293T 细胞培养
293T细胞培养攻略
293T细胞培养攻略1.培养基准备293T细胞通常使用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）作为培养基，配以10%胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin）。
在培养293T细胞之前，首先将适量的DMEM加热至37°C，并将相应数量的胎牛血清和抗生素加入其中。
2.细胞传代传代细胞是保持293T细胞健康生长和细胞性能的重要步骤。
当细胞达到80-90%的密度时，可以开始细胞传代。
首先，用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养瓶中的培养基洗涤一次，然后用0.25%胰酶/EDTA（乙二胺四乙酸）溶液将细胞溶解5-10分钟。
溶解后，加入与胰酶/EDTA液体相等的培养基，轻轻悬浮细胞，并将其移至新的培养瓶中。
将新的培养基加入新瓶中，以使其达到适当的细胞密度。
3.293T细胞的培养条件4.细胞转染293T细胞被广泛用于转染实验。
细胞转染是将外源DNA转运到293T 细胞中的方法，以研究基因功能或进行蛋白表达。
293T细胞的易于转染性质使其适合于多种转染实验，包括常规的钙磷法和化学法（如聚乙烯亚胺）以及电穿孔法。
在进行转染实验之前，应将细胞培养至80-90%的密度，并在转染之后对其进行恢复。
5.结束实验时的保存和冻存细胞在完成实验后，如果有需要保存细胞的需求，可以将293T细胞冻存。
为此，收集细胞，并用DPBS（无菌磷酸盐缓冲液）洗涤细胞。
然后，用0.25%胰酶/EDTA液解细胞5分钟，并加入相等体积的培养基以停止胰酶的作用。
将细胞离心，并以适当的速度冻存保护液（如10%DMSO和90%FBS）重新悬浮细胞。
将细胞悬浮液分装至冻存管中，并使用液氮保存。
总结：293T细胞是一种常用的细胞系，在生物医学研究中发挥着重要作用。
通过遵循上述培养攻略，可以获得高质量和可靠的293T细胞培养结果。
有针对性的细胞传代、定期更换培养基、温度和CO2的适当控制以及正确的细胞转染和细胞冻存步骤可以确保细胞的生长和稳定性，为细胞实验提供最佳条件。
293T细胞的培养[1]
![293T细胞的培养[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/d6a8872378563c1ec5da50e2524de518964bd36d.png)
293T细胞的培养[1]293T细胞的培养293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。
293T为贴壁细胞, 这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。
培养条件为: 完全培养基: 高糖DMEM, 10%胎牛血清; 冻存液: 胎牛血清或完全培养基, 10% DMSO。
传代方法为:1．吸掉293T细胞培养瓶内的培养液;2．吸取适量的无Ca 2+和Mg 2+的PBS, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍;3．加少量的0.05%胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2的培养瓶加1 ml, 75 cm 2的培养瓶加2~3 ml), 放到培养箱温育20 s;4．细胞消化完毕, 加适量培养液终止消化, 并吹打细胞, 制成均匀的细胞悬液;5．加足量的培养液, 分装到新的培养瓶中。
值得注意的是, 293T细胞的贴壁性不强, 轻微的干扰就可能使它们脱落。
所以, 在更换新鲜培养液或者用PBS冲洗的时候应该小心地添加新的培液进去, 以液体不冲打到贴壁的细胞为好。
传代的时候, 只需要用0.05%胰蛋白酶-EDTA即可轻松把细胞消化下来, 不需要消化很长时间。
有些同学反映293T细胞容易结团不易被吹打开来。
如果遇到这样的情况可以在加了胰蛋白酶温育一段时间后即拿1 ml移液枪反复轻轻吹打, 直至肉眼看不到大的细胞块为止, 然后加适量的培养液混匀, 这时候在显微镜下观察, 可见大多数细胞都是单个的, 只有少量的2~3个细胞聚在一起。
一般293T细胞可以长在塑料的培养瓶底面上直到90%融合, 再以1∶4~1∶8的比率传代。
合适的传代周期为2~3天。
传代过程中,消化的时间越短越好, 显微镜下观察到80%细胞脱落即可加培养液中止。
