BCA蛋白浓度测定-酶标仪法
BCA蛋白浓度测定-酶标仪法
BCA 法测定蛋白浓度-酶标仪一、药品1.BCA 蛋白浓度测定试剂盒（ P0012， 500 次酶标仪，碧云天），含以下成分：a)BCA 试剂 A （P0012-1， 100ml ，碧云天），室温保存b)BCA 试剂 B （ P0012-2， 3ml ，碧云天），室温保存c)蛋白标准（ 5mg/ml BSA ）（ P0012-3， 1ml ，碧云天）， -20 度保存二、仪器和试剂1.酶标仪（测定波长为 540-595nm之间， 562nm最佳），水浴锅2.96孔单条可拆酶标板（平底）3.15 ml 离心管 1个（准备 BCA 工作液用）4. 1.5 ml 离心管 1个（准备蛋白标准品工作液用）5.单道移液器和枪头， 8道移液器（排枪）和枪头6.PBS三、操作步骤1.水浴锅调至 37℃。
2.蛋白标准品工作液（ 1 mg/ml ）的配制：将蛋白标准品（5mg/ml ）从 -20℃冰箱中取出，完全溶解并混匀。
取60μl 蛋白标准品（ 5mg/ml ），加入 240μl PBS，即稀释 5倍，即配成蛋白标准品工作液（ 1 mg/ml ）。
3.计算 BCA 工作液总量 = 0.2 ml（×样本数 +8）×2×1.1（标准品和样本均需测复孔）。
BCA工作量按 50体积的 BCA 试剂 A 加上 1体积的 BCA 试剂 B配制（即50:1），需充分混匀。
BCA工作液室温 24小时内稳定。
样本数 (n)1~56~78~1011~1213~1415~1617~1920~2122~2324~26A （ ml）6789101112131415B（ ml）0.120.140.160.180.20.220.240.260.280.3总量 (ml) 6.127.148.169.1810.211.2212.2413.2614.2815.34.按下表配制 8 个蛋白标准液（ S0~S7），充分摇匀。
BCA法测蛋白浓度(课件)
实验过程中应记录每个样品和标准品的吸光度值，并按照标准曲线计算对应的 蛋白质浓度。同时，还应记录实验过程中的空白吸光度值，以校正误差。
数据分析
将实验数据整理成表格，并计算每个样品的蛋白质浓度。根据需要，可以对数 据进行进一步的分析，如求平均值、标准差等。
实验结果的可重复性评估
重复性评估
为了评估实验结果的可重复性，可以对同一蛋白质样品进行多次测量，并计算结 果的变异系数（CV）。CV值越小，说明实验结果的重复性越好。
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蛋白质定量分析
蛋白质定量分析是生物学和医学研究中常用的技术手段，通过测定特定组织或细胞中蛋白质的含量， 可以了解生物体的生理状态和疾病发生机制。
BCA法测蛋白浓度可以用于蛋白质定量分析，通过测定蛋白质样品中蛋白质量浓度，结合生物学和医 学研究的需求，可以定量分析不同组织或细胞中蛋白质的含量，为相关研究提供重要的实验数据。
BCA法测蛋白浓度可以用于蛋白质表达分析，通过测定细 胞或组织中蛋白质的浓度，可以评估蛋白质的表达水平， 进一步分析其在生物学和医学研究中的应用价值。
蛋白质纯度检测
蛋白质纯度检测是评估蛋白质样品质量的重要步骤，通过检测蛋白质样品中杂质 的含量，可以评估蛋白质的纯度。
BCA法测蛋白浓度可以用于蛋白质纯度检测，通过测定蛋白质样品中蛋白质量浓 度，结合电泳、质谱等技术手段，可以评估蛋白质的纯度，为后续的生物学和医 学研究提供高质量的蛋白质样品。
将反应孔放入恒温孵育箱中，在设定 的温度下孵育一段时间，使蛋白质与 BCA试剂充分反应。
将反应孔密封，并轻轻振荡以确保样 品与试剂充分混合。
孵育完成后，将反应孔洗涤干净，去 除未结合的BCA试剂。
检测和计算
BCA蛋白浓度测定
BCA蛋⽩浓度测定化学名称：2,2-联喹啉-4,4-⼆甲酸⼆钠CAS号：979-88-4分⼦式：C20H10N2Na2O4 ·xH2O分⼦量：388.28化学性质：淡黄⾊粉末、有吸湿性，溶解于⽔或者⼄醇。
质量标准外观Appearance淡黄⾊粉末红外光谱鉴别Infrared spectrometry<符合纯度Purity≥98.0% (HPLC)⽔分Moistrue≤4%铁Iron(Fe)<5PPM重⾦属Heavy Metals<5PPM灼烧残渣Residue On Ignition≤0.1%⽔溶性试验Solubility500mg/ml⽔摩尔吸收系数Molar Absorptivity3.74*104（氧化产物）应⽤范围该复合物在562 nm处有最⼤吸光值，并与蛋⽩浓度成正⽐。
以BSA为标准品求得标准曲线，进⽽计算未知蛋⽩样品的浓度，故BCA常⽤于蛋⽩定量检测，是蛋⽩定量试剂的重要原料。
应⽤BCA法是近来⼴为应⽤的蛋⽩定量⽅法。
其原理与Lowery法蛋⽩定量相似，即在碱性环境下蛋⽩质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。
BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝⾊复合物，在562 nM处有⾼的光吸收值并与蛋⽩质浓度成正⽐，据此可测定蛋⽩质浓度。
与Lowery 法相⽐，BCA蛋⽩测定⽅法灵敏度⾼，操作简单，试剂及其形成的颜⾊复合物稳定性俱佳，并且受⼲扰物质影响⼩。
与Bradford法相⽐，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。
器材1. 7220型分光光度计2. ⽐⾊杯3. 恒温⽔浴箱4. 中试管7⽀5. 枪式移液管试剂1. 试剂A：1%BCA⼆钠盐2%⽆⽔碳酸钠0.16%酒⽯酸钠0.4%氢氧化钠0.95%碳酸氢钠混合调PH值⾄11.25。
2. 试剂B：4%硫酸铜。
3. CA⼯作液：试剂A100ml+试剂B2ml混合。
4. 蛋⽩质标准液：⽤结晶⽜⾎清⽩蛋⽩根据其纯度⽤⽣理盐⽔配制成1~5mg/ml的蛋⽩质标准液。
BCA蛋白浓度测定-酶标仪法
BCA法测定蛋白浓度-酶标仪一、药品1.BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0012，500次酶标仪，碧云天），含以下成分：a)BCA试剂A（P0012-1，100ml，碧云天），室温保存b)BCA试剂B（P0012-2，3ml，碧云天），室温保存c)蛋白标准（5mg/ml BSA）（P0012-3，1ml，碧云天），-20度保存二、仪器和试剂1.酶标仪（测定波长为540-595nm之间，562nm最佳），水浴锅2.96孔单条可拆酶标板（平底）3.15 ml 离心管1个（准备BCA工作液用）4. 1.5 ml 离心管1个（准备蛋白标准品工作液用）5.单道移液器和枪头，8道移液器（排枪）和枪头6.PBS三、操作步骤1.水浴锅调至37℃。
2.蛋白标准品工作液（1 mg/ml）的配制：将蛋白标准品（5mg/ml）从-20℃冰箱中取出，完全溶解并混匀。
取60μl 蛋白标准品（5mg/ml），加入240μl PBS，即稀释5倍，即配成蛋白标准品工作液（1 mg/ml）。
3.计算BCA工作液总量= 0.2 ml×（样本数+8）×2×1.1（标准品和样本均需测复孔）。
BCA工作量按50体积的BCA试剂A加上1体积的BCA试剂B配制（即50:1），需充分混匀。
BCA 工作液室温24小时内稳定。
4.按下表配制8个蛋白标准液（S0~S7），充分摇匀。
5.将96孔酶标板的A1孔放在左上角，按下表加入蛋白样本和标准品。
（1）先在第3~4条酶标板的蛋白样本孔（N 1~N8）中加入待测蛋白样本各2μl，再用排枪在蛋白样本孔中追加PBS液各18μl，使总量达到20μl。
（此时蛋白样本的稀释比为10，适用于预计蛋白浓度为2~8mg/ml时。
如预计蛋白浓度太高或太低，可适当调整稀释比例）（2）再在第1~2条酶标板的蛋白标准品孔（S0~S7）中加入上面配制的8个蛋白标准液各20μl。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A S0 S0 N1 N1B S1 S1 N2 N2C S2 S2 N3 N3D S3 S3 N4 N4E S4 S4 N5 N5F S5 S5 N6 N6G S6 S6 N7 N7H S7 S7 N8 N86.用排枪在各孔中加入200μl BCA工作液，轻轻摇匀，37℃放置30分钟或室温放置2小时。
bca法测蛋白浓度标准曲线
bca法测蛋白浓度标准曲线
bca法测蛋白浓度原理：在碱性环境中，蛋白质与cu2+络合并将cu2+还原成
cu1+(biuretreaction)。
bca与cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，可测定蛋白质浓度。
因为蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。
有关bca法测蛋白浓度的相关操作：1、按试剂盒说明书配置bca工作液。
2、完全溶解蛋白质标准品，加到96孔板的蛋白标准品孔中，按照说明书要求对标品进行梯度释，加入bca工作液，用酶标仪测定其吸光度。
3、以样品浓度为x轴，吸光度为y轴，绘制标准曲线。
4、待测样品中加入bca工作液，测定吸光度，带入标准曲线中，计算样品浓度。
除了bca法测蛋白浓度外，还有其他方法可以测试蛋白浓度。
1、考马斯亮蓝法(bradford)法原理：考马斯亮蓝g-(coomassiebrilliantblueg-)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
在游离状态下呈红色，最大光吸收在nm。
当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
2、斐林—酚试剂(lowry)法：斐林(folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物。
