细胞培养(hela,293,239t等细胞的培养)
细胞培养
293FT
293T
HSF-6
2.原代细胞 HDF：Human dermal fibroblasts 表皮细胞 羊水细胞 尿液来源的肾小管上皮细胞 MEF：mouse embryonic fibroblasts 大鼠皮层神经元
HDF 3.细胞株 淋巴细胞株
肾小管上皮细胞
羊水细胞
细胞培养基础知识
一.无菌操作
1.层流级别（洁净级）
洁净空间单位体积空气中，以大于或等于被考虑直径的粒子 最大浓度限值进行划分的等级标准。
2.消毒和灭菌
二.细胞培养条件
பைடு நூலகம்
温度：37℃ CO2浓度：5% pH:7.2---7.6 湿度：100% 渗透压
三.细胞培养基
• 基础培养基：细胞生长的基础物质，水分，pH/渗透压缓冲液等 DMEM、RPMI-1640、DMEM/F12 • 血清：必须的、未知的微量营养物质或生长因子等 FBS、HBS • 非必须氨基酸：NEAA • L-谷氨酰胺、双抗等等
4. DMSO（二甲基亚砜）
是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低 冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形 成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
5. 细胞的冻存与复苏—缓冻速溶原则
当细胞冷冻到0℃以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升 高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的 冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快 融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
6.血细胞计数板
7.细胞培养中各类污染的辨别
8.避免不同细胞间的交叉污染同样非常重要
细胞培养定义-概述说明以及解释
细胞培养定义-概述说明以及解释1.引言1.1 概述细胞培养是一种重要的科学技术，用于在控制的实验室条件下，培养细胞体外生长和增殖。
通过提供合适的生长环境，包括适当的培养基、细胞状态维持剂和温度、湿度等因素的控制，细胞可以持续生长和繁殖。
细胞培养可以在无菌环境下进行，以保证培养过程中没有污染物的引入。
细胞培养的主要目的是研究细胞的特性和功能。
通过细胞培养，科学家可以观察和研究细胞在不同条件下的行为，进一步了解细胞的基本生理过程、信号转导途径和分化过程。
此外，细胞培养还被广泛应用于药物筛选、生物技术研究、生物工程和医药领域等。
细胞培养的发展历史可以追溯到19世纪末。
当时，人们开始尝试培养动物细胞，最早成功地实现了培养培养出鸟胚细胞。
经过长期的努力和技术改进，细胞培养的技术逐渐成熟，并被广泛应用于各个领域。
综上所述，细胞培养是一种重要的科学技术，通过在受控的实验室条件下培养细胞，可以研究细胞的特性和功能。
随着细胞培养技术的不断发展和完善，它在生物学研究、生物技术和医药领域的应用将会更加广泛。
1.2文章结构1.2 文章结构本文旨在探讨细胞培养的定义、历史、重要性以及应用领域。
为了更好地展示这些内容，本文将按照以下结构进行组织和展示：第一部分是引言部分，引言部分将对细胞培养进行概述。
我们将介绍细胞培养的基本概念，其在生物科学中的重要性以及本文的目的。
第二部分是正文部分，正文部分将分为两个小节。
首先，我们将详细介绍细胞培养的定义。
我们将解释什么是细胞培养，如何进行细胞培养以及细胞培养的目的和意义。
其次，我们将回顾细胞培养的历史，探讨细胞培养技术的发展和重要里程碑，以及这些里程碑对现代细胞培养的影响。
第三部分是结论部分，结论部分将总结细胞培养的重要性和应用领域。
我们将强调细胞培养在生命科学研究中的关键作用，并讨论细胞培养在医学、药物研发、生物工程等领域的广泛应用。
通过以上的文章结构，我们将全面、系统地介绍细胞培养的定义、历史、重要性和应用领域。
细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
HEK293T细胞培养ppt课件
基因诊断
培养细胞 能做什么
治病机理
试管婴儿
组织工程
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细胞的培养具体方法与步骤
细胞培养细胞培养(cell culture) 的含义，简单地说即是把来 自机体的组织经分散成为单个细胞，放在类似于体内的体外环境 中生存，使其不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的生长、繁 殖、衰老等生命现象。细胞培养技术在遗传学、免疫学、肿瘤学、 病毒学、分子生物学等领域已得到广泛的应用
.
