抗细菌转基因工程 课程资料

水稻细条病的发病特点
• 危害水稻的主要特点:
主要侵害水稻叶片,病斑初呈暗绿色水橫状半透明 小斑点,后逐渐沿叶脉方向扩展,成黄褐色,干结后 呈黄色树胶状小粒,形如虚线,不易脱落。发病严iR 吋,条斑融合成不规则的黄褐色至枯白色大斑块,外 观与白叶枯病有些相似,但对光观察,病斑呈半透明 状。病害流行时,叶片卷曲,完全呈一片白色。该病 在水稻生长前期、后期都易感染,苗期症状较白叶 枯病明显;病害严重时能引起稻株早期死亡或不能 抽穂。即使能够抽穗结实,但批谷增多,千粒重降低。 一般年份可减产10%-20%,在气候条件沾发病严重 时达40%。
（5） 生根培养
• 当分化的小苗生长到 4-5cm 时，将其转移到生根培养基 （每升中含 25mL MS 大量元素、5mLMS 微量元素混合 液、5mL 铁盐、30g 蔗糖、3g 植物凝胶、0.1mg/LNAA、 0.1g 肌醇、0.3g 酪蛋白、0.5g 谷氨酰胺及 0.5g 脯氨酸， 调节 PH 至 5.8）上，上述温度和光照的条件下继续培养 30天左右。
图2.6阳性克隆质粒的EcoR I C A)和Sac I (B)酶切图谱 .1:质粒;Ml: 250 by DNA ladder maker; M2: 1 kb DNA ladder marker.上述酶切结果与 Premier Primer 5.0分析的理论酶切片段大小相符，表明Rxol基因整合到了双边界载 体中，且位于T DNA相邻的左右边界之间。
—l0kb
1:质粒;2: Marker.
(3) pMNDRBBin6-Rxol经EcoR I酶切后产生4个片段，大小 分别为9378bp, 8576bp, 1632bp和1268bp (9378bp和 8576bp片段长度相近，图中合为一条粗带)(图2.6A); Sac I酶 切产生5个片段，大小分别为8525bp, 5194bp, 2683bp, 1763bp和1528bp(图2.6B )
(2)阳性克隆筛选
• 将过夜连接产物转化大肠杆菌，在LB固体培养基(含SOmg/L 壮观霉素)上涂布37℃培养，挑取转化子单克隆于LB培养基( 含SOmg几壮观霉素)中振荡培养Sh;提取转化子质粒进行扩 增，使用引物Rxol-F (5‘ACTCGGTAAACCTACGGACTGA3’)和Rxol-R (5‘-CTTCCTGCAGGTATACCACTCC-3’ )筛选 获得阳性克隆;筛选出1个转化子，其特异性扩增片段与 1.45kb目的基因片段Rxol大小相符。提取该克隆质粒DNA 进行PCR扩增，扩增片段大小与阳性对照pCAMBIA13051-Rxol相同，将产物回收纯化连接到pMD20-T上测序，与 目的基因序列比对相同，表明Rxol基因片段已整合到 pMNDRBBin6载体中。
质粒pCAMBIA1305-1-Rxol经内切酶Sac I和NgoM IV酶切 ，得到大小为8.Skb的Rxol目的基因片断(图A )，载体 pMNDRBBin6经Hpa I和Xma I酶切，得到大小为12.3kb的 线性化双右边界载体(图B )
A: Sac I和NgoM N酶切pCAMBIAI305-I-Rxol; B: Hpa I和Xma I酶切pMNDRBBin6; I: pCAMBIA1305-1-Rxol; 2: pMNDRBBin6;M: 250 by DNA Marker.