第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关，在nm波长下有最大光吸收。
蛋白浓度测定
蛋白浓度测定BCA法测定样品蛋白的浓度1、原理：在碱性环境下，蛋白质分子中的肽链结构能与Cu2+ 络合，将Cu2+还原成Cu+。
BCA 试剂可敏感特异地与Cu+结合，形成稳定的有颜色复合物。
在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白浓度呈正比。
通过制备经过梯度稀释的、浓度抑制的一组蛋白质标准品，然后将其与未知浓度的待测蛋白质仪器检测，根据绘制出的标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。
2、准备：96孔板、枪（枪头）、酶标仪（提前开启）、Pierce的BCA蛋白定量分析试剂盒、PBS、蛋白标准品（-20℃分装保存）、PBS缓冲液、待测蛋白样品。
注意：蛋白标准品有两种：一种是BCA试剂盒原装蛋白标准品（2mg/ml），另一种是10mg/ml蛋白标准品，需要稀释到2mg/ml。
3、操作步骤：①准备1ml RIPA裂解液：加100µl phosstop、10µl cocktail和10µl PMSF到880µl 1X RIPA buffer中，混匀后置于4℃中备用。
（若蛋白提取完后直接进行蛋白定量，则可直接用剩余的裂解液。
）②准备BSA标准品：Pierce BSA原浓度为2 mg/ml，取5个200µl EP管按下表配好标准品。
设置好每孔所加样品后（如下表）：③涡旋混匀标准品，每个加10ul （横排并列第二个做复孔）。
④涡旋混匀待测蛋白，每个加1ul （横排并列第二个做复孔）。
⑤加140ul水到标准品孔，149ul水到待测样品孔。
⑥根据数量（标品5*2个+待测样品n*2个），按A:B=50:1配制BCA工作液，每孔100ul。
（若需5ml，则5ml A液+ 100ul B液）⑦用保鲜膜覆盖孔板后，再盖上孔板盖子，置于60℃孵育20min，在酶标仪540-570 nm (562 nm) 处读值。
4、注意事项：①在加标准蛋白或样品蛋白时，应用相应量程的枪头对溶液进行充分的混匀，以降低因溶液浓度不均对实验造成的影响。
BCA法测蛋白
【实验器材与试剂】
1．器材: 盒；待测样品。
【操作步骤】 1.配制BCA工作液: 根据标准品和样品 数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试 剂（50:1）配制适量BCA工作液，充分 混匀。 2. 稀释标准品：用PBS10倍稀释蛋白标 准品BSA,使其终浓度为0.5mg/ml。
实 验 步 骤
孔号 试剂（μ L） 标准蛋白溶液 （0.5mg/ml） PBS 缓冲液 待测样品 BCA 工作液 蛋白质含量（μ g）
空白孔 — 20 — 200
1 2 18 — 200 0.05
2 4 16 — 200 0.1
3 8 12 — 200 0.2
4 16 4 — 200 0.4
5 20 — — 200 0.5
实 验 步 测定孔 骤
— 20-？ ？ 200
实 验 步 骤
3. 将上述反应板混匀， 37℃温育30min ， 562nm波长比色测定吸光度值。 4.以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵标 绘制标准曲线。 5.根据标本吸光度值，由标准曲线可得出标 本蛋白浓度。
【注意事项】： 1.标本的充分混匀。 2.要得到更为精确的蛋白浓度结果，每 个蛋白样品均需做复孔, 每次均应做标 准曲线 。 3.使用水浴箱温育时，应注意防止因水 份蒸发影响检测结果。
BCA法测定蛋白浓度
【原理】：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为 Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物， 测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲 线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
【主要特点】 1. 不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。 2. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马 氏亮蓝。 3. 快速：45分钟内完成测定。 4. 准确灵敏, 线性范围广。 5. 经济实用：在微孔板中进行测定，可大大节 约样品和试剂用量。
BCA方法测定骨骼肌蛋白质浓度
BCA方法测定骨骼肌蛋白质浓度一、原理BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。
在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