细胞间的操作注意事项
每一个人操作结束后，必须及时清理操净工作台内的物品，不得在工作台面。 每一个操作结束后，必须及使用84消毒液消毒管道，并清理废液瓶，及时弃去
细胞被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改
变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被
支原体污染一般难以察觉。
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细胞污染问题与解决方案
细胞的支原体污染检测
试剂盒检测法： 目前已有专门做支原体检测的试剂盒，可以用细胞滴片进行检
测
间接免疫荧光法和免疫印迹：简便、快速、特异性
养基(37℃预热)，润湿底面
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HEK293细胞复苏步骤
根据冻存记录从液氮灌中取出冻存的细胞
迅速投入已经预热至37 ℃的水浴锅中，并快速晃动，在1-2 min内使完全融化 用酒精擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内，有培养基的培养瓶
轻轻混匀，置37℃、5%CO2培养箱中培养
次日换液
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细胞培养的常见问题与解决方案
真菌污染后，霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色 漂浮物。 LOGO
细胞污染问题与解决方案
细胞的真菌污染检测 镜检有丝状物
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HEK293细胞培养心得
HEK293细胞培养心得首先，为了成功培养HEK293细胞，一个优良的细胞培养基是必不可少的。
一般来说，培养基应包含必需的营养物质，比如氨基酸、维生素、糖类和无机盐等。
同时，培养基还应该含有足够的抗生素以预防细菌和真菌的污染。
最好使用无血清的培养基，以避免动物源性成分对细胞培养的影响。
其次，准备一个合适的细胞培养环境也是至关重要的。
温度、湿度和二氧化碳浓度等条件应符合HEK293细胞的生长要求。
一般来说，细胞应在37°C的温度下培养，在5%的二氧化碳气氛中保持培养皿内的湿度。
细胞的传代是维持细胞活力和健康状态的重要步骤。
对于HEK293细胞，通常使用胰酶进行消化和洗涤来分离细胞。
对于细胞的新鲜分离，可以将细胞培养皿放入冰箱中进行预冷却，然后使用含有胰酶的PBS缓冲液进行洗涤。
定期检查细胞的密度和健康状况，并及时进行传代是非常重要的。
在培养细胞的过程中，细胞污染是一个常见的问题。
为了避免细菌和真菌的污染，可以在细胞培养过程中添加抗生素。
此外，操作时应注意细胞培养器具的无菌性，使用经过消毒的培养器具并保持培养环境的清洁是必要的。
细胞的冻存是为了保存和传递细胞的重要方法。
在将细胞冻存之前，应通过使用逐渐降低培养基中血清含量的方法适应细胞在无血清条件下生长。
然后使用冷冻保护剂配制适当的冻存液，将细胞分装到冻存管中，并使用液氮罐进行快速冷冻。
最后，定期检查细胞的健康和生长状态是维持细胞培养的重要步骤。
观察细胞的形态和贴壁情况，并使用显微镜检查细胞的活力和细胞数目。
如果细胞出现异常形态或生长减慢，可能是因为细菌或真菌污染，应及时采取相应的措施。
总之，HEK293细胞的培养需要一定的技巧和经验。
通过优化培养基、培养条件和消毒措施，加强细胞观察和细胞传代，可以有效地培养和维持HEK293细胞的活性和生长。
这些心得经验将有助于研究人员在实验室中更好地使用HEK293细胞进行相关研究。
细胞培养1ppt课件
完整版课件
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培养细胞生长的条件
1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃
O2
CO2: 5%
CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3-
pH: 7.2-7.4
渗透压
3 无污染 4 无毒
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实验准备
实验用品：
超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器， 酸缸
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滤器
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CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖 微松，以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。定期消毒
（90 ℃ ，14 h)。
③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中 以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。
天然培养基：
天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
优点：营养成分丰富，培养效果好
缺点：来源受限。
成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。
易发生支原体污染
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合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数
量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培
器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整 个器宫
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3
原代培养细胞的生命归宿
原代培养期 传代期 衰退期
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4
