白腐真菌处理染料孔雀石绿的研究
白腐菌对染料脱色和降解作用的研究进展
统 。 。
２２ 白腐 菌对污染 物 的降解 机理 ．
１８ 年 美 国两 个 科 研 小组 发 现 黄 孢 原 毛 平 革 ９３ 菌 （ ｈ ｎｒ ｈ ｅ ｈ ｓ ｏｒ ｍ） 向胞 外 分泌 术质 素 Ｐ ａｅｏ ａｔ ｃｒ ｏ ｐｉ 能 ｃ ｅ ｙｓ ｕ 分 解酶 系 ， 为降 解术 质素研究 的重 大进 展 。 白腐葭 的降解 活动 只发生在 次级代 谢阶 段 。当 白腐菌 被引 入废水 中 后 ， 由于生 物具 有 的应 激性 将 对营养 限制 （ 一些 主要 营养物质如 氮 、 、 限制 ） 碳 硫 作 出应 答反应 ， 成 一 套酶 系 统 。首先 产 生 细胞 内的 形 葡 萄糖 氧化酶 和 细胞 外 的 乙二 醛氧 化 酶 ， 分子 氧 在 （ 界曝气 供 给） 外 参与 下 氧化相 应 底物 而形 成 ｏ ， 激活过 氧化 物酶 而启动醇 的催 化循 环。 由于 白腐 菌
１３ 生 物 处 理 法 ．
质 ． 人类健 康影响很 大 。 对
包 括投菌 法 、 物铁 法和生物 接触 氧化法 。 生 表 １ 化学处 理法 简介
活 性 磷 炭 吸附 法
活性 硅 薷 土 暖 跗法
其 它 敷驸 法
维普资讯
如前 所述 ， 理 有颜 色 的废水 可 以采用 一 些 物 处 理 化学 技术 ， 包括 ： 絮凝 、 积 、 收 、 氧 漂 白或 氯 沉 吸 臭 漂 白、 成吸 附树 脂 的离子 交换 、 渗透 等等 。不 幸 合 反
法就会 显现 出其极 大 的价 值 。投菌法是 针对 所要 去 除 的污染物 质 ， 利用 特 殊 培养 的优 势 菌种 对 该 污染 物进行 有 效 降 解 的 方 法 。投 菌 法 在 美 国 、 国 、 德 日
白腐真菌对活性艳红染料X-3B的脱色实验研究
传统上 ， 人们采用物理 、 化学或活性污泥方法 对染 料废 水进 行 脱 色 降解 处 理 。 由于染 料 分 子具
有 耐光 、 耐热 、 难物 理 化 学 处理 及 抵御 生 物 降解 等 特 点 ， 以处 理 效 果并 不 理 想［ 。近 年来 ， 所 １ ］ 一种 崭 新 的 白腐 真菌 生 物技 术 ， 异 军 突起 ， 正 日益 受 到人
ａ ｉ ｔ ｆｅ ｔａ ｃ ｌ ｌｒｌ ｕｄ ｓ ｏ ｄ ｈ ｔ ｔ ｅ ｃ ｒ ｙ ｔ ｍ ｆｄ ｃ ｌ ｕ ａ ｉ ｎ ｗａ ｕ ｓｄ ｈ ｅｌ． Ｔｈｅ ｒ ｓ ｌｓ ｗｏ ｌ ｆ ｂ ｌ ｙ ｏ ｘ ｒ ｅｌ ａ ｉ ｉ ｈ ｗｅ ｔ ａ ｈ ｏ ｅ ｓ ｓ ｅ ｏ ｅ ｏ ｏ ｒ ｔ ｓ ｏ ｔ ｉ ｅ ｔ ｅ ｃ ｌ ｉ ｕ ｑ ｏ ｓ ｅ ｕ ｔ ｕ ｄ ｂ ｏ ｅ ｓ ｍｅ ｖ ｌ ｅ ｉ ｈｅｄ ｒ ｔａ ｐ ｉ ｔ ｎ ｏ ｉ ｔｆ ｎ ｕ ｎ ｅ ｖ ｒ ｎ ｎ ａ ｎ ｉ ｅ ｒｎ ． ｏ ａｕ ｎ ｔ ｉｅ ｐ ｌ ａ ｉ ｆｗｈ ｔ ｒ ｕ ｃ ｃ ｏ ｅｏ ｇ ｓ ｉ ｎ ｉ ｍｅ ｔｌｅ ｇ ｎ ｅ ｉ ｏ ｇ Ｋ ｙ ｗｏ ｄ Ｗ ｈｔ ｏ ｕ ｇ ｓ Ｄ ｅ ｔ ｆＷ ａ ｔｗａｅ Ａｉ Ａ ｒ ｔ ｎ Ｃ ｌ ｒ Ｃａ ｂ ｎ Ｎｕｒ ｎ Ｅ ｔａ Ｃ ｌ ｌｒ ｑ ｉ Ｄｅ ｅ ｒｓ ｉ Ｒ ｔ ｎ ｕ ｙ ｓｕ ｓｅ ｔ ｒ ｅ Ｆ ｒ ｅ ａｉ ｕｔ ｅ ｏ ｕ ｒ ｏ ｔ ｅ ｔ ｘ ｒ ｅ ｌ ａ ｕｄ ｉ ｕ Ｌｉ －
Ｃｏ ｐ ｒｄ ｗｉ ｈ ｉ ｓａ ｉ ｃ ｌｕ ｅ ｈ ｉ ｅａ ｉｎｃ ｌｕ ｅｗａ ｒ ｕｔｂｅｆｒｔ ｅｗｈｔ ｏ ｕ ｇ ｓｔ ｅ ｏｏｉｅｔ ｅｄ ｅ ｍ ａ ｅ ｔ ｔｅａｒ ｔｔ ｕｔ ｒ －ｔ ｅａｒ ｒｔ ｕｔ ｒ ｓｍｏ ｅｓ ｉ ｌ ｏ ｉ ｒ ｔ ｎ ｕ ｏｄ ｅ ｌｒ ｈ ｙ — ｈ ｃ ａ ｏ ａ ｈ ｅ ｆ ｚ