完成传代后放入培养箱前,应该把培养瓶或培养皿沿X、Y轴方向水平移动几下, 防止细胞都聚在中间或者四周。
冷冻293T细胞的冻存液可以用95%小牛血清加5%二甲基亚砜, 复苏率很高。
七个293-T细胞培养的注意事项
七个293-T细胞培养的注意事项
培养293细胞应注意以下几个方面：
1.用1640加10%胎牛血清，有的种系用DMEM.血清要求质量较高，在普通血清中细胞生长不太好。
1640用双蒸水溶解，按说明加入碳酸氢钠。
2.培养液中应加入HEPES，起缓冲pH值的作用，否则会影响细胞状态。
如果用20%的HEPES，每次配培养液时每200ml培养液可加入 5ml.加入HEPES后1640培养液颜色略呈橘黄色而非暗红色。
3.消化所用胰酶可选择0.125%浓度，且不要消化时间太长。
也有研究者认为不用胰酶，直接吹打使细胞脱壁，但使用胰酶效果较好。
消化时在镜下观察到细胞形态稍有变化即可，不要等形态明显变化后再停止。
可以不用加血清终止消化，只要将胰酶倒出来，加上培养液吹打即可。
4.传代密度不宜过高也不易过低，一般1瓶传3瓶可能比较合适。
5.培养液应该适当偏酸性，在7.0-7.2之间比较好。
一般加上HEPES后，pH值是不用调的。
6.细胞代数越高生长越快，同时性状和原代差别也更大。
一般2-3天传代一次比较合适。
7.传代时细胞密度在80%左右比较好，如果超过90%融合再传会影响细胞状态。
293T细胞培养准则操作规程
293T细胞培养准则操作规程
百利药业⽣物药研发部
标准操作规程
题⽬：293T细胞传代培养操作规程
编号：SOP-M-e-003-
制定者：（签名）⽇期：年⽉⽇
批准者：（签名）⽇期：年⽉⽇
按照⽣物安全柜的标准操作规程，将⽣物安全柜的紫外开启半⼩时。
3.2将含10%胎⽜⾎清和100U/ml双抗的DMEM及PBS放于37℃⽔浴锅中预热。
3.2.1将已长到80%-90%的293T细胞培养瓶从37℃，5%的CO
培养箱中取出，先⽤75%的酒
2
精喷洒于瓶表⾯，将细胞培养瓶旋转放于⽣物安全柜中，⽤⽆菌的移液管吸净其中的培养基，加5ml的预热的PBS洗涤⼀次，吸净PBS。
3.2.2将含EDTA-0.25%tyption⽤PBS稀释两陪到五倍，向该75cm2的细胞瓶中加⼊3ml稀释好的EDTA-0.25%tyption，让其充分平铺于细胞表⾯。
盖好瓶盖，将细胞瓶放在显微镜下观察，直到细胞变圆，加含10%胎⽜⾎清的DMEM终⽌反应，⽤移液管轻轻将瓶上的细胞吹下，
将细胞液移到15ml⽆菌的离⼼管中，1000rpm离⼼3分钟。
3.2.3将离⼼上清吸弃掉，⽤⼿指轻轻拍打离⼼管底将底部细胞分散开，再加3mlDMEM培养基将分散的细胞重悬稀释开，取⼀定量的细胞液进⾏n倍稀释后计数，按照细胞计数标准操作规程进⾏。
3.2.4计数好之后细胞传代密度按照2~5×104个细胞/cm2进⾏传代培养，每个75cm2的培养瓶中加10mlDMEM培养基，放于37℃，5%的CO
培养箱中培养。
2
3.2.5 24⼩时后观察细胞状态，待细胞长到80%-90%时进⾏下⼀次传代培养。
293t细胞的生长特点
293t细胞的生长特点293T细胞是一种广泛应用于生命科学研究的细胞系，其生长特点具有以下几个方面：1. 快速增殖能力：293T细胞具有较高的增殖速度，通常在培养基中可以迅速扩增。
这是因为293T细胞具有较高的代谢活性和细胞分裂速度，能够快速进行DNA合成和细胞分裂，导致细胞数量快速增加。
2. 具有较强的黏附能力：293T细胞具有良好的附着性，可以牢固地附着在培养基或培养器皿表面。
这种黏附能力使得293T细胞在培养过程中不易脱落，有利于细胞的稳定生长。
3. 高度依赖血清因子：293T细胞对培养基中的血清因子依赖性较高。
血清中含有丰富的营养物质和生长因子，可以提供293T细胞所需的营养和生长信号，促进其快速增殖和生长。
因此，在培养293T细胞时，通常需要添加适量的胎牛血清或胎牛血清替代物。
4. 较低的密度限制：293T细胞具有较低的密度限制，可以在相对较高的细胞密度下进行培养。
这意味着在培养293T细胞时，可以将较多的细胞接种到培养器皿中，从而提高细胞的产量和培养效率。
5. 对培养条件的敏感性：293T细胞对培养条件的敏感性较高，包括培养基的组成、温度、CO2浓度等因素。
不同的培养条件可能对293T细胞的生长和功能产生影响，因此，在培养293T细胞时需要对培养条件进行优化和调整，以获得最佳的细胞生长和表达效果。
293T细胞具有快速增殖能力、黏附能力强、依赖血清因子、较低的密度限制以及对培养条件敏感等生长特点。
