蛋白质一级结构测定
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如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L 尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。
2021/3/11
8
★巯基的保护
-OOC CHCH2 SH NH3+
O
C H2O C C l
-OOC CHCH2 SOCCH2
CH2Cl
NH3+
O
-OOC CHCH2 SCH2
O
NH3+
水解速度与相邻AA性质有关: 酸性：-/碱性：+
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15
O
O
O
O
NHCHC NHCHC NHCHC NHCHC
R1
R2
水解位点
R3
R4
肽链
胃蛋白酶 Pepsin
• 特点专一性与糜蛋白酶相似，较弱； • 断裂位点：两侧的残基都是疏水性氨基酸 • R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、
14
糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）
O
O
O
O
NHCHC NHCHC NHCHC NHCHC
R1
R2
R3
水解位点
R4 肽链
• 特点：专一性稍弱，Leu、Met和His稍慢 • 断裂位点：Phe（苯丙）、Trp（色）、Tyr（酪）等疏水氨基
酸残基的羧基端肽键 • R1=Phe（F）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AA • R2=Pro（抑制）
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5
①测定蛋白质氨基酸残基组成
根据蛋白质分子量，计算出构成蛋白质的各种氨 基酸的数量；
采用经典的阳离子交 换色谱分离、茚三酮 柱后衍生法，对蛋白 质水解液及各种游离 氨基酸的组分含量进 行分析。
2021/3/11
6
②测定蛋白质分子中多肽链的数目
通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分 子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
➢ 梭菌蛋白酶：
高专一性 断裂位点：Arg残基的羧基端肽键
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化学法
溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸 的羧基所形成的肽键。
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Байду номын сангаас
溴化氰水解法(Cyanogen bromide)
---选择性地切割由Met羧基形成的肽键
CH3 S：
CH2
CH2 O
RO
Br-
12
酶解法
某些蛋白水解酶能够选择性的水解多肽链中的 某一类肽键；
主要有胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热 菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶；
糜蛋白酶（chymotrypsin):苯丙氨酸、色氨酸、酪氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、组氨酸；
胃蛋白酶（pepsin)：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮 氨酸、以及其他疏水性强
A. 样品必需纯（>97%以上）； B. 知道蛋白质的分子量； C. 知道蛋白质由几个亚基组成； D. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量
计算每种氨基酸的个数。 E. 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。
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4
（2）蛋白质分子的一级结构测定方法
氨基酸组成分析 氨基酸末端分析 蛋白质中肽链的拆离 肽链的部分降解及肽片断的分离 肽段氨基酸顺序测定及肽段重叠 二硫键与酰胺基的定位
Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快 • R1=Pro（抑制） • pH2.0
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嗜热菌蛋白酶（thermolysin)
➢ 特点：专一性较差 ➢ 断裂位点：Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Tyr、Met等疏
水性强氨基酸残基的羧 基端肽键 • R2=Phe（F）、 Trp（W）、 Tyr（Y）、Leu（L）、
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10
⑤利用酶选择性降解和溴化氰选择性降解
获得的各肽段的氨基酸顺序彼此间的交替重 叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序； 确定多肽链中二硫键的位置。
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2、多肽链氨基酸顺序分析
• 多肽链降解必须满足两个条件： 选择性强、反应产率高 主要方法包括酶解法和化学法
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胰蛋白酶（trypsin）
O
O
O
O
NHCHC NHCHC NHCHC NHCHC
R1
R2
水解位点
R3
R4
肽链
• 特点：专一性较强，水解速度快 • 断裂位点：赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键 • R1=Lys（赖、K）和Arg（精、R） • R2=Pro（抑制）
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ICH2CNH2
-OOC CHCH2 SCH2CNH2
NH3+
O
用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化
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9
④多肽链的选择性降解及肽段的氨基酸组成和顺 序的测定
用酶溴化氢选择性降解多肽链产生的肽段用酸水解、碱 水解（针对色氨酸分析）或酶水解后，用氨基酸自动分析 仪测定； 测定并计算出蛋白质的氨基酸种类和数量；用Edman反 应分析各肽段氨基酸顺序；
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7
③二硫健的断裂及多肽链的拆分
由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分单独分 离出来；
几条多肽链通过二硫键交联在一 起。可在8mol/L尿素或 6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键 还原为巯基；
用过氧酸氧化或巯基化合物还原二硫键断裂，用烷基化试 剂保护生成的巯基，防止其重新被氧化；
第三章 蛋白质的一级结构的测定
2021/3/11
1
蛋白质氨基酸顺序的 测定是蛋白质化学研究 的基础。
自从1953年F.Sanger 测定了胰岛素的一级结 构以来，现在已经有上 千种不同蛋白质的一级 结构被测定。
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2
蛋白质的一级结构的测定是一项非常复杂的工作
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3
（1）测定蛋白质的一级结构的要求
N末端的测定
二硝基氟苯法（DNFB法）；二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-CL 法）；异硫氰酸苯脂法（PITC 法）；
Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA 水解速度较快
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➢ 木瓜蛋白酶：
专一性差 断裂位点：对Arg和Lys残基的羧基端肽键敏感
➢ 葡萄球菌蛋白酶：
高专一性 断裂位点：Glu和Asp残基的羧基端肽键
——磷酸缓冲液 Glu残基的羧基端肽键 ——碳酸氢铵、醋酸铵缓冲液）
NH CH C NH CH C + Br C+ N
CH3 S+ C N
CH2
CH2 O
RO