二、操作1. 配Working reagent工作液:设需测样品为N个，则总共需要Working Reagent的ul数＝（9+N）×2×200ul ；（双管做）2. 将试剂A和试剂B按照50:1的比例配成Working Reagent；3. 采用ELISA酶标比色板4. 9个标准品不同浓度溶液配制如表1蛋白浓度分别为0μg/ml，25μg/ml，125μg/ml，250μg/ml，500μg/ml，750 μg/ml，1000 μg/ml，1500 μg/ml，2000 μg/ml。
采用0.5试管表1 BCA蛋白标准品浓度配置表PBS（ul）BCA标准品（ul）终浓度（ug/ml）A 0 60 2000B 25 75 1500C 65 65 1000D 35 35（B）750E 65 65（C）500F 65 65（E）250G 65 65（F）125H 80 20（G）25I（空白）60 0 096孔酶标板5．I-A各加10ul不同浓度BCA标准品溶液；6. 测定样品，各加8ul PBS和2ul蛋白样品（相当于提取的样品稀释5倍）；7．2-8排各加200ul工作液；8．封口胶盖好酶标板，9. 37度孵育30分钟；10．酶标板冷却至室温；11. 酶标仪（BIO-RAD 680）570nm波长，读取每孔OD；12．由自带分析软件绘制标准曲线和浓度分析；13 蛋白样品终浓度（ug/ul）=待测样品浓度（ug/ml）×稀释的倍数5÷1000酶标仪使用1.开机计算机密码：1234 酶标仪密码：000002.参数设置微板模板设置---模板编号：zhangliu 模板名称：2011-03-13（日期）定义微孔：空白---标准---样品保存3.检测方法（1）终点法---找模板编号zhangliu---建微板---选测定项目（看波长是否合适）---- 读取---原始测定结果（导出WORD保存）---吸光度值（即减去空白的OD，导出WORD保存）（2）浓度分析---维护标准品---输入标准品浓度---线性曲线---拟合---关页面（3）计算浓度---浓度报告---保存数据。
BCA蛋白浓度测定(整理版)
BCA蛋白浓度测定Pierce? BCA Protein Assay Kit(试剂盒室温保存)1. 准备BSA标准品按Table 1配制一系列的蛋白标准品.原液(stock):取出一个ample(内含2mg/mL的白蛋白标准品 (此量足够3个replication)2.准备BCA工作液(Working Reagent,WR)(1)用公式计算总工作液量(标准品数+待测样品数)*(复制数)*(每个工作液的量)=总的需要的工作液的量例子:3个待测样品,每个样品2个复制所需的工作液量(9个标准品+3个待测样品)*(2个复制数)*(2ml)=48ml工作液Note:试管法:每个试管需2ml工作液微孔板:每个孔需200ul工作液(例子中需共4.8ml)(2)BCA试剂A:B=50:1配制适量BCA工作液，充分混匀。
对于上面的例子,试管法需要50ml BCA A液+1ml BCA B液,微孔板法需5ml A液和1mlB液.B液加到A液中时,迅速浑浊,但是通过混匀立即变成清澈绿色的工作液.工作液在密闭室温下可以保存数天.3.微孔板步骤(样品与工作液比例=1:8)(1).标准液和样品各25ul加入微孔板中Note:若样品有限,可各加10ul(样品与工作液比例=1:20)(2).每孔加200ul的工作液并且充分震荡30s。
(3).在37度孵育样品30min，或室温2h。
(4).冷却至室温。
(5).在酶标仪中测量562nm时的吸光值(6).绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。
Note:540-590nm的波长均可Figure 1: Typical color response curves for BSA and BGG using the Standard Test Tube Protocol (37°C/30-minute incubation).仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途。
For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur für den persönlichen für Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l 'étude et la recherche uniquement à des fins personnelles; pas à des fins commerciales.толькодля людей, которые используются для обучения, исследований и не должны использоваться в коммерческих целях.以下无正文。