这些特点使得293T细胞成为广泛应用于生命科学研究中的重要细胞系，尤其在基因工程和蛋白质表达方面具有重要的应用价值。
通过深入了解293T细胞的生长特点，并合理优化培养条件，可以提高细胞的生长和表达效率，为相关研究工作的顺利进行提供有力支持。
293T细胞中包装慢病毒实验方案
慢病毒包装实验⽅方案实验步骤⼀一、细胞培养1、⽤用含10%FBS的H-DMEM培养基于37°C、5%CO2培养箱中培养293T细胞，其中加1×102U/ml⻘青霉素、100µg/ml链霉素和10µg/mlciprofloxacin防⽌止⽀支原体污染，2、待10cm⽫皿中细胞融合度到80%左右，⽤用0.25%胰酶消化293T细胞，分到两个6cm⽫皿中，另⼀一盘10cm293T作同样处理理，使细胞在接种之后的18-24h达到70%融合度。
●注意事项293T细胞转染慢病毒24h之前，培养液中停⽌止使⽤用抗⽣生素和ciprofloxacin，减少对病毒转染的影响；注意接种后的293T细胞密度，过⾼高和过低的细胞密度都会导致转染后细胞死亡。
⼆二、细胞转染3、每个6-cm培养⽫皿在转染之前4h⽤用5ml不不含⾎血清的H-DMEM培养基换液，4、应⽤用500µl Optimum和14.18µl Lipofactamine2000混匀于室温静置5min，将500µl Optimum、1.7µg慢病毒载体、1.13µg psP AX2和0.57µg MD2.G混匀配制成DNA mixture，然后与静置5min的Optimum/Lipofactamine2000混匀，于室温静置20min后，将混匀后的mixture加⼊入到培养基中。
5、6h之后将培养基更更换为含10%FBS的H-DMEM完全培养基，6、分别收集48h、72h和96h的细胞上清液。
●注意事项①293T细胞容易易脱落⽫皿底，加H-DEME沿⽫皿侧壁缓慢加⼊入，并且边加边轻微摇晃使培养基均匀分布⽫皿底防⽌止细胞⽆无培养基死亡②质粒换算要准确，③将mixture加⼊入培养基中要边滴边摇晃培养⽫皿使其mixture与培养基混匀，这样直⾄至结束。
三、病毒收集和浓缩1、将离⼼心机时间和转速参数调⾄至成3000rpm和15min,其中加速度和下降速度降⾄至最低，2、将收集的293T细胞上清液加⼊入超滤管中（⼀一次最多15ml）,3000rpm、15min开始离⼼心，离⼼心结束后⽤用收集病毒，-80℃保存。
293t细胞培养说明书
293T细胞培养说明书一、实验简介293T细胞是由肾脏细胞系统转染外源基因而产生的细胞系，具有较好的培养性和转染性。
因此，293T细胞常用于基因表达研究，尤其是蛋白表达和病毒载体的构建。
二、培养条件1. 培养基：293T细胞培养最常用的培养基是Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)，其次是RPMI-1640培养基。
2. 氧气浓度：293T细胞培养一般需要一个较高的氧气浓度，如5%~10%。
3. 温度：293T细胞的培养温度一般为37℃。
4. 水分：293T细胞的培养液中的水分一般为95%~100%。
5. 添加物：293T细胞的培养液中通常会添加10%的牛血清，以促进细胞生长。
三、细胞培养步骤1. 将293T细胞从细胞库中取出，放入清洗后的培养皿中，以DMEM培养基浸泡；2. 将培养皿放入培养箱，调节温度为37℃，氧气浓度为5%~10%；3. 将添加10%牛血清放入培养液中，搅拌均匀；4. 用细胞活性检测试纸测定细胞活性；5. 根据细胞活性的变化情况，调整培养液中的水分，以维持细胞的生长；6. 将培养液更换，每1~2天更换一次；7. 定期观察细胞形态，记录细胞生长情况。
四、注意事项1. 在培养293T细胞时，需要注意细胞的温度、氧气浓度以及水分，以保证细胞的正常生长；2. 培养液的清洗和更换要及时，以保证细胞的正常生长；3. 在操作293T细胞时，一定要注意实验室的清洁卫生，以防止细胞的污染。
五、总结293T细胞培养是一种常用的培养方法，在培养293T细胞时，要注意培养液的温度、氧气浓度以及水分，并及时更换培养液，以保证细胞的正常生长。
在实验操作中，还要注意实验室的清洁卫生，以防止细胞的污染。
293T 细胞培养
293T 细胞培养1.培养基: DMEM =丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37 度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml 离心管，加5ml 培养基，500g 离心5min，弃上清，加1ml 培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml 左右，记得晃匀。