(3)阳性克隆酶切鉴定和PCR扩增 (4)载体序列分析 (5)保存阳性克隆，以备后续遗传转化工作。
水稻的遗传转化
• 将处理好的种子诱导培养基 MS（含 100 mL/L MS 大量元素混合液上，26℃培养箱中暗培养约 30 天。 • （1） 继代培养 • 将上述诱导的质地紧密、色泽鲜艳的胚性愈伤组 织在超净台中用镊子剥离，转移到继代培养基中 （MS 培养基，如上），2 周后选择原胚性愈伤组 织分化出来的质地均匀、颗粒较小、色泽良好的 愈伤颗粒继代一次，共继代 2 次。
主讲人：李立志 第三小组成员:李立志、李小强、李瑜
水稻细条病的发现
• 水稻细菌性条斑病(简称细条病)由 Xanthomonascam Pestris pv. Oryzicola （简称Xoc）引起。 • 最早在1918年由Reinking首次报道了菲律 宾水稻上发生细条病,在我国范怀忠等(1957) 于20世纪50年代在广东省首先发现该病害。 开始时误认为是白叶姑病，后经方中达等 (1957)将该病与白叶枯病区分开来’确认为 一种新的由细菌性病害。
（3） 侵染、共培养与筛选
• 材料为在继代培养基上生长 4-5 天的愈伤组织，将愈伤组织转移到灭 菌滤纸上吸湿 20min 后转移到调好浓度的菌液中；摇床中缓慢摇晃 20-30 min ； • 倒掉菌液，于灭菌滤纸上吸弃多于菌液；取出愈伤，播于铺有一层滤 纸的共培养培养基（PH 为 5.2 的 MS 培养基）中，20℃生化培养箱 中恒温培养 2-3 天。 • 当共培养的愈伤周围出现明显的菌体时，将其转移至灭菌滤纸上，吸 去表面菌体后用含有 150mg/L 头孢噻奎钠和 200 mg/L 羧苄青霉素的 无菌水中，100 rpm 振荡 30 min，重复 3 次；将洗过的愈伤转移至灭 菌滤纸上，吸取多于水分； • 将愈伤接入筛选培养基（含有 150 mg/L 头孢噻奎钠和 200 mg/L 羧 苄青霉素及 50 mg/L 潮霉素）中，26℃避光筛选 15-20 天后将未变 黑的愈伤转移到新的筛选培养基，重复 2 次。
（4） 植株再生
• 将筛选培养基上的抗性愈伤组织介入预分化培养基（含有 N6 大量、MS 微量、铁盐、1 mg 烟酸、10 mg VB1、1 mg VB6、0.1g 肌醇、0.3g 酪蛋白、0.5g 甘氨酸、0.5g 脯氨百度文库、30g 蔗糖、3g植物凝胶、2.2 mg NAA、2.5 mg 6-BA，PH 为 5.8）上，26℃暗培养 7 天后在 12 小时光 照、12小时黑暗的条件下培养 7 天。 • 将预分化的抗性愈伤组织接入铺有无菌滤纸的培养皿中， 干燥处理3 小时后转移到分化培养基（每升含有 N6 大量、 MS 微量、铁盐、1 mg 烟酸、10 mg VB1 mgVB6、0.1g 肌醇、0.3g 酪蛋白、0.5g 甘氨酸、0.5g 脯氨酸、30g 麦 芽糖、3g 植物凝胶、0.5 mg NAA、1.5 mg 6-BA，PH 为 5.8）上，在 26℃环境中 12 小时光照及 12 小时避光的条 件下，培养至愈伤变绿，长出少量根，且分化出茎叶。
（1）美国Kansas州立大学的Scot H. Hulbert博士提供pCA1ViBIA1305-
1质粒，其中
携带有外源目的基因Rxol;
pCAMBIA1305-1质粒
（2）澳大利亚CSIRO Plant Industry的M Upadhyaha博士提供双右边界 双元载体pMNDRBBin6。该载体用于转接Rxol基因并将重组体转化到农 杆菌中进行后续转基因:
（2） 农杆菌活化
• 将超低温保存的农杆菌划线于含50 mg/L卡那霉素的YEB 培养基上，28℃培养箱中培养24h；挑取单菌落，接于 2mL 含有 50 mg/L 卡那霉素的 YEB 液体培养基中，28℃ 摇床中振荡培养约 36小时；用移液枪吸取 1mL 新鲜菌液 接于 50mL 含 50 mg/L 卡那霉素的 YEB 液体培养基中， 摇菌至 OD600为 0.8-1.0；将活化好的农杆菌离心， 4000rpm，10min，去上清后重悬于 AAM-As （100含 mL/L AAM 大量元素、5 mL/L上述铁盐、0.1mg/L VB1、 0.6mg/L VB6、0.5mg/L 烟酸、0.75mg/L 甘氨酸、100 mg/L 肌醇、876mg/L谷氨酰胺、266mg/L 天冬氨酸、 175mg/L 精氨酸、0.5g//L 酪蛋白、68.5g/L 蔗糖及 36g/L 葡萄糖，调节 PH 至 5.2，灭菌后冷却至约 60℃的培养基 中加入 1mL 10mmol/L 的乙酰丁香酮）液体培养基中， 28℃，200rpm 振摇 3-4 小时，用分光光度计调节 OD600 为 0.7-1.0，即可用于分装、侵染愈伤组织。
