密度、线性范围、准确度、重复性、选择性等指标的测定。
此外，还需要进行仪器的精度、重复性和稳定性测试。
5. 方法应用：将开发的HPLC方法应用于实际样品的分析，验证其准确性和可靠性。
在开发HPLC方法的过程中，需要充分考虑样品的特性、目标成分的分离和检测要求，并进行系统的实验设计和优化。
不同的样品和分析目标可能需要不同的方法开发策略，因此开发一个适合的HPLC方法需要一定的经验和专业知识。
液相色谱的应用以及方法开发
液相色谱作为分离和分析化学中不可或缺的技术，在各个领域得到了广泛应 用。本次演讲将介绍液相色谱的概况、应用领域，以及方法开发的重要性和 步骤。
概况
技术基础
液相色谱是一种基于不同化学性质的样品分离 和检测方法，它利用流动相和固定相进行分离。
分离机理
液相色谱利用不同化学性质的样品在流动相和 固定相之间的分配差异来进行分离。
亲和色谱
通过对样品中特定分子或离子与载体之间亲 和力进行匹配，实现选择性分离。
应用领域
药物开发
液相色谱被广泛用于药物开发的所有阶段，从 新药筛选到药代动力学研究。
食品检测
利用液相色谱可以准确测量食品中有害成分的 含量，例如农药残留、污染物和添加剂等。
环境监测
液相色谱可以用于检测水体、大气和土壤中的 有害物质，以确保环境质量符合标准。
1 确定目标化合物
2 测定样品性质
分析样品，确定所要检测的目标化合物， 例如有机酸、酚类化合物等。
利用物化性质和制备试验来确定样品的特 性，如溶解度、极性等。
3 优化分离条件
4 验证方法准确性
选用不同的固定相和流动相，以及温度和 pH值等参数来寻求最佳的分离效果。
对开发出的方法进行验证，以确保方法的 准确性、重复性和专属性。
仪器类型
常见的液相色谱仪器有高效液相色谱（HPLC）、 超高效液相色谱（UHPLC）和气相色谱（GC） 等。
常见的液相色谱技术
反相色谱
将静电互斥的化合物分离，适用于分离极性 不强的样品。
排阻色谱
利用分子尺寸差异分离样品，适用于大分子 化合物和生物样品的分离。
离子交换色谱
基于样品中离子对载体上离子亲和力不同而 进行分离。
液相色谱的方法开发
流速控制
根据柱的类型、样品性质等因素， 控制流速以达到理想的分离效果。
检测器的选择
紫外检测器
常用于大多数化合物的分析，灵敏度高，可检测在200-400nm范围内的化合物。
荧光检测器
可检测含氮、含硫、芳香族、不饱和等化合物，灵敏度高。
电化学检测器
可检测有交换电量的化合物，如氨基酸、核苷酸等。
方法验证和优化
酸度浓度
根据实验物质的pH值和稳定性确定缓冲
离子强度
2
液的pH范围和酸度浓度。
根据样品特性，调整离子强度以优化柱
的分离效果。
3
缓冲液添加剂
针对不同的柱材和样品性质选择合适的 添加剂优化分离效果。
流动相的优化
常用流动相
如甲醇、乙腈、乙醇等，在选择 时需要考虑流动相的溶解度和保 存性。
添加剂的使用
添加剂可以提高流动相的极性和 稳定性，如三氟乙酸、甲酸等。
样品处理
样品预处理的方法对液相色谱 分离及检测结果有较大影响。
选择液相色谱柱材料
反相柱
用于极性较小的化合物分离，如药品和天然产 物等。
手性柱
用于手性分析和富集放大，如药品和农药等。
离子交换柱
用于带电化合于大分子化合物的分离，如蛋白质和多肽等。
缓冲液的选择
1
液相色谱的方法开发
在这个演示文稿中，我们将介绍液相色谱方法开发的关键步骤。您将学习到 如何选择柱材料、优化流动相以及如何验证和优化方法。
方法概述
仪器安装
确认液相色谱仪的良好状态并 设置参数以保证实验的高质量。
柱的选择
选用不同类型和规格的柱进行 컐7。c7；分离和定量分析。
缓冲液的准备
根据分离目标和样品性质选择 合适的缓冲液进行柱的平衡和 样品的制备。
液相色谱的方法开发梯度方法
1 应用领域
梯度方法在药物分析、生物医学领域和化学领域中有广泛的应用。
2 实验设计
在实际分析中，需要合理设计实验方案，选择适当的样品制备技巧和分析方法。
梯度方法的优化
通过优化梯度方法的参数和条件，可以进一步提高分离效果、减少分析时间，并降低耗材成本。
梯度方法的分离效果受样品性质、柱填料和流动相等因素的影响。
2 限制
在某些特殊情况下，梯度方法可能无法实现理想的分离效果，需要寻找其他分析方法。
梯度方法的未来发展与展望
随着科学技术的不断发展，梯度方法在分析领域的应用将得到进一步拓展，为分析师提供更多选 择和更高水平的技术支持。
1 技术设备
随着技术设备的进步，将实现更高灵敏度、更快分析速度和更好的分离效果。
常见问题与解决方案
在梯度方法的开发过程中，可能会遇到一些常见问题，例如峰形畸变、峰展宽和副峰的产生，需 要采取相应的解决方案。
1 峰形畸变
峰形畸变可能是由于流速过高或溶剂成分不合适导致的，可以通过调整流速和溶剂成分 来解决。
2 峰展宽
峰展宽可能是由于温度不稳定或柱温过高导致的，可以通过优化温度控制来解决。
2 质量控制与评估
在梯度方法的开发和应用过程中，需要进行严格的质量控制和评估，以确保结果的准确 性和可靠性。
1 参数调整
通过改变流速、温度和梯度斜率等参数，可以优化梯度方法的分离效果。
2 改进与创新
不断改进梯度方法的设计和操作步骤，可以实现更高的分析效率和分离能力。
梯度方法的局限性和限制
梯度方法在某些情况下可能存在局限性和限制，例如对于极性物质的分离效果较差，或者在某些 特定条件下无法实现良好的分离。
液相色谱的方法开发-梯度方法
梯度方法的分类
梯度方法可以分为线性梯度、非线性梯度和步进梯度等类型。不同类型的梯 度方法适用于不同的分析需求和样品特性。
梯度方法的基本原理
梯度方法的基本原理是通过改变流动相的组成，调节化合物在固定相上的吸附和分配行为，从而实现混合物中 化合物的分离和分析。
梯度方法的实施条件
梯度方法的实施条件包括流动相组成、梯度斜率、流速、柱温等。这些条件 需要根据样品特性和分析目的进行优化。
液相色谱方法的常用步骤包括：样品制备、柱填充、流动相选择、进样、色 谱条件优化、峰识别和结果分析。
梯度方法在液相色谱方法中的 作用
梯度方法在液相色谱方法中用来调整流动相的组成，以改变柱中的移动相浓 度梯度，进而提高分离效果和分析速度。
梯度方法优点分析
梯度方法相比等浓度梯度方法具有更快的分离速度、更高的峰容量和更好的 分离效果。它可以解决复杂样品的分析问题。
液相色谱的方法开发-梯 度方法
液相色谱方法是一种用于分离、识别和定量测定化合物的方法。本演示将介 绍液相色谱方法的相色谱方法是一种用于分离、识别和定量测定化合物的方法。它基于化合物在固定相和移动相之间的相互作 用来分离混合物。
液相色谱方法的常用步骤
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N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各 组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。 N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果 未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以 上。）