完整版课件
5
有限细胞系，无限细胞系 细胞系 cell line 细胞株 cell strain
细胞生物学实验Hela细胞培养
亦称无性繁殖系或简称无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有 丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。
细胞生物学实验Hela细胞培养
细胞培养方式大致可分为两种：一种是群体培养（mass culture），将含 有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，细胞贴壁生长形成均匀的单细胞 层或者悬浮生长；另一种是克隆培养（clonal culture），将高度稀释的 游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生 长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克 隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。
非胎牛血清需要灭活以减少补体和支原体的影响：56 ℃，30分钟。
一般的血清出厂时都经过严格的检测，不会存在污染。血清在长时间的存放后一般 会出现絮状沉淀等不溶物质，不会影响正常的使用，除非经过试用发现存在污染， 需要根据污染的种类酌情处理，如果对血清过滤除菌，因为滤膜会过滤掉很多血清 的有效成分，所以必须在过滤后提高血清的工作浓度。
细胞的营养需要：特定的培养基和添加剂 细胞的生存环境： 温度: 37 ℃； CO2 、O2 ； pH: 7.2-7.4；渗透压；适宜的湿度 无化学和生物污染、无毒害
CO2: 5% －10％ 缓冲体系： CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3HEPES
细胞生物学实验Hela细胞培养
细胞生物学实验Hela细胞培养
细胞培养所需要的溶液
添加剂：
4、L-谷氨酰胺：脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白 质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在4度溶液中存放时间过长会降解，通常培养基 一个月内没有用完，需要补充相同量的L-谷氨酰胺再继续使用。
293t细胞培养说明书
293T细胞培养说明书一、实验简介293T细胞是由肾脏细胞系统转染外源基因而产生的细胞系，具有较好的培养性和转染性。
因此，293T细胞常用于基因表达研究，尤其是蛋白表达和病毒载体的构建。
二、培养条件1. 培养基：293T细胞培养最常用的培养基是Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)，其次是RPMI-1640培养基。
2. 氧气浓度：293T细胞培养一般需要一个较高的氧气浓度，如5%~10%。
3. 温度：293T细胞的培养温度一般为37℃。
4. 水分：293T细胞的培养液中的水分一般为95%~100%。
5. 添加物：293T细胞的培养液中通常会添加10%的牛血清，以促进细胞生长。
三、细胞培养步骤1. 将293T细胞从细胞库中取出，放入清洗后的培养皿中，以DMEM培养基浸泡；2. 将培养皿放入培养箱，调节温度为37℃，氧气浓度为5%~10%；3. 将添加10%牛血清放入培养液中，搅拌均匀；4. 用细胞活性检测试纸测定细胞活性；5. 根据细胞活性的变化情况，调整培养液中的水分，以维持细胞的生长；6. 将培养液更换，每1~2天更换一次；7. 定期观察细胞形态，记录细胞生长情况。
四、注意事项1. 在培养293T细胞时，需要注意细胞的温度、氧气浓度以及水分，以保证细胞的正常生长；2. 培养液的清洗和更换要及时，以保证细胞的正常生长；3. 在操作293T细胞时，一定要注意实验室的清洁卫生，以防止细胞的污染。
五、总结293T细胞培养是一种常用的培养方法，在培养293T细胞时，要注意培养液的温度、氧气浓度以及水分，并及时更换培养液，以保证细胞的正常生长。
在实验操作中，还要注意实验室的清洁卫生，以防止细胞的污染。
细胞培养
细胞培养科技名词定义中文名称：细胞培养英文名称：cell culture定义1：在模拟机体内的生理环境中维持细胞生长、繁殖的技术。
应用学科：水产学（一级学科）；水产生物育种学（二级学科）定义2：在体外条件下，用培养液维持细胞生长与增殖的技术。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布求助编辑百科名片细胞培养细胞培养技术也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。
不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。
细胞培养，既包括微生物细胞的培养，细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。
通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。
因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。
目录基本概述设施器材培养基细胞培养的一般过程细胞培养的一般条件动物细胞培养的特殊条件植物细胞培养的特殊条件微生物细胞培养的特殊条件展开编辑本段基本概述细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。
培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。
液体培养基用于大规模的工业生产以及生理代谢等基本理论的研究工作。
液体培养基中加入一定的凝固剂(如琼脂)或固体培养物(如麸皮、大米等)便成为固体培养基。
固体培养基为细胞的生长提供了一个营养及通气的表面，在这样一个营养表面上生产的细胞可形成单个菌落。
因此，固体培养基在细胞的分离、鉴定、计数等方面起着相当重要的作用。
从多细胞生物中分离所需要细胞和扩增获得的细胞以及对细胞进行体外改造，观察，必须首先解决细胞离体培养问题，同微生物细胞培养的难易相比，比较困难的是来自多细胞生物的单细胞培养，特别是动物细胞的培养。
HEK293T细胞培养
细胞系的第一步。
细胞的培养具体方法与步骤
传代培养
传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到