3. 传代:吸出旧培基，加5mlPBS 洗一遍，用移液管加1ml 胰酶，洗一遍吸出，37 度放1min 左右计时，看到大片大片脱落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml 新培育基的新瓶里。
293T 细胞是用5 型腺病毒75 株系转化，含有Ad5 E1 区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1 区缺陷互补细胞系。
293T 细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5 和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293T 细胞的大规模培养。
293T 细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM 中能生长很好。
一般来讲，1:10 传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293T 细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293T 细胞在传代120 次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293 细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH 值在6.9～7.1 时,可顺利贴壁生长, 换液293T 时动作要轻。
一般用高糖的DMEM 培养基。
2、传代：倒去废液，PBS 洗一次（轻），用0.02%EDTA 与0.25%Trypsin 消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin 作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM 终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
HEK293T细胞培养
细胞系的第一步。
细胞的培养具体方法与步骤
传代培养
传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到
另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消
化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传 代法或离心法传代。
HEK293T和HEK293细胞
HEK293细胞简介
HEK293细胞在倒置显微镜下的形态
细胞污染问题与解决方案
细胞的真菌污染
梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多为烟曲
霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。
真菌污染后，霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色
漂浮物。
细胞污染问题与解决方案
细胞的真菌污染检测
镜检有丝状物
细胞污染问题与解决方案
常见的真菌污染
HEK293细胞的复苏
复苏前的准备
DMEM完全培养基(含10%胎牛血清)：试验前置室温下
将水浴锅预热至37℃
取新培养瓶（75cm2），标记细胞编号、时间，加入10ml DMEM培
养基(37℃预热)，润湿底面
HEK293细胞复苏步骤
根据冻存记录从液氮灌中取出冻存的细胞
迅速投入已经预热至37 ℃的水浴锅中，并快速晃动，在1-2 min内使完全融化
服传出细胞间外。
进入细胞间必须养成随手关门习惯。操作期间，细胞间外门和中门必须处于关 闭状态。
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细胞间的操作注意事项
操净工作台实验前和试验后的灭菌，打开紫外灯15-20分钟。
试验操作期间，应戴手套。并注意随时用75%酒精消毒双手。