【白腐菌】白腐真菌的分离及其降级集中染料特性的研究
８ ８
合物的效果， 分析研究白 腐真菌的降解机制， 腐真菌在我国 为白 环境污染治理中的应用提供
理论及技术支持。
二、 试验方法
（ 菌种 一）
实验用到Ｐ ｌ ． Ｃ和Ｆ 两株菌种。 ． Ｐ Ｃ是来自 国外的菌种， ｌ 行采集分离出的一株白 Ｆ 是自
腐真菌。
Ｆ ｌ采集及主要分离步骤如 卜 。从京郊区树林中采集有白腐真菌生长树枝，置 ３℃的 ０ 生化培养箱中保存。 保持一定的湿度， 待新的白 腐真菌生长出来后， 接种新生的自腐真菌到 马铃薯一琼脂固体培养基上，培养。反复转接即可得到纯种白腐真菌。 （ 培养基 二） 采用固体和液体两种培养基：
培养条件：固体培养基采用生化培养箱培养、液体培养基采用摇床培养。 （ 三）白 腐真菌降解特性研究 １ 降解 目标化合物为染料，包括刚果红、活性翠蓝 Ｋ － ， Ｎ Ｇ， ２ 试验步骤： ， （） １ 菌种的扩大培养：液体营养限制培养基 （ Ｌ Ｎ Ｍ）摇床培养自腐真菌 （．． Ｆ Ｐ 和 Ｉ Ｃ ）
五犬 。
测白 腐真菌培养基溶液的菌种湿重。摇匀溶液，取 １ｍ ， ０转／ ０ １ ４０ ０ 分钟条件 卜 离 心分离， 测得溶液中白 弃去上清液， 腐真菌的 湿重浓度。 （） 配制含有不同染料浓度的 ３ 液体营养限 制培养基， ５ｍ 三角瓶中装溶液 ｌ ｍ， 每２０ １ ０ ｌ ０ １１ ２ ℃下灭菌 ２ 分钟。 ０ （） ４ 每个三角瓶中移入 ３ １ ｍ 上述培养的菌溶液，３＇， 转／ ０ １０ 分钟 下 Ｃ ８ 摇床培养。 （） 定时取样，用紫外可见分光光度计测定染料浓度。测定前摇进行预处理，对于较 ５ 污浊的试样，先离心分离，在用微滤膜过滤；对于较清澈的试样，直接用微滤膜 过滤，然后测样。 （） ６ 采用上述同样步骤制作空白样，染料溶液中不含有白腐真菌生长所需的营养物。 三、实验结果与讨论 （一 ）菌种分离的到一株白腐真菌，暂时命名为 Ｆ ． ｌ （＿ ）扩人培养
孔雀石绿降解方法的研究进展
养殖与饲料2017年第8期图1孔雀石绿、无色孔雀石绿及其脱甲基衍生物的结构式摘要孔雀石绿（C 23H 25N 2Cl ，Malachite Green ，MG ）是一种三苯甲烷类化工染料，因其外观颜色呈孔雀绿而得名，在动物体内，孔雀石绿通过生物转化成无色孔雀石绿蓄积于动物组织中。
自1933年起孔雀石绿开始作为驱虫剂、杀菌剂、防腐剂等在水产养殖中出现，而后因为具有价格低廉、效果显著等优点，被广泛应用于预防与治疗各类水产动物的水霉病和对原虫的控制，但随着研究的深入，孔雀石绿潜在的具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等毒副作用受到关注。
因此，对于如何清除水体中孔雀石绿残留以及改善水环境污染的研究显得极其重要，本文将阐述国内外对于孔雀石绿降解方法的研究进展。
关键词孔雀石绿；降解方法；研究进展孔雀石绿降解方法的研究进展赵桐桐1，2李文悦1，3李继丰1张建雄1周鑫1*1.河北省唐山市畜牧水产品质量监测中心，河北唐山063000；2.河北北方学院，河北张家口075000；3.天津师范大学生命科学学院，天津300387收稿日期：2017-05-04*通讯作者赵桐桐，女，1995年生。
1孔雀石绿的化学性质孔雀石绿（C 23H 25N 2Cl ，Malachite Green ，MG ）是一种三苯甲烷类化工染料，又称碱性绿、盐基块绿、孔雀绿，是一类具有较强杀菌能力的染料类药物[1]。