另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消
化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传 代法或离心法传代。
HEK293T和HEK293细胞
HEK293细胞简介
HEK293细胞在倒置显微镜下的形态
细胞污染问题与解决方案
细胞的真菌污染
梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多为烟曲
霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。
真菌污染后，霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色
漂浮物。
细胞污染问题与解决方案
细胞的真菌污染检测
镜检有丝状物
细胞污染问题与解决方案
常见的真菌污染
HEK293细胞的复苏
复苏前的准备
DMEM完全培养基(含10%胎牛血清)：试验前置室温下
将水浴锅预热至37℃
取新培养瓶（75cm2），标记细胞编号、时间，加入10ml DMEM培
养基(37℃预热)，润湿底面
HEK293细胞复苏步骤
根据冻存记录从液氮灌中取出冻存的细胞
迅速投入已经预热至37 ℃的水浴锅中，并快速晃动，在1-2 min内使完全融化
服传出细胞间外。
进入细胞间必须养成随手关门习惯。操作期间，细胞间外门和中门必须处于关 闭状态。
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细胞间的操作注意事项
操净工作台实验前和试验后的灭菌，打开紫外灯15-20分钟。
试验操作期间，应戴手套。并注意随时用75%酒精消毒双手。
实验操作期间，操净工作台的风机应处于打开状态。操作结束后，关闭挡板、 关闭风机。 凡是带入操净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶等到额瓶子均要用75% 酒精擦拭瓶子的外表面。 使用倒置显微镜前，用75%酒精擦拭消毒载物台 使用二氧化碳培养箱时，应尽量缩短开门时间，减少开门次数。 每次倒置显微镜观察细胞后，用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，再放入 放入培养箱中继续培养。
细胞培养
第一节
单细胞的分离
由完整的植物器官分离单细胞 由培养组织（如愈伤组织） 由培养组织（如愈伤组织） 中分离单细胞
1、由完整的植物器官分离单细胞 叶片是分离单细胞的最好材料
机械法 酶解法
1-1、 机械法 第一种方法： 第一种方法：用刀片刮叶片 研究者和时间： 研究者和时间： Ball&Joshi (1965) Noggle (1967) Joshi &Ball (1968) 研究材料： 研究材料：花生成熟叶片
若悬浮液与培养基以1:4混合， 若悬浮液与培养基以1:4混合，则应把悬浮液的细 1:4混合 10³ 500×10³ /ml。 胞密度调到 5×10³- 500×10³ 个/ml。 调制方法：若悬浮液中细胞密度高，则加培养液 调制方法：若悬浮液中细胞密度高， 稀释；若悬浮液中细胞密度过低， 稀释；若悬浮液中细胞密度过低，则通过离心使 细胞沉淀后， 细胞沉淀后，取一定量的上清液使其达到所要求 的密度。 的密度。
植物细胞培养
在离体条件下， 在离体条件下，将愈伤组织或其他植物 器官易分散的组织置于液体培养基上进行振 器官易分散的组织置于液体培养基上进行振 荡培养，得到游离的悬浮细胞， 荡培养，得到游离的悬浮细胞，通过继代培 养使细胞增殖，从而获得大量细胞群（ 养使细胞增殖，从而获得大量细胞群（单细 胞无性系）的一种技术。 胞无性系）的一种技术。
3 看护培养法
3-1 看护培养的含义及用途 含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来 含义： 看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 用途；诱导形成单细胞系。 用途；诱导形成单细胞系。 Muir(1954)首先用此法培养出烟草单细胞 Muir(1954)首先用此法培养出烟草单细胞 Sharp(1972)成功将此法用于番茄的花 株。Sharp(1972)成功将此法用于番茄的花 粉培养，诱导花粉形成单倍体细胞系。 粉培养，诱导花粉形成单倍体细胞系。
HEK293细胞培养心得
HEK293细胞培养心得HEK293细胞是一种来自人类胚胎肾细胞的细胞系，广泛应用于生物医学研究，药物筛选和疫苗生产等领域。
在培养HEK293细胞的过程中，需要注意一些关键因素，如培养基的选择、细胞传代和细胞冻存等。
在我个人的实验室研究中，我积累了一些关于HEK293细胞培养的心得体会，以下是我对HEK293细胞培养的常用操作和一些建议。
首先，关于培养基的选择。
HEK293细胞通常使用DMEM培养基，配合10%胎牛血清（FBS）和1%的抗生素/抗真菌溶液。
在选择FBS时，建议选择FBS批次稳定，比较适合细胞生长的产品，并进行细胞生长曲线的监测。
此外，培养基中的抗生素/抗真菌溶液可以有效地预防细胞培养中的细菌和真菌污染。
其次，细胞传代是保持HEK293细胞健康生长的关键环节之一、一般来说，当细胞达到80%~90%的密度时，可以进行细胞传代。
细胞传代前，应该先用1X磷酸缓冲盐水（PBS）洗涤细胞，然后使用胰酶或胰酶-EDTA溶解细胞。
胰酶处理时间不宜过长，一般5-10分钟即可。
通过观察细胞的形态变化，判断细胞是否已经完全分离，然后将新的培养基添加到细胞生长板中。
注意，传代时的细胞密度不宜过高，否则容易引起细胞凋亡和细胞质重叠。
此外，为了减少细胞传代带来的细胞突变风险，建议每隔一定的时间重新从冻存的细胞中获得新的细胞，而不是一直使用原始细胞系。
另外，一个常见的问题是细胞冻存和解冻。
细胞冻存是保存和传递细胞的重要方法，在培养HEK293细胞时也是常见的操作。
为了成功地冻存和解冻HEK293细胞，我们使用含10%DMSO的冻存液将细胞冷冻在液氮中。
在解冻细胞时，我们将冻存管迅速放入37°C水浴中，轻轻摇晃管子，直到细胞完全解冻。
然后，将细胞转移至预先装有适量培养基的离心管中，并离心以去除残留的DMSO。
最后，将细胞转移至培养皿中，进行正常的培养。
此外，尽管HEK293细胞生长迅速且易于培养，但仍然需要定期检查细胞的健康状态和污染。
HEK-293细胞
HEK-293细胞 293A 293S 293T 和293FT cell区别⽐较....