酶标仪测蛋白实验报告
一、实验目的1. 掌握酶标仪的使用方法。
2. 学习蛋白质定量分析的基本原理和操作步骤。
3. 通过BCA法测定蛋白质浓度，并验证实验结果的准确性。
二、实验原理蛋白质是生物体内重要的生物大分子，其含量的测定对于生物科学研究和生物技术产业具有重要意义。
酶标仪是一种用于检测生物分子浓度的仪器，基于酶催化反应产生的颜色变化来定量分析目标分子。
本实验采用BCA法（比色法）测定蛋白质浓度，其原理是蛋白质与铜离子在碱性条件下发生络合反应，生成紫蓝色复合物，该复合物在特定波长下具有特征性吸收峰，其吸光度与蛋白质浓度成正比。
三、实验材料与仪器1. 实验材料- 蛋白质标准品（如牛血清白蛋白）- 待测蛋白质样品- BCA工作液- 96孔微孔板- 试剂：硫酸铜、硫酸钠、氢氧化钠等2. 实验仪器- 酶标仪- 电子天平- 移液器- 移液枪- 恒温水浴锅四、实验步骤1. 标准曲线制作1.1. 按照试剂盒说明书配置BCA工作液。
1.2. 将蛋白质标准品用去离子水稀释成不同浓度梯度（如0、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL）。
1.3. 将稀释后的标准品分别加入96孔微孔板中，每孔加入100 μL。
1.4. 向每孔中加入100 μL BCA工作液，混匀。
1.5. 将微孔板放入酶标仪，在562 nm波长下测定吸光度值。
1.6. 以蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定2.1. 将待测蛋白质样品用去离子水稀释成适当浓度。
2.2. 将稀释后的样品分别加入96孔微孔板中，每孔加入100 μL。
2.3. 向每孔中加入100 μL BCA工作液，混匀。
2.4. 将微孔板放入酶标仪，在562 nm波长下测定吸光度值。
3. 结果分析3.1. 根据样品的吸光度值，在标准曲线上查找对应的蛋白质浓度。
3.2. 计算样品的蛋白质含量。
五、实验结果与分析本实验通过BCA法成功测定了蛋白质样品的浓度，结果如下：- 标准曲线的相关系数R²为0.996，说明标准曲线具有良好的线性关系。
BCA法检测蛋白浓度
BCA法检测蛋白浓度1、目的：测定收集液中蛋白浓度2、方法：在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。
BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。
3、设备：⑴光密度测定仪（比色计或酶标仪、微板比色仪），工作波长562nm 或在520-600nm之间。
⑵1000uL、200uL、20uL、2uL移液枪各一把和枪头若干⑶EP管架一个4、组成与储存：(1)A液BCA Reagent 100 ml，4ºC保存；(2) B液Cu2＋ Reagent 2.5 ml，4ºC保存；(3) BSA standard 5mg/ml 1ml，-20ºC冻存。
1年内有效5、实验步骤5.1标准曲线的绘制标准蛋白的稀释：稀释10倍（10uL）即：10uL的标准蛋白+90uL的生理盐水1 2 3 4 5 6 7 8 Ｐｒ０１２４８１２１６２０ＮａＣｌ２０１９１８１６１２８４０单位：uL5.2配制BCA工作液A液：B液=50:15.3关于UC细胞收集液的稀释原液×2030KD除杂透过液×43KD 超滤浓缩液×45.4上样取稀释后的待测液20uL+BCA工作液200uL于96孔板内置于37摄氏度烘箱30min后待测。
5.5检测详见仪器操作规程6、注意事项6.1蛋白质与WR工作溶液反应形成的颜色复合物，在37ºC、30min 或25ºC室温反应过夜时稳定性佳。
在37ºC30min或25ºC室温反应12小时，严格来讲形成的颜色复合物尚未达到终点，通常每10min OD562值升高约2.3%。
然而，在这一时间内通常可以测定约30管，测定精度不受明显影响。
6.2 BCA法在样品含有脂类物质时将明显提高光吸收值。
蛋白样品中EDTA或葡萄糖浓度大于10mM不能使用BCA方法。
BCA法测提取蛋白的浓度
BCA法测提取蛋白的浓度
许可2014-3-8 整个操作流程都是在309做，BCA自己配，BSA是试剂盒里的
1.找到测蛋白浓度的试剂盒，在314（自己联系师姐）
2.使用时将solutionA摇晃均匀，根据样品数量，按50体积solutionA加1体积solutionB(50:1)
配置适量BCA工作液（量的多少请见第6步），充分混匀。
BCA工作液室温24h内是稳定的。
3.完全溶解蛋白标准品(即5mg/ml BSA)，取10ul用pbs稀释至100ul,使终浓度为0.5mg/ml。
4.将稀释后的蛋白标准品（0.5mg/ml）按0,1,2,4,8,12,16,20ul分别加到96孔板中，记号顺
序，再加pbs将各孔补至20ul
5.在96孔板上另取一排，从-80℃取出准备好的各蛋白（小mini管装的），取你要检测的
各蛋白4ul，加到样品孔中，再加pbs补至20ul.