基因Rxo1 的双右边界双元载体 的构建
• 1. 1 菌株和载体 • 含有9kb Rxo1 基因的pCAMBIA1305-1 Rxo1 质粒由美国堪萨斯州立大学Scot H. Hulbert 博士提供。pCAMBIA1305-1 质粒 是由澳大利亚CAMBIA 研究中心构建的含 有35S 启动子和细菌卡那霉素抗性基因的 双元载体。采用的农杆菌菌株为EHA105。
Rxo1 基因来源
• Rxo1 基因是来自玉米的一个抗玉米细菌性 条斑病的寄主抗性基因，将其转入水稻后 转基因水稻中接种细菌性条斑病病原菌， 在接种点处表现典型的 HR 表型，证实该 基因为一重要的非寄主抗性基因。
Rxo1 基因定位
• Rxo1 基因CDS 序列全长（从起始密码子 ATG 到终止密码子 TAG） 为 2718bp。与许多 R 基因一样，该基因编码的产物是 NBS-LRR 结 构的抗病蛋白（GenBank登录号为 AAX31149.1），其蛋白质序列为 905aa。根据 SMART 数据库软件扫描该蛋白的 domains、repeats、 motifs，找到一个从 4-18 位点的 low compositional complexity： IAVLLVLKKIAIALA 及一个位于 118-147 的 coiled coil region （LVSLDEIASEIKKIKQELKQLSESRDRWTK）；此外还预测到了 37 个其余结构（如 UME_PTB、SynN、IRO、RING、NADHG_4Fe-4、TOP1Ac、LRR_BAC、IFabd、SCAN、LytTR、 LRR_CC、LRR_TYP 及 LRR_SD22 等），但是其显著性未达到极 显著的阈值。Sanger 的分析则找到 3 个 Pfam-A matchs，其中显著 的一个是 NB-ARC 结构：envelope 范围是 183-470；比对结果的范 围则是 185-467；HMM 范围为3-282；另有两个非显著的 4 个 copy 的 LRR 结构。
病菌特点
• 该病菌属黄单胞杆菌属细菌,生长最适温28-30°C。 低于16°C基本不发病。细条病的发生初侵染源 主要有稻种、稻草和自生稻带菌,但也不排除野生 稻、李氏禾的交叉传染。
• 病原菌主要从伤口侵入,菌脓可借风、雨、露等传 播后进行再侵染。高温高湿等有利于病害发生。 台风暴雨造成伤口,病害容易流行。偏施氮肥,灌水 过深加重发病。
双右边界双元载体pMNDRBBin6结构图及可能产生的3种T DNA类型 (3)农杆菌菌株为LBA4404; (4)大肠杆菌菌株为DHSa ;
1.2双右边界双元载体的构建
1.感受态细胞的制备和转化 2. 双右边界双元载体构建
（1）目的基因和载体的酶切连接 • 将携带Rxol基因的载体pCAMBIA1305-1用限制性内切酶 Sac I (AGTVACT), NgoMN (GV CCGGC)进行消化，同时 ，用限制性内切酶Xma I ( C V CCGGG)和Hpa I ( GTT V AAC )消化载体pMNDRBBin6。将酶切后得到的目的基 因片断和双元载体用T4噬菌体连接酶连接，连接产物转化 至大肠杆菌。
1
M
2
3
4
------1.45kb
1:阳性对照pCAMBIA1305-1-itcol; M: 1 kb DNAlandderMarker; 2:阴性对 照pMNDRBBin6质粒;3:阳性克隆PCR扩增;4:阳性克隆的质粒PCR扩 增;M: 1 kb DNA ladder marker.
(2)对整合了Rxol基因的pMNDRBBin6载体使用Hpa I和Xma I进行双酶切，应得到大小为 20.875kb的片段。该阳性克隆的质粒经酶切后产生1条带约 为20kb(图2.5 )，与目的基因片段和pMNDRBBin6载体的长 度之和相等记为pMNDRBBin6-Rxol a 1 M