相平衡参数
容量因子(capacity factor，k)—化合物在两相间达 到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因 子也称质量分配系数。
一
液相色谱基础知识
液相色谱法：利用组分在两相间分配系数不
同而进行分离的技术 移动相：携带样品流过整个系统的流体 固定相：静止不动的一相-色谱柱
色谱分离的机理
色谱是一种分离技术 色谱分离是一个物理过程
流动相（Mobile Phas） 固定相（Stationary Phase） 样品（溶解于流动相中的溶质）
t , R 2 k , 2 at k , , a t R 1 k 1 t k
, R 2 , ,
2 1
R 1
,
要使两组分得到分离，必须使α≠1。α与化合物在固定 相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填 充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间 的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。
液相色谱的基本流程图
流动相
色谱柱
A B C
进样阀
检测器
D
E F
G
泵
泵输液
进样
分离柱
检测器
记录
HPLC的仪器配置
溶剂 数据处理系统 色谱泵 自动进样器 色谱柱及柱温箱 检测器
液相色谱图相关术语
色谱图(chromatogram)—样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时 间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 基线(base line)—经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测 出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)—基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检 测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)—基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温 度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下 来也会产生漂移。 峰底—基线上峰的起点至终点的距离。 峰高(peak height，h)—峰的最高点至峰底的距离。 u峰面积(peak area，A)—峰与峰底所包围的面积。
液相色谱图相关术语
色谱峰(peak)—组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出 曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯 Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰 (tailing peak)。 拖尾因子(tailing factor，T) —是用以衡量色谱峰的对称性，也称 为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。 《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖 尾峰。 峰宽(peak width，W)—峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点 间的距离。 半峰宽(peak width at half-height，Wh/2)—峰高一半处的峰宽。 标准偏差(standard deviation，σ)—正态分布曲线x＝±1时（拐点） 的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明 组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度 高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。
液相色谱图相关参数
♦定性参数（保留值） ♦柱效参数 ♦相平衡参数 —容量因子k —选择性因子a ♦分离参数
定性参数（保留值）
♦死时间(dead time，t0)—不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通 过色谱柱的时间。 ♦死体积(dead volume，V0)—由进样器进样口到检测器流动池未被固定相 所占据的空间。V0＝F×t0（F为流速） ♦保留时间(retention time，tR)—从进样开始到某个组分在柱后出现浓 度极大值的时间。 ♦保留体积(retention volume，VR)—从进样开始到某组分在柱后出现浓 度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F×tR。 ♦调整保留时间(adjusted retention time，t'R)—扣除死时间后的保留 时间。在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定于组分的性质， 因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0 ♦调整保留体积(adjusted retention volume，V'R)—扣除死体积后的保 留体积。V'R＝VR－V0或V'R＝F×t'R
k t R t0 溶质在固定相中的量 或k t0 溶质在流动相中的量
性质-与柱子的大小及流速无关,只与溶质在固定相和 流动相的分配性、柱温以及相空间比（即固定相和流动相之 体积比）有关。 范围 0.4＜k＜20～30
相平衡参数
选择性因子(selectivity factor，α)—相邻两组分的 分配系数或容量因子之比。
液相色谱分离机理
高效液相色谱是一种以液体作流动相和固体微 粒作固定相，待测组分在柱内的两相之间进行高速 分配和高效分离的柱液体色谱方法。 样品溶液中的各组分，因其物理化学性质的微 小差异，当其随流动相进入色谱柱后，便在柱的两 相之间产生不同的相互作用力，从而导致柱上迁移 速率的微小差异。 随着流动相的连续推移，这种微小的差异被不 断扩大，直至柱内出现明显不同的迁移距离，使最 终达到组分完全分离。
柱效参数
理论塔板数(theoretical plate number，N)—用于定量表示色谱 柱的分离效率（简称柱效）。 N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱 长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并 符合正态分布，N可近似表示为：
tR tR N 5.54 Wh 16 2 W