293细胞的缺陷是⽣长过程中贴壁强度⽐较⼩。
所以在实验过程中容易流失，从⽽影响实验结果。
如果⼀个实验室新得到的293细胞是邮寄得到的并且细胞在培养瓶中，就需要让细胞沉降⼏天时间，因为⼤量细胞会漂浮在培养液⾥。
来源：⼈体肾脏形态：上⽪细胞⽣长特性：贴壁注释：该细胞含腺病毒5 DNA 。
培养液：完全培养基。
传代：吸去培养液。
胰酶消化，以1：2到1：4为宜，传代期间培养液2-3天更换1次。
冻存：90%培养液+10%DMSO冻存于液氮。
293A：是293中后来⼜建的细胞亚株，这个A是adhere的意思，就是说293倾向于形成单层细胞（monolayer），它⽐293好的地⽅是在做计算病毒数量的空斑试验（plaque assay)293A是均匀的⼀层，没有细胞重叠和细胞空隙（hole），就这个意思，这个A所对的是293S（suspension).
293细胞系是原代⼈胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad 5) DNA的永⽣化细胞，表达转染的腺病毒5的基因。
293T细胞表达 E1A蛋⽩，S40⼤T抗原，含有S40复制起始点与启动⼦区的质粒可以复制。
293FT细胞能制造⾼滴度的慢病毒。
293A细胞来源于⼈肾纤维母细胞，组成性表达 E1A 和 E1B 蛋⽩。
293细胞的大规模培养
293细胞的大规模培养细胞培养技术是生物学、医学和生物工程学等领域的基础技术之一。
近年来，随着新的细胞系技术的发展，细胞培养技术也得到了长足的发展。
其中，293细胞由于其在蛋白质表达和病毒生产等方面具有重要的应用价值，被广泛应用于科研和工业生产。
293细胞是一种人类胚肾细胞系，该细胞系由美国病毒学家Frank Graham于1977年首次从正常人的胚胎肾组织中分离并培养而来。
由于293细胞具有较高的增殖速率和强大的蛋白质表达能力，因此被广泛应用于病毒生产和蛋白质表达等领域。
然而，由于293细胞比较难以培养，因此大规模培养293细胞是一个较为复杂的过程。
在293细胞的大规模培养中，主要涉及以下几个方面的技术问题。
首先是细胞的营养需求。
由于293细胞对营养物质的要求较高，因此在293细胞的培养过程中需要加入多种营养物质，包括氨基酸、葡萄糖、维生素等。
同时，在大规模培养293细胞时，需要对营养物质的浓度进行优化，以保证细胞的正常生长和增殖。
其次是细胞的培养环境。
293细胞需要在特定的培养环境中生长并繁殖，因此在大规模培养293细胞时，需要对其培养环境进行严格的控制。
比如，需要控制培养液的pH值、温度和湿度等参数，以保证细胞在最适宜的环境中生长。
此外，细胞的处理和传代也是大规模培养293细胞时需要注意的问题。
在细胞的传代过程中，需要对细胞进行适当的处理，以保证细胞的健康和增殖能力。
同时，还需要注意不同传代次数的细胞之间的差异，以提高细胞的质量和稳定性。
在进行大规模培养293细胞时，还需要考虑到细胞生长的规律和产量的控制。
在细胞生长的规律方面，需要对细胞的生长速度和增殖周期进行优化，以提高细胞的生长速度和增殖效率。
在产量的控制方面，需要对细胞的表达系统进行优化，以提高细胞的蛋白表达能力和病毒产量。
总之，大规模培养293细胞是一个需要综合考虑多个技术问题的复杂过程。
随着细胞系技术的不断发展和进步，相信在未来的研究和应用中，将会有更加高效和可靠的方法被开发出来，为细胞培养技术的发展和应用带来更大的贡献。
293T细胞培养操作规程
题目：293T细胞培养操作规程
1目的293T细胞是常用于包装和扩增病毒载体的工具细胞，因此做好293T细胞的培养,为保证相关实验的正常进行提供必要条件.