6.上述各孔再加入200ul你配好的BCA工作液，轻轻十字摇晃，千万注意不要弄出气泡，
若有气泡可用注射器针头刺破。
再在37℃（或高点的温度）中放置40-60min，时间最好能长点。
7.冷却至室温后，用酶标仪测定A256(在323室，需提前和师姐说)
8.得到各自你要检测的样品蛋白浓度
9.在实验记录本上记录下电脑上显示的各样品蛋白浓度的多少。
BCA蛋白浓度测定说明书
BCA蛋⽩浓度测定说明书BCA法蛋⽩质浓度测定试剂盒BCA Protein Assay Kit产品编号：SK3021包装规格：500 Assays产品简介BCA法是理想的蛋⽩质定量⽅法，在碱性环境下蛋⽩质分⼦中肽键结构与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。
BCA特异地与Cu1+结合形成稳定的紫蓝⾊复合物，在562 nM处有最⼤的光吸收值并与蛋⽩质浓度成正⽐，颜⾊的深浅与蛋⽩质的含量成正⽐，可以根据吸收值测定蛋⽩质浓度。
该测定⽅法灵敏度⾼，操作简单，试剂及其形成的颜⾊复合物稳定性俱佳，并且受⼲扰物质去垢剂等影响⼩。
产品特点1. 准确灵敏，线性范围⼴，BCA试剂的蛋⽩质测定范围是25－500 µg/ml。
2. 快速：45分钟内完成测定，⽐经典的Lowry法快4倍⽽且更加⽅便。
3. 不受样品中离⼦型和⾮离⼦型去污剂影响。
4. 检测不同蛋⽩质分⼦的变异系数远⼩于考马⽒亮蓝。
5. 可以酶标板法或分光光度计法。
运输和保存条件在常温下运输，收到后，将试剂A、试剂B 4℃保存，BSA蛋⽩标准液-20℃，保质期⼀年。
产品组成本试剂盒由溶液A、溶液B和BSA标准蛋⽩构成，酶标板法可以使⽤500次，分光光度计法100次。
SK3021-1 溶液A 100 mlSK3021-2 溶液B 2 mlBSA标准蛋⽩(5mg/ml) 1 ml使⽤⽅法A. 试剂准备1. 按照以下公式计算所需的BCA⼯作液总体积。
BCA⼯作液总体积=（标准曲线测定点数+样品数）×重复次数×每个样品所需的BCA⼯作液体积2. 根据所需的BCA⼯作液总体积，取50份溶液A和1份溶液B，混匀，制成BCA⼯作液。
3. 取⼀定量的BSA标准溶液，⽤1XPBS溶液稀释为500 µg/ml。
4. 取8⽀1.5 ml离⼼管，按照下表平⾏操作。
B. 分光光度法1. 制作标准曲线（离⼼管法的蛋⽩定量线性范围：25-500µg/ml）1）取8⽀1.5ml离⼼管，各管分别加⼊100µl相应浓度的标准蛋⽩质溶液。
bca法测蛋白浓度实验报告
bca法测蛋白浓度实验报告BCA法测蛋白浓度实验报告一、引言蛋白质是生物体内重要的组成部分，其浓度的准确测定对于生物学研究和生物工程应用具有重要意义。
BCA法（Bicinchoninic Acid Assay）是一种常用的测定蛋白质浓度的方法，其原理是利用蛋白质与铜离子在碱性条件下形成蛋白质-铜络合物，进而与BCA试剂中的双香酮反应产生紫色产物，通过比色测定紫色产物的吸光度来确定蛋白质浓度。
二、实验目的本实验旨在通过BCA法测定给定蛋白溶液的浓度，掌握BCA法的基本原理和操作方法，并评估该方法的准确性和可靠性。
三、实验材料和方法1. 实验材料- BCA试剂盒- 待测蛋白溶液- BSA标准溶液- NaCl溶液- NaOH溶液- 96孔酶标板- 酶标仪2. 实验方法（1）制备标准曲线a. 准备一系列浓度递增的BSA标准溶液，如0 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL和10 μg/mL。
b. 取相应浓度的BSA标准溶液，加入BCA试剂，混匀后孵育30分钟。
c. 使用酶标仪测定各标准溶液的吸光度，记录吸光度值。
（2）测定待测蛋白溶液浓度a. 取待测蛋白溶液，加入BCA试剂，混匀后孵育30分钟。
b. 使用酶标仪测定待测蛋白溶液的吸光度，记录吸光度值。
（3）计算蛋白质浓度根据标准曲线的吸光度值和相应浓度的BSA标准溶液浓度，利用线性回归分析计算待测蛋白溶液的浓度。
四、实验结果与分析根据实验数据，我们绘制了标准曲线，并利用该曲线计算了待测蛋白溶液的浓度。
实验结果表明，待测蛋白溶液的浓度为X μg/mL。
BCA法作为一种常用的测定蛋白质浓度的方法，具有许多优点。
首先，BCA法使用的试剂易于制备和保存，操作简便。
其次，BCA法对于大多数常见蛋白质具有较好的线性响应，测定范围广。
此外，BCA法的结果稳定可靠，对于样品中存在的干扰物质具有较好的抗干扰能力。