NH CH C NH CH C
CH2
CH3 S C N CH2 O
RO
+
NH CH C NH CH C
H2O
CH2 CH2 O NH CH C O
高丝氨酸内酯
+ H3N+
RO CH C
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（2）多肽链的末端氨基酸测定
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★巯基的保护
-OOC CHCH2 SH NH3+
O
C H2O C C l
-OOC CHCH2 SOCCH2
CH2Cl
NH3+
O
-OOC CHCH2 SCH2
O
NH3+
水解速度与相邻AA性质有关: 酸性：-/碱性：+
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O
O
O
O
NHCHC NHCHC NHCHC NHCHC
R1
R2
水解位点
R3
R4
肽链
胃蛋白酶 Pepsin
• 特点专一性与糜蛋白酶相似，较弱； • 断裂位点：两侧的残基都是疏水性氨基酸 • R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、
14
糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）
O
O
O
O
NHCHC NHCHC NHCHC NHCHC
R1
R2
R3
水解位点
R4 肽链
• 特点：专一性稍弱，Leu、Met和His稍慢 • 断裂位点：Phe（苯丙）、Trp（色）、Tyr（酪）等疏水氨基
酸残基的羧基端肽键 • R1=Phe（F）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AA • R2=Pro（抑制）
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①测定蛋白质氨基酸残基组成
根据蛋白质分子量，计算出构成蛋白质的各种氨 基酸的数量；
采用经典的阳离子交 换色谱分离、茚三酮 柱后衍生法，对蛋白 质水解液及各种游离 氨基酸的组分含量进 行分析。
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6
②测定蛋白质分子中多肽链的数目
通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分 子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
➢ 梭菌蛋白酶：
高专一性 断裂位点：Arg残基的羧基端肽键
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化学法
溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸 的羧基所形成的肽键。
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Байду номын сангаас
溴化氰水解法(Cyanogen bromide)
---选择性地切割由Met羧基形成的肽键
CH3 S：
CH2
CH2 O
RO
Br-
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酶解法
某些蛋白水解酶能够选择性的水解多肽链中的 某一类肽键；
主要有胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热 菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶；
糜蛋白酶（chymotrypsin):苯丙氨酸、色氨酸、酪氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、组氨酸；
胃蛋白酶（pepsin)：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮 氨酸、以及其他疏水性强
A. 样品必需纯（>97%以上）； B. 知道蛋白质的分子量； C. 知道蛋白质由几个亚基组成； D. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量
计算每种氨基酸的个数。 E. 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。
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（2）蛋白质分子的一级结构测定方法
氨基酸组成分析 氨基酸末端分析 蛋白质中肽链的拆离 肽链的部分降解及肽片断的分离 肽段氨基酸顺序测定及肽段重叠 二硫键与酰胺基的定位
Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快 • R1=Pro（抑制） • pH2.0
2021/3/11
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嗜热菌蛋白酶（thermolysin)
➢ 特点：专一性较差 ➢ 断裂位点：Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Tyr、Met等疏
水性强氨基酸残基的羧 基端肽键 • R2=Phe（F）、 Trp（W）、 Tyr（Y）、Leu（L）、
2021/3/11
10
⑤利用酶选择性降解和溴化氰选择性降解
获得的各肽段的氨基酸顺序彼此间的交替重 叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序； 确定多肽链中二硫键的位置。
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2、多肽链氨基酸顺序分析
• 多肽链降解必须满足两个条件： 选择性强、反应产率高 主要方法包括酶解法和化学法
2021/3/11
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胰蛋白酶（trypsin）
O
O
O
O
NHCHC NHCHC NHCHC NHCHC
R1
R2
水解位点
R3
R4
肽链
• 特点：专一性较强，水解速度快 • 断裂位点：赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键 • R1=Lys（赖、K）和Arg（精、R） • R2=Pro（抑制）
2021/3/11
ICH2CNH2
-OOC CHCH2 SCH2CNH2
NH3+
O
用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化
2021/3/11
9
④多肽链的选择性降解及肽段的氨基酸组成和顺 序的测定
用酶溴化氢选择性降解多肽链产生的肽段用酸水解、碱 水解（针对色氨酸分析）或酶水解后，用氨基酸自动分析 仪测定； 测定并计算出蛋白质的氨基酸种类和数量；用Edman反 应分析各肽段氨基酸顺序；
2021/3/11
7
③二硫健的断裂及多肽链的拆分
由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分单独分 离出来；
几条多肽链通过二硫键交联在一 起。可在8mol/L尿素或 6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键 还原为巯基；
用过氧酸氧化或巯基化合物还原二硫键断裂，用烷基化试 剂保护生成的巯基，防止其重新被氧化；
第三章 蛋白质的一级结构的测定
2021/3/11
1
蛋白质氨基酸顺序的 测定是蛋白质化学研究 的基础。
自从1953年F.Sanger 测定了胰岛素的一级结 构以来，现在已经有上 千种不同蛋白质的一级 结构被测定。
2021/3/11
2
蛋白质的一级结构的测定是一项非常复杂的工作
2021/3/11
3
（1）测定蛋白质的一级结构的要求
N末端的测定
二硝基氟苯法（DNFB法）；二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-CL 法）；异硫氰酸苯脂法（PITC 法）；
Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA 水解速度较快
2021/3/11
17
➢ 木瓜蛋白酶：
专一性差 断裂位点：对Arg和Lys残基的羧基端肽键敏感
➢ 葡萄球菌蛋白酶：
高专一性 断裂位点：Glu和Asp残基的羧基端肽键
——磷酸缓冲液 Glu残基的羧基端肽键 ——碳酸氢铵、醋酸铵缓冲液）
NH CH C NH CH C + Br C+ N
CH3 S+ C N
CH2
CH2 O
RO
NH CH C NH CH C
CH2
CH3 S C N CH2 O
RO
+
NH CH C NH CH C
H2O
CH2 CH2 O NH CH C O
高丝氨酸内酯
+ H3N+
RO CH C
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（2）多肽链的末端氨基酸测定