实验操作期间，操净工作台的风机应处于打开状态。操作结束后，关闭挡板、 关闭风机。 凡是带入操净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶等到额瓶子均要用75% 酒精擦拭瓶子的外表面。 使用倒置显微镜前，用75%酒精擦拭消毒载物台 使用二氧化碳培养箱时，应尽量缩短开门时间，减少开门次数。 每次倒置显微镜观察细胞后，用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，再放入 放入培养箱中继续培养。
293T 细胞说明书
人胚肾细胞293T说明书中国科学院干细胞库编号：SCSP-502细胞名称：293T细胞描述：人胚肾细胞（293细胞株插入SV40 T-抗原基因后产生的高转染效率的衍生株称为293T）。
该细胞最初的名字是293tsA1609neo，携带SV40复制序列，被广泛用于逆转录病毒生产、基因表达和蛋白表达。
物种：人细胞来源：2015年新引进ATCC numbe r：CRL-3216™生物安全等级：BSL-2完全培养液配方：见下方备注批次/冻存日期：详见冻存管/培养瓶标识参考传代周期：3-4天参考传代比例：1:3-1:4参考换液频率：2-3天冻存液配方：培养液95%，DMSO 5%细胞状态：上皮样，贴壁生长。
细胞贴壁能力较弱。
支原体检测结果：阴性STR鉴定结果：D5S818: 8,9；D13S317: 12；D7S820: 11；D16S539: 9,13；vWA: 16,19,20；THO1: 7,9.3；Amelogenin: X；TPOX: 11；CSF1PO: 11,12293T细胞照片备注：1. 人胚肾细胞293T完全培养液配方（100 ml）：DMEM (Invitrogen, 12430054) 87 mlFBS (Gibco) 10 ml Glutamax (Invitrogen, 35050061) 1 mlNon-essential Amino Acids, 100⨯ (Invitrogen, 11140050) 1 ml Sodium Pyruvate 100 mM Solution（invitrogen 11360070） 1 ml2. 我库冻存时，每支冻存管约含1⨯106细胞量，体积为500 μl，预期存活率70%，建议复苏至1个T25培养瓶中。
3. 注意事项：该细胞贴壁能力较弱，培养时可酌情使用预铺明胶的培养瓶/培养皿。
详情访问中科院干细胞库/干细胞技术平台/index.asp；电话：************感谢您选择我们的服务！中国科学院干细胞库/干细胞技术平台。
293T细胞的培养[1]
![293T细胞的培养[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/40bc40de6137ee06eff918ce.png)
293T细胞的生长状态直接关系到包装病毒和转染的效率, 应尽量选择传代次数少, 培养总时间短的细胞。从细胞形态上看, 相差显微镜下观察立体感强并且形态良好的细胞产病毒率或者转染效率都很高。
虽然293T细胞的应用非常广泛, 几乎每个实验室都有一株自己的293T细胞株, 但是经常有同学提出: 为什么在正常的培养条件下, 细胞却很难传代下去, 包装病毒效率很低, 对转染效率也不满意呢？
事实上, 引起类似问题的元凶是一种生物界最小的原核细胞生物－支原体。支原体污染后, 它们不会使细胞死亡而是与细胞长期共存, 培养基不发生浑浊, 细胞无明显变化, 外观上给人以正常感觉, 但事实上细胞正在受到到多方面影响, 如引起细胞变形, 影响DNA合成, 抑制细胞生长等。我们曾经收集到四株分别来自四个不同实验室的293T细胞, 经检测均为支原体阳性, 令人惊讶的是这四株细胞都已经不是典型的293T细胞形态, 每两株之间比较竟然形状各不相同, 很难相信这是同一种细胞！这些支原体阳性细胞普遍传代周期长, 显微镜下观察细胞碎片多, 长期支原体感染已经使这些细胞羸弱不堪, 胞内DNA和蛋白质合成受到严重的影响。
293T细胞的培养
293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。
293T为贴壁细胞, 这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。培养条件为: 完全培养基: 高糖DMEM, 10%胎牛血清; 冻存液: 胎牛血清或完全培养基, 10% DMSO。
传代方法为:
1．吸掉293T细胞培养瓶内的培养液;
2．吸取适量的无Ca 2+和Mg 2+的PBS, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍;