然而，BCA法也存在一些局限性。
蛋白质定量：(BCA法)
实验原理BCA(bicinchoninic acid)是一种稳定的水溶性复合物，在碱性条件下，二价铜离子可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子可以和BCA相互作用，两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的络合物，该复合物为水溶性，在562nm 处显示强吸光性，在一定浓度范围内，吸光度与蛋白质含量呈良好的线性关系，制作标准曲线，因此可以根据待测蛋白在562nm处的吸光度计算待测蛋白浓度。
实验准备1. BCA定量试剂盒：含A液和B液A液：BCA碱性溶液（配方：1%BCA二钠盐，0.4%氢氧化钠，0.16%酒石酸钠，2%无水碳酸钠，0.95%碳酸氢钠，这些液体混合后再调PH至11.25）B 液：4%硫酸铜2.牛蛋白血清（BSA）3.待测的蛋白样品实验步骤1.配置BCA工作液：将A液和B液摇晃混匀，按照A:B=50:1的比例配置BCA 工作液，充分混匀。
（BCA工作液室温下24h内稳定，故现用现配）2.配置不同浓度的标准蛋白液（BSA），1ug/ul，2.5 ug/ul，5 ug/ul，7.5 ug/ul，10 ug/ul，待测蛋白样品在什么溶液中，就用该溶液来稀释标准蛋白液（如待测样品溶于强RIPA裂解液，则用强RIPA裂解液来稀释标准蛋白液）。
3.取空白组（0ug/ul BSA）各浓度的标准蛋白液5ul加入96孔板中，另取待测的蛋白样品5ul，加入96孔板。
PS：上图加样的量仅作为参考，蛋白液和BCA工作液的比例符合即可。
4.向各孔的蛋白液中加入300ul的BCA工作液，混匀，37度放置30分钟，（加样时应当动作轻柔，防止产生气泡影响读数）。
PS：温度和放置时间可以调整，可在60度放置30分钟or室温放置2小时。
5.静置结束后，冷却至室温，用酶标仪测定562nm出的吸光度，并制作标准曲线。
6.根据待测样品的吸光度，比对标准曲线，计算蛋白的浓度。
注意事项BCA法测定蛋白浓度时，吸光度可随时间的延长不断加深，且显色反应会随温度升高而加快，故如果浓度较低，适合较高温度孵育or延长孵育时间。
BCA试剂盒测蛋白浓度
BCA蛋白浓度测定试剂盒货号：PC0020组成包装（500微孔) 保存BCA试剂100ml 2-8℃Cu试剂3ml 2-8℃PBS稀释液30ml 2-8℃BSA蛋白标准(5mg/ml BSA) 1ml -20℃本试剂盒自订购之日起一年内有效。
产品简介：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
常用浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。
实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。
操作说明：一. 微孔酶标仪法1. 配制工作液: 根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失)。
BCA工作液室温24小时内稳定。
2. 稀释标准品：取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微升（样品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。
将标准品按0, 2, 4，6，8, 12, 16, 20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20微升。
3. 将样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释），加20微升到96孔板的样品孔中。
由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。
4. 各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置15-30分钟。
用酶标仪测定A562nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。
二. 分光光度计法如没有酶标仪，可用分光光度计在离心管中混匀后加入比色皿中比色。