2适用范围本部门293T细胞培养
3操作方法
3.1将移液器和移液枪、15ml离心管、离心管架、75cm2新的细胞培养瓶放于生物安全柜中，按照生物安全柜的标准操作规程，将生物安全柜的紫外开启半小时。
3。
2将含10％胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM及PBS放于37℃水浴锅中预热。
3.2.1将已长到80％—90％的293T细胞培养瓶从37℃，5%的CO2培养箱中取出，先用75％的酒精喷洒于瓶表面，将细胞培养瓶旋转放于生物安全柜中，用无菌的移液管吸净其中的培养基,加5ml的预热的PBS洗涤一次，吸净PBS。
3.2.2将含EDTA—0.25% tyption用PBS稀释两陪到五倍，向该75cm2的细胞瓶中加入3ml稀释好的EDTA—0.25% tyption,让其充分平铺于细胞表面。
盖好瓶盖，将细胞瓶放在显微镜下观察,直到细胞变圆,加含10%胎牛血清的DMEM终止反应，用移液管轻轻将瓶上的细胞吹下，将细胞液移到15ml无菌的离心管中,1000rpm离心3分钟.
3.2.3将离心上清吸弃掉，用手指轻轻拍打离心管底将底部细胞分散开，再加3mlDMEM培养基将分散的细胞重悬稀释开，取一定量的细胞液进行n倍稀释后计数，按照细胞计数标准操作规程进行。
3.2。
4 计数好之后细胞传代密度按照2~5×104个细胞/cm2的培养瓶中10mlDMEM培养基，放于37℃，5%的co2培养箱中培养。
3。
2.5 24小时后观察细胞状态,待细胞长到80％-90％时进行下一次传代培养。
HEK293T细胞培养
03
hek293t细胞培养的过程
细胞培养前的准备
细胞培养环境的准备
确保细胞培养实验室的清洁和消毒，准备好所需的培养基、细胞 培养瓶、酶等试剂。
细胞复苏和传代
从液氮或-80℃冰箱中取出细胞，进行复苏和传代，以获得足够的 细胞数量。
05
hek293t细胞培养的挑战与解决方案
细胞培养中的污染问题
污染来源
细胞培养中的污染可能来自培养环境、培养基、细胞本身和操作 过程等。
污染类型
常见的污染类型包括细菌、霉菌、支原体和病毒等。
解决方案
定期检查培养环境、培养基和细胞，使用一次性耗材，严格遵守 无菌操作规程，定期进行支原体检测等。
细胞培养中的生长问题
细胞培养过程中的注意事项
防止污染
维持适宜的pH值
严格控制细胞培养环境，定期对培养基和 细胞进行无菌检测，以防止细菌、霉菌等 污染。
监测培养基的pH值，并适时调整，以确保 细胞的正常生长。
避免细胞交叉污染
注意安全操作
在操作过程中，确保不同种类的细胞分开 存放，避免交叉污染。
操作过程中要穿戴实验室防护服、手套等 防护措施，避免直接接触细胞和培养基， 以防止潜在的生物危害。
选、基因治疗和疫苗研发等。
02
hek293t细胞培养的原理
细胞培养的基本原理
细胞是生命的基本单位，具有自我复 制和分化的能力。在适宜的环境下， 细胞可以生长、繁殖并维持其生物学 特性。
细胞培养技术广泛应用于生物学、医 学、药学等领域，是研究细胞生理、 病理和药理等方面的重要手段。
293T细胞培养
293T细胞培养293T 细胞培养1.培养基: DMEM =丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37 度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml 离心管，加5ml 培养基，500g 离心5min，弃上清，加1ml 培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml 左右，记得晃匀。
3. 传代:吸出旧培基，加5mlPBS 洗一遍，用移液管加1ml 胰酶，洗一遍吸出，37 度放1min 左右计时，看到大片大片脱落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml 新培育基的新瓶里。
293T 细胞是用5 型腺病毒75 株系转化，含有Ad5 E1 区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1 区缺陷互补细胞系。
293T 细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5 和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293T 细胞的大规模培养。
293T 细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM 中能生长很好。
一般来讲，1:10 传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293T 细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293T 细胞在传代120 次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293 细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH 值在6.9～7.1 时,可顺利贴壁生长, 换液293T 时动作要轻。
一般用高糖的DMEM 培养基。
2、传代：倒去废液，PBS 洗一次（轻），用0.02%EDTA 与0.25%Trypsin 消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin 作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM 终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
生物制药技术实验中的细胞培养技巧
生物制药技术实验中的细胞培养技巧细胞培养技术在生物制药领域中起着重要的作用，它是制备生物制药产品的关键步骤之一。
通过细胞培养技术，可以大规模生产药物蛋白和抗体等生物制药产品，为人类健康事业做出重要贡献。
本文将重点介绍生物制药技术实验中的细胞培养技巧。