它是一分子苯甲醛与两分子二甲基苯胺在浓硫酸或氯化锌存在的条件下聚合而形成的深绿色晶体，因其外观颜色呈孔雀绿而得名。
分子式为C 23H 25N 2Cl ，相对分子质量为365，易溶于水和乙醇。
孔雀石绿多以草酸盐（malachite green oxalate ，C 23H 25N 2+HC 2O 4-）形式制备并在市面上出售，盐酸盐（malachite green chloride ，C 23H 25N 2+Cl -）比较少见。
图1列出了孔雀石绿、无色孔雀石绿及一系列脱甲基衍生物的结构式[2]。
白腐真菌处理染料孔雀石绿的研究
白腐真菌处理染料孔雀石绿的研究作者：沈丹玉赵丽红许海瀛崔晓玲辛书扬佟广恩来源：《科技创新与应用》2015年第08期摘要：实验研究了白腐真菌B在不同振荡条件下、不同染料浓度、不同碳源浓度等环境因素对孔雀石绿脱色效果的影响。
实验结果表明菌株B在染料浓度为100mg·L-1，振荡速度为150r·min-1，碳源浓度为20g·L-1时，其脱色率最高。
关键词：白腐菌；染料；孔雀石绿；脱色孔雀石绿是一种合成染料，广泛应用于水产养殖业，在养殖鱼类中作为杀菌剂来防治原生动物和真菌感染。
在纺织品和皮革工业，被用来给丝绸、羊毛和皮革等进行染色[1]。
然而使用这种染料会产生大量问题，因为孔雀石绿具有毒性较高，致癌、致畸、致突变等副作用。
而且毒性效应会随着接触时间、温度和浓度而增加，其消除速率非常缓慢[2]。
因此，需要找到一种从池塘和工业废水中去除过量/残留孔雀石绿的有效方法。
人们采用各种非生物方法，但是需要昂贵的催化剂和试剂，这本身是不环保的。
而利用微生物分泌的酶是消除这种染料最好的方式，具有环境友好性。
白腐真菌，是分解合成染料非常有效的类群，然而微生物降解孔雀石绿是很难的，因为它具有杀菌性，从而阻止了原生物修复策略的执行。
但是白腐真菌分泌的木质素降解酶能够降解这类污染物，对脱色具有良好的效果[3]。
本实验通过研究白腐真菌对孔雀石绿的降解，研究了不同振荡情况、不同染料浓度、不同培养时间等条件下对染料孔雀石绿的脱色效果的影响。
1 实验材料与方法1.1 实验材料与仪器菌株：白腐真菌糙皮侧耳B（本实验室保存菌种）。
其他材料：孔雀石绿，土豆，琼脂，葡萄糖，硫酸铵，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素B1。
实验仪器：紫外-可见分光光度计，立式压力蒸汽灭菌器，振荡培养箱，电子分析天平，恒温培养箱。
1.2 实验方法1.2.1液体培养基葡萄糖20g·L-1，（NH4）2SO40.5g·L-1，KH2PO42g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5g·L-1，VB10.02g·L-1。
孔雀绿染料的微生物脱色研究
孔雀石绿染料的微生物脱色研究孔雀石绿（Malachite green）别名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿、苯胺绿、维多利亚绿或中国绿，亦为一种生物染色剂染料。
孔雀石绿过去常被用于制陶业、纺织业、皮革业、食品颜色剂和细胞化学染色剂，1933 年起其作为驱虫剂、杀虫剂、防腐剂在水产中使用，后曾被广泛用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病。
从上世纪90 年代开始，国内外学者陆续发现，孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿具有高毒素、高残留、高致癌和高致畸、致突变等副作用[1]。