步骤如下：1.配制工作液: 根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失)。
BCA蛋白浓度测定
0.593667
0.3
16
0.736
0.738
0.732
0.735333
0.4
20
0.957
0.966
0.952
0.958333
0.5
用 Excel 或 orgin 作出吸光度对 BSA 浓度的关系曲线。
六、实验结果分析 得到的吸光度对 BSA 浓度的关系曲线 R2 值大于 0.99 的时数据较好。如果
BCA 蛋白浓度测定
一、实验原理：
BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混
合一起即成为苹果绿，即 BCA 工作试剂。在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，
蛋白质将 Cu2+还原为 Cu+，一个 Cu+螯合二个 BCA 分子，工作试剂由原来的苹
果绿形成紫色复合物，该水溶性的复合物在 562nm 处显示最大吸光性，吸光度
孔中，加标准品稀释液补足到20μL。 6. 加适量体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释补充到20μL。
注：测量浓度请需要对样品进行稀释，使其的浓度范围在0.5-5 mg/mL 之间，保证样品浓度在线性范围内，一般样品需要稀释5-10倍即可，根据 实际蛋白浓度适当调整。
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酶标仪BCA法测定蛋白浓度-一、药品500次酶标仪，碧云天），含以下成分：BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0012，1. 100ml，碧云天），室温保存试剂A（P0012-1，a)BCA ，碧云天），室温保存P0012-2试剂B（，3mlb)BCA 度保存P0012-3，1ml，碧云天），-20c)蛋白标准（5mg/ml BSA）（二、仪器和试剂最佳），水浴锅酶标仪（测定波长为540-595nm之间，562nm1. 孔单条可拆酶标板（平底）2.96 1个（准备BCA工作液用）3.15 ml 离心管个（准备蛋白标准品工作液用） 1.5 ml 离心管14. 道移液器（排枪）和枪头5.单道移液器和枪头，8PBS 6. 三、操作步骤℃。
1.水浴锅调至37℃冰箱中取出，）的配制：将蛋白标准品（5mg/ml）从-202.蛋白标准品工作液（1 mg/ml倍，即配μl PBS，即稀释5完全溶解并混匀。
取60μl 蛋白标准品（5mg/ml），加入240 成蛋白标准品工作液（1 mg/ml）。
BCA。
2×1.1（标准品和样本均需测复孔）BCA计算工作液总量= 0.2 ml×（样本数+8）×3.
BCA需充分混匀。
50:1），体积的BCA试剂B配制（即试剂工作量按50体积的BCAA加上1 24工作液室温小时内稳定。
S0~S7），充分摇匀。
4.按下表配制8个蛋白标准液（
0.2 20 D 80S3
0.3 S4 7030E
0.4 S5 F 40 600.5 G 50 50S6
1.0
0S7
100H
5.将96孔酶标板的A1孔放在左上角，按下表加入蛋白样本和标准品。
（1）先在第3~4条酶标板的蛋白样本孔（N 1~N8）中加入待测蛋白样本各2μl，再用排枪在蛋白样本孔中追加PBS液各18μl，使总量达到20μl。
（此时蛋白样本的稀释比1 / 2
.
时。
如预计蛋白浓度太高或太低，可适当10，适用于预计蛋白浓度为2~8mg/ml为调整稀释比例）个蛋白标准液S0~S7）中加入上面配制的8）（2再在第1~2条酶标板的蛋白标准品孔（。
A B C D E F G
H
6.（注意：①每次测定时必须都做标准曲线。
因为BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则每次都做标准曲线。
②如果浓度较低，可适当地延长孵育时间或在较高温度孵育。
）
7.用酶标仪测定562nm下标准品和样本的吸光度。
8.用标准蛋白质量为横座标，用吸光度值A562为纵座标，做标准曲线，用线形回归计算公式Y=A X + B。
根据样本的吸光度，计算待测样本的蛋白浓度（注意待测样本的稀释倍数）。
9.按WB实验的要求，稀释为2.5mg/ml，分装为每支100μl。
2 / 2。