3．加少量的0.05%胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2的培养瓶加1 ml, 75 cm 2的培养瓶加2~3 ml), 放到培养箱温育20 s;
293t
293T细胞的培养关键词：293T细胞慢病毒包装培养 2011-10-28 18:14 来源：丁香园点击次数：5037包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7. 将细胞离心，1000rpm，2min。
8.根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+ 20% FBS + 10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
9. 分装进细胞冻存管，放入泡沫盒中，放入-80℃超低温冰箱。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
11. 复苏检测细胞存活率，细胞状态等，并记录。
二. 293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
5. 放回37℃、3%CO和95%相对湿度的培养箱中培养。
2三. 293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
和95%相对湿度的培养箱中培养。
293t细胞培养步骤
293t细胞培养步骤嘿，咱今儿就来唠唠 293T 细胞培养那些事儿！这可真是个精细活儿呢。
先说说细胞复苏吧，这就好比唤醒一个沉睡的小宝贝。
得小心翼翼地从液氮罐里把冻存管取出来，动作可得轻柔点儿，别把人家给弄醒哭啦！然后快速地在 37 度的温水里晃悠晃悠，让细胞慢慢解冻。
等解冻好了，就把细胞混悬液转移到离心管里，离心一下，去掉那冻存液，就像给小宝贝洗个澡，把身上的脏东西洗掉。
接下来就是细胞接种啦，这就像是给小宝贝找个舒服的小窝。
把处理好的细胞混悬液轻轻滴到培养瓶里，让它们舒舒服服地躺在那。
这里可得注意啦，培养液得选对，就像给小宝贝准备合适的奶粉一样，可不能马虎。
然后就是培养啦，这可真是个需要耐心等待的过程。
要把培养瓶放在合适的温度和环境里，让细胞们开开心心地长大。
这就好像看着小宝贝一点点成长，心里充满了期待。
细胞培养过程中，还得时刻留意着它们的状态。
看看有没有长歪啦，有没有不开心啦。
如果培养液变黄了，那就说明细胞们饿啦，得赶紧给它们加点“食物”。
要是细胞长得太密了，那就像小宝贝们在房间里挤来挤去，得给它们分个家，不然它们可要不高兴咯。
培养一段时间后，还得给细胞传代呢。
这就像是小宝贝长大了，要换个更大的房间。
把细胞混悬液分成几份，分别放到新的培养瓶里，让它们继续快乐成长。
哎呀，培养 293T 细胞可真是不容易啊，但看到它们茁壮成长，那感觉就像看着自己精心培育的花朵绽放一样，别提多有成就感了！所以啊，咱可得认真对待每一个步骤，就像对待宝贝一样细心呵护。
只有这样，才能让这些细胞们健康快乐地成长，为我们的实验和研究提供有力的支持呀！你说是不是这个理儿呢？总之呢，293T 细胞培养虽然有点麻烦，但只要咱有耐心，有细心，就一定能把它们养得好好的。
让我们一起加油，为科学研究贡献自己的力量吧！。
293T-20170630-细胞培养过程图
293T-细胞培养过程图
1.293T-复苏-20170630图，两管。
1、2。
细胞密度：4.3×106，复苏分两管。
此细胞为半贴壁半悬浮细胞。
图 1 293T-20170630-复苏-1
图 2 293T-20170630-复苏2
复苏24h：复苏后细胞有明显的增多，但是细胞贴壁状态不好，大多细胞为悬浮细胞。
轻轻摇动会有很多细胞飘动。
图3复苏24h后41
图4复苏后24h2
复苏48h：复苏后，第一管细胞增加数量不明显。
但第二管呈明显增加，细胞生长较密，但大多细胞飘浮。
轻轻摇动细胞飘动。
选择换液继续培养。
图5复苏48h后1
图6复苏48h后2
48h换液：未消化，直接离心后换液培养。
轻轻吹打后，直接离心换液，未消化。
感觉细胞沉淀明显，记数在2.7×106左右。
图7 48h换液后1
图8 48换液后2
换液培养后，细胞飘浮多，贴壁效果差。
将细胞悬液吸出。
转入新的培养基。
并将贴壁细胞消化后传代。
图9 293T-7.4号消化传代1
图10 293T-7.4号消化传代2
细胞飘浮悬液传代培养图：悬液细胞生长速度很快。
但贴壁效果差。
图11 293T-7.4悬液传代1。
293T 细胞培养