首先，在细胞培养实验中，选择合适的细胞系非常重要。
目前常用的细胞系有CHO细胞、HEK293细胞和SF9细胞等。
选择细胞系时，需要考虑到其生长特性、耐受性、表达能力等因素。
此外，细胞系的稳定性和易于操作性也是选择合适细胞系的重要考虑因素。
其次，培养基的配制和调整是细胞培养实验中的关键步骤。
培养基是提供细胞生长所需的养分和生长因子的液体。
常用的培养基有DMEM、RPMI-1640、F12等。
在培养基的配制中，要严格按照配方比例加入培养基基础成分、补充剂、生长因子和抗生素等。
同时，培养基pH值的调整也是非常重要的。
一般来说，培养基的pH值应维持在7.2-7.4之间。
然后，在细胞培养实验中，应注意细胞的传代和细胞密度的控制。
细胞的传代是指将细胞从一个培养瓶转移到另一个新的培养瓶中，以保持细胞的活力和增殖能力。
细胞密度的控制是指在细胞培养过程中，保持细胞的适宜密度，以避免细胞过度生长或凋亡。
一般来说，细胞密度应在80%-90%的接触面积上进行传代，并定期进行细胞密度检测，保持适宜的密度。
此外，在细胞培养实验中，条件控制也是非常重要的。
细胞的生长需要适宜的温度、湿度和气体浓度等条件。
温度一般控制在37℃左右，湿度应保持在95%以上，而培养箱中的气体浓度一般需要维持在5%CO2/95%空气的比例。
此外，培养箱内的空气流通和环境消毒等操作也需注意。
另外，细胞培养实验中，细胞的检测和鉴定也是非常重要的。
常用的方法有形态观察、生长曲线分析和染色体分析等。
通过这些检测和鉴定，可以了解细胞的生长状态、纯度和型态等信息，确保实验结果的准确性和可靠性。
最后，在细胞培养实验中，应注意细胞的冻存和解冻。
细胞培养概述
器官培养
将活体的器官或器官的一部分取出，置于体外, 在 适当的培养条件，气相条件和生长基质等条件下， 生存、生长并同时保持其一定的结构和功能持征。
器官培养
器官培养中的小块组织块包含了不止一种基本组织。 是由几种组织共同构成的具有器官的结构和功能 特征的组织块。 培养时,其内部的细胞能按照在体内器官的正常生长 发育规律继续生长，培养的器官内部结构与体内 相似，保持与在体内时相似的解剖关系和功能特 征。
器官培养的目的
在体外环境下维持器官内部的发育分化以及结构 与功能特征，以便直接观察和研究器官的发育分 化过程、功能表现及其影响因素。 。
细胞培养的优点
1.活细胞： 能长时间、直接观察、研究 活细胞的形态、结构、生命活动
优点
2.可控制
：
可控制-选择对象：均一性、重复性
哪一种：类型：上皮？间质？--
形态相似的成纤维细胞可不同来源自同一动物不同组织的成纤维样细胞相似但发展趋向不同培养细胞的形态不稳定条件改变细胞形态可有变化血清hela高血清低血清成纤维细胞样上皮样细胞phhela标准ph成纤维细胞样上皮样细胞细胞密度3t3低密度高密度成纤维细胞样上皮样细胞生长状态改变悬浮或贴附悬浮贴附圆形成纤维或上皮样转化与否未转化转化后成纤维样可成上皮样注意细胞鉴定悬浮生长型概念培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源自血脾或骨髓尤以血中白细胞癌肿细胞也可能特点在悬浮中生长良好细胞圆形单个或小细胞团优点生存空间大提供数量大传代方便不需消化易于收获可获得稳定状态缺点观察不方便很多细胞不能悬浮生长尤以正常细胞
学科多：
对象广：
各种动物：低等动物--高等动物--人类 一种动物：不同年龄-不同组织-正常或异常（肿瘤--）
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Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
镜下观察，摇匀，放入37度孵育。
收超净台。
293T细胞?培养条件：37℃，5%?CO2，PH值~，无菌恒温培养。
?细胞相关操作：细胞复苏1.?37°C水浴预热培养基（DMEM+10%?FBS）；2.?从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；3.?在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；4.?弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀；5.?置于37°C，5%?CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)；6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。
细胞传代1.?当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代；2.?37°C水浴预热培养基（DMEM+10%?FBS）；3.?在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml 胰酶消化细胞；4.?显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基（DMEM+10%?FBS）终止消化；5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散；6.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；7.弃上清，加入15-20ml的培养基（含血清）重悬细胞后转入T75培养瓶中或按适当比例传到T25瓶中（确保细胞贴壁后融合度在25-50%之间），细胞密度在1×104?cells/cm2?×105?cells/T-25瓶），混匀细胞悬液，确保细胞均匀分布；8.将培养瓶置于37°C，5%?CO2的无菌培养箱中培养。
细胞冻存°C水浴预热培养基（DMEM+10%?FBS）；2.消化细胞后给细胞计数:1)洗净晾干血小板计数板和盖玻片，将盖玻片完全覆盖计数区；2)充分混匀细胞，取少量细胞悬液与等体积的染色液台盼蓝混合，移液器吹吸混合均匀，用移液器取20ul混合液从盖玻片两端(与中间凹槽平行的两端)分别打入细胞，以细胞悬液刚好浸湿盖玻片为佳；3)显微镜下，数四个计数区的总细胞数，无活性细胞染成蓝色，活细胞不被染色；4)细胞密度=细胞总数/4×10000×2；这里10000是不变的，因为计数的细胞是在体积为1mm×1mm×即10-4cm3计数池内，1cm3=1ml，将四个计数区的细胞数除以4取平均数，乘2是补偿加等体积台盼蓝形成的稀释。