许多研究表明，微生物具有极高的降解有机染料的能力，目前分离到的脱色微生物主要有真菌、藻类和细菌[2]。
但目前已报道的脱色菌的效率不高，且耐受孔雀绿染料的范围较低[3,4]。
本试验以高浓度孔雀绿染料为筛选底物，从活性污泥中分离出脱色菌，，能耐受并脱色降解较高浓度的孔雀绿染料，脱色能力强，且脱色速率高.1 实验设计方案与思路1.1 活性污泥分离纯化1.2 单菌种的扩大培养，在三角瓶中液体培养基培养1.3 不同单菌种对染料的降解实验：在三角瓶的液体培养基中加少量染料溶液(1000mg/L）和活性污泥，摇床培养，测定脱色率。
确定高效脱色菌种。
1.4 对菌种进行初步鉴定（菌种的形状、革兰氏染色）2 实验方法[5]2.1 活性污泥分离纯化配培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，蒸馏水1000mL，NaCl 5g，pH:7.0~7.2，15-25g/l 琼脂，配置的时候先配液体培养基，再加琼脂配固体培养基，然后分装成六个液体培养基（每个约100ml）和一个固体培养基，塞上棉塞，包扎好，待灭菌。
把实验要用到的实验仪器用报纸包好，用细线扎好，连同培养基一起放入高压蒸汽灭箘法灭菌。
倒平板经灭菌后的固体培养基冷却至50摄氏度左右倒入3个无菌培养皿中，冷凝成平板。
稀释样品将1瓶90 ml和5管9 ml的无菌水排列好，按10-1、10-2、、、10-6依次编号。
白腐真菌的培养及其在染料污水脱色中的应用
白腐真菌是一类具有引起木质 白色腐烂功能 的 丝状 真菌 的总 称 ｍ ．白腐 真 菌 的 菌 丝 可 以穿 入 木 质 进 入其 细胞 腔并 释 放 降解 木 质 素 和 其 他 木 质组 分 的 酶 ，使木 质腐 烂成 淡 色 海 绵状 团块 即 白腐 ．白腐 真 菌在生物降解 中具有非专一性 、非水解性 及细胞外
文献标志码 ：Ａ
文章编号 ：２０９５－４２７１（２０１６）Ｏ１－００７２－０４
Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｗｈｉｔｅ ｒｏｔ ｆｕｎｇｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｅ ｅｆｌ ｕｅｎｔ
ＸＩＥ Ｊｉｎｇ·ｒｕ，ＬＩＡＯ Ｒｏｎｇ，ＭＩＮＧ Ｚｈｕ，ＹＡＮＧ Ｈｕａ，ＷＡＮＧ Ｒｕｉ－ｊｕｅ，ＹＡＮＧ Ｓｈｅｎｇ－ｔａｏ
及应用 中随废水排放 到环境 中对环境和 生态造成十分严重的污 染，因此研 究染料 废水的 处理 具有十分重要 的意 义．白
腐真菌具有非专一性、非水解性 、细胞 外性及适 用于固、液基质等特 点 ，被广泛 的应 用于 降解 染料 废水．传 统工艺 中，对
菌株进行切割后加入到染料废 水 中，容 易引起 白腐 茵的物理损伤．本 文采用孢子接 种 的方式预先将 白腐 茵接 种 ，避 免
性 ，能够降解各种不 同结构的天然及合成化学物质 ， 形 成独 特 的降解模 式 ，且 降解 过程 中的关 键酶 种 都 是 在 培养 物 的细胞外 液或 细胞 外成 分 中分 离得 到 … 这 些 优 势使得 白腐 真 菌 在 污染 物 降解 方 面 得 到 广 泛 的 了白腐真菌并选取活性艳 红 ｘ．３Ｂ为模 型 污染物 ，考 察 了白腐 真菌对 染料脱 色的效
果．结果表 明白腐真 菌对 活性艳红的 降解效果十分 明显 ，仅 处理 ３天 降解率就达到 ６５．８２％．
菌种对孔雀绿染料的降解实验
2 实验方法