293T细胞培养1.培养基:DMEM=丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g 离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。
3.传代:吸出旧培基，加5mlPBS洗一遍，用移液管加1ml胰酶，洗一遍吸出，37度放1min 左右计时，看到大片大片脱落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml新培育基的新瓶里。
293T细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。
293T细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293T细胞的大规模培养。
293T细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。
一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293T细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293T细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长,换液293T时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
293t细胞生长规律
293t细胞生长规律
293T细胞是一种常用的人源胚胎肾细胞株，广泛应用于生物学研究中。
了解293T细胞的生长规律对于实验设计和数据解读都至关重要。
293T细胞的生长速度在不同的培养条件下可能有所差异。
一般来说，293T细
胞在适宜的培养基中以指数增长。
在培养基中，细胞从一个发育阶段到下一个发育阶段需要一定的时间。
初始阶段，细胞数量较少，生长速度较慢。
当细胞数量达到一定密度后，细胞开始进入快速增长期，细胞数量呈现爆发性增加。
当细胞达到稳定期时，细胞的增长速度开始减缓，直至停止。
在培养293T细胞时，需要注意维持细胞的适宜密度。
细胞密度过低会导致细
胞生长受限，细胞无法进入正常的增长周期。
细胞密度过高会导致细胞自相互竞争资源，影响细胞的生长速度和生理状态。
因此，在培养293T细胞时，通常会定期
进行细胞的分脱和传代，以维持细胞的适宜密度和活力。
除了细胞密度外，培养293T细胞的温度、pH值和营养物质等条件也会对细胞
的生长规律产生影响。
293T细胞通常在37°C的恒温培养箱中培养，pH值在7.2-
7.4之间。
培养基中的营养物质如含量适当且平衡，能够提供细胞所需的能量和营
养物质，有利于细胞的正常生长。
总之，了解293T细胞的生长规律对于细胞培养和相关实验非常重要。
掌握并
维持适宜的生长条件和细胞密度，可以保证293T细胞的良好生长和实验的准确性。
HEK293T细胞培养
03
hek293t细胞培养的过程
细胞培养前的准备
细胞培养环境的准备
确保细胞培养实验室的清洁和消毒，准备好所需的培养基、细胞 培养瓶、酶等试剂。
细胞复苏和传代
从液氮或-80℃冰箱中取出细胞，进行复苏和传代，以获得足够的 细胞数量。
05
hek293t细胞培养的挑战与解决方案
细胞培养中的污染问题
污染来源
细胞培养中的污染可能来自培养环境、培养基、细胞本身和操作 过程等。
污染类型
常见的污染类型包括细菌、霉菌、支原体和病毒等。
解决方案
定期检查培养环境、培养基和细胞，使用一次性耗材，严格遵守 无菌操作规程，定期进行支原体检测等。
细胞培养中的生长问题
细胞培养过程中的注意事项
防止污染
维持适宜的pH值
严格控制细胞培养环境，定期对培养基和 细胞进行无菌检测，以防止细菌、霉菌等 污染。
监测培养基的pH值，并适时调整，以确保 细胞的正常生长。
避免细胞交叉污染
注意安全操作
在操作过程中，确保不同种类的细胞分开 存放，避免交叉污染。
操作过程中要穿戴实验室防护服、手套等 防护措施，避免直接接触细胞和培养基， 以防止潜在的生物危害。
选、基因治疗和疫苗研发等。
02
hek293t细胞培养的原理
细胞培养的基本原理
细胞是生命的基本单位，具有自我复 制和分化的能力。在适宜的环境下， 细胞可以生长、繁殖并维持其生物学 特性。
细胞培养技术广泛应用于生物学、医 学、药学等领域，是研究细胞生理、 病理和药理等方面的重要手段。
293t细胞表达蛋白条件