5)细胞活性=活细胞数/细胞总数×100%。
注:细胞密度高时，可调整细胞悬液和台盼蓝的比例，计数时乘以相应的稀释倍数即可。
3.当细胞密度达到传代密度且细胞活性在90%以上时，可以冻存细胞。
4.在超净台中将要冻存的细胞移入离心管，1000rpm离心5min。
5.弃上清，用90%培养液+10%DMSO的混合液重悬细胞，并调整细胞密度为1-3×106/ml。
6.将细胞悬液分装到冻存管中管)。
7.将装有细胞的冻存管放入程序降温冻存盒，-20°C放1-2h后，-80°C过夜，然后快速转移到液氮中。
293细胞培养293细胞培养特性：1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在～时,可顺利贴壁生长,?换液时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用%EDTA与%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
12小时-24小时90%以上细胞贴壁。
293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。
3、293细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。
4、复苏293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。
细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%～80%时消化冻存,复苏时将其全部接种至2个50ml瓶中时较为合适。
刚复苏的293贴壁很慢，复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。
复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。
换液前宜将培养基预热。
5、转染：体外应用293细胞进行细胞转染时，如果是采用磷酸钙转染，一定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘，长满细胞时加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落，最好是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染，可以避免细胞的大量脱落。
其它的经验：1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取2、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度，3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。
4、如果细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外细胞污染。
5、如果使用用玻璃培养瓶或皿，可以采用高压灭菌的%明胶溶液预处理培养瓶/培养皿，方法是将明胶加入培养皿，使之浸泡到底面的各个部分，然后吸出，置超净台内晾干即可使用。
这样处理后细胞贴壁效果好且镜下细胞立体感强。
如果是新的塑料培养瓶就不用处理。
培养基；GIBCO DMEM粉剂，加双抗，HEPES，NaHCO3配置高糖的DMEM培养基1000ml，1.一袋DMEM培养基（GIBCOBRL)用去离子水溶解2.加入NaHCO3?3.加入谷氨酰胺?（终浓度为5mM）4.加入青霉素10万U（终浓度100u/ml），链霉素万U（终浓度100u/ml）5.定容900ml6.过滤除菌、分装到两个消毒的500ml瓶子中7.加入灭活小牛血清100ml。
Jurkat细胞（人外周血白血病T细胞），是一种悬浮细胞。
我的经验如下：1、培养液：RPMI1640，15％小牛血清，2％Na2CO3，1％HEPES，青霉素100IU／1ml，庆大霉素100IU／ml；2、培养条件：5％CO2，37度，30％湿度；3、细胞复苏：要快速将冻存管放入37度水中，不断轻轻摇晃，直到细胞完全溶解，加入10ml左右的培养液，800～1000rpm，10分钟离心，之后倒掉液体，加入新的培养基就可以进行培养了；4、细胞培养：起初进行传代时由于细胞刚刚复苏，长得比较慢，所以可以3～4天传一代，传过两代后，一般2～3天传一代，每次传代后在倒置显微镜下观察细胞形态，在传过几代合适的时候可以进行实验。
5、细胞冻存：1000rpm离心后，弃去液体，加入含有15％DMSO的冻存液，按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－80℃1小时）→液氮。
培养经验细胞培养箱在每使用1个月最好用酒精擦洗一次，这样可以减少污染；（2）虽然说加样器放在紫外下照射会不准，但我们还是丢了一把1ml 的加样器在超净台，没有拿出来过，我想这样也许会减少污染；（3）小牛血清我们用的是国产的，所以在一开始的时候加了15％的小牛血清，但细胞总是长不好，后来摸索条件，把小牛血清的量调到了20％，细胞生长旺盛；（4）HEPES虽然贵点，但加上去后细胞会长的不错；（5）在超净台操作前要用％的新洁尔灭或75%酒精擦手。
1.AsPC-1（转移胰腺腺癌细胞）?【细胞复苏的方法】:（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～42℃水浴中，晃动，使其尽快融化（1分钟左右）。
（2）用培养液稀释至原体积的10倍以上，直接培养。
（3）或低速离心，去上清，加新鲜培养液培养。
SK-OV-3?[SKOV-3]细胞，人卵巢癌细胞细胞(株) KM12人结肠癌细胞。