293t细胞表达蛋白条件293T细胞是一种常用于生物医学研究的细胞系，其特点是易于培养、转染效率高以及对多种病毒感染的敏感性。
因此，293T细胞被广泛用于表达外源蛋白和研究蛋白功能的实验中。
下面将介绍293T细胞表达蛋白的条件和相关注意事项。
一、细胞培养条件293T细胞的培养基选择常用的DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养基，其中添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（Penicillin-Streptomycin）。
细胞应在37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。
二、转染条件293T细胞的转染效率高，常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、聚乙二醇共转染法和脂质体介导转染法等。
选择合适的转染方法需要根据实验目的和所需蛋白的性质来确定。
1. 磷酸钙共沉淀法：将目的蛋白的表达质粒与磷酸钙混合后加入293T细胞培养基中，经过一定时间的培养后，蛋白便可表达出来。
2. 聚乙二醇共转染法：将目的蛋白的表达质粒与聚乙二醇混合后加入293T细胞培养基中，经过一定时间的培养后，蛋白便可表达出来。
3. 脂质体介导转染法：将目的蛋白的表达质粒与脂质体混合后加入293T细胞培养基中，经过一定时间的培养后，蛋白便可表达出来。
三、表达蛋白的时间点和条件293T细胞表达外源蛋白的时间点和条件需要根据实验目的和所需蛋白的性质来确定。
一般情况下，培养细胞24-48小时后即可开始检测蛋白表达情况。
蛋白的表达水平可以通过Western blot、免疫荧光染色等方法进行检测。
四、相关注意事项1. 在进行293T细胞的培养和转染实验时，需采取无菌操作，以防止细菌和真菌的污染。
2. 在培养293T细胞时，应注意细胞的密度和培养时间。
细胞密度过高或培养时间过长会导致细胞凋亡或分化，影响蛋白的表达。
3. 选择合适的转染方法和转染试剂，以提高蛋白表达效率。
4. 在进行蛋白表达实验时，可以根据需要添加适当的药物，如蛋白酶抑制剂、翻译抑制剂等，以提高蛋白的稳定性和纯度。
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293T细胞培养
1.培养基:DMEM=丙酮酸钠++10%血清++青链霉素
2.复苏：
37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。
也不易打散。
悬浮的293T细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293T细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：
1、细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长,换液293T时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
12小时-24小时90%以上细胞贴壁。
293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比
其它的经验：1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取
2、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度，
3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。
4、如果细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外细胞污染。
细胞的复苏：
快速取出冻存的低代次293细胞，将其安放在底端1／2浸于37℃水浴中，轻轻晃动以加速融解。
在超净工作台中，以70％乙醇对细胞培养皿表面消毒，将细胞转移至75cm的细胞培养瓶中，加入10mL低代次293细胞培养基置于细胞培养箱内培养。
6～8h后待细胞贴壁更换培养基。
(1)利用低代次293细胞贴壁的特性，在复苏和传代时不离心，而是加入10mL培养基中和细胞消化液，培养6～8h，细胞贴壁后更换新鲜培养基，从而避免了离心剪切力对细胞造成的机械损伤；
(2)在消化细胞时，振荡培养瓶，避免直接反复剧烈吹打细胞。
细胞形态观察、贴壁率和生长曲线。