2.2.2活性污泥中菌种的分离纯化 活性污泥中菌种的分离纯化采用平板划线法。 1 在无菌操作台中，将平板倒置于酒精灯旁 ,左手拿出皿底 并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着酒精灯(这时皿 盖朝上，仍留在酒精灯旁)，右手拿接种环在酒精灯上烧红之 2 后再挑取一环活性污泥伸入培养皿内，先在平板上轻轻划一 折线（切勿划破培养基），转动培养皿，并将接种环上残菌 烧掉，冷却后使接种环从第一次画的折线的末端开始做第二 次折线划线，同法做第三、第四次划线。划线完毕（如上图） 3 盖好皿盖，倒置于37℃恒温培养箱培养7天后观察结果。（实 验将三个平板用于活性污泥菌种的分离纯化，做好标签）
3 结果与讨论
3.1孔雀绿的标准曲线制定
孔雀绿浓度 （mg/L） 吸光度A 0 0 2.16 0.137 4.32 0.266 6.48 0.383 8.64 0.527 10.80 0.652 12.96 0.811 17.28 1.071 21.60 1.299
3 结果与讨论
3.2不同菌种对染料的降解实验
01
PART 01 PART 02 PART 03
实验设计方案与思路
实验方法 结果与讨论 实验结论
PART 03
1 实验设计方案与思路
1.1 孔雀绿的标准曲线制定 1 1.2 活性污泥和土壤中菌种的分离纯化 1.3 单菌种的扩大培养 2 1.4 不同单菌种对染料的降解实验 1.5 对菌种进实验方法
2.1孔雀绿的标准曲线制定 配制浓度为216mg/L的孔雀绿标准溶液，在8支 1 50ml容量瓶中各加入该标准溶液0.50mL、1.00mL、 1.50mL、2.00mL、2.50mL、3.00mL、4.00mL和 5.00mL2 ，用水稀释至刻度、摇匀。在紫外分光光度 计上于波长617nm处，以水为参比，测定吸光度值 。利用所测得的标准系列的吸光度值对浓度作图， 3 绘制标准曲线。
孔雀石绿脱色研究
孔雀石绿脱色研究1 引言合成染料广泛应用于印染、制皮、化妆品、印刷、医药和食品加工等行业，然而，这些染料大多数都具有生物毒性和致畸致癌性，而且在自然环境中极难生物降解，对光、生物酶和其他环境条件的抵抗力极强.孔雀石绿作为一种三苯甲烷类染料，广泛应用于水产养殖业、食品加工业、医药行业等各个领域中.随其广泛使用，该染料对哺乳动物细胞、水生生物和其他有机生命体的致癌致畸效应也凸现出来，引起了科学界的广泛关注.因此，在许多国家和地区，该染料已被立法严禁使用，且被美国食品和药物管理局列为致癌性测试的优先化学物质之一.然而，由于孔雀石绿的生产成本较低、稳定性强且使用效果较好，难以找到合适的替代物，导致很多地区仍在广泛使用该染料，严重破坏了使用地区的生态平衡尽管许多科学工作者已致力于解决由孔雀石绿造成的环境污染问题，例如应用吸附、化学沉淀、光降解、渗透和膜过滤等理化处理技术处理污染水源;然而，由于这些处理方法不仅处理费用高、效率不高，而且在治污的同时容易产生二次污染和难以处置的底泥，因此，极大地限制了其广泛推广使用.生物处理技术作为一种环境友好型且高效低耗的处理手段受到越来越广泛的关注.其中，细菌由于生长速度快，容易获得大量生物量，且易产生大量降解相关酶，对染料的降解效率也较高等优势而受到环境工作者的青睐.本研究的目的在于：①广泛筛选浙南地区的MG高效脱色菌株;②初步鉴定MG高效脱色菌株为DH-9;③采用单因素实验研究菌株DH-9对MG的脱色特性，并采用响应面设计优化脱色条件.2 材料与方法2.1 实验材料 2.1.1 菌种来源供试土样取自浙江温州双屿皮革城和温州大罗山果园，菌株DH-9来源于常年被皮革废水污染的污泥中.2.1.2 试剂孔雀石绿属于三苯甲烷类染料，购自国药集团化学试剂有限公司;革兰氏染色液;TE缓冲液;Tris饱和酚(pH 8.0);氯仿;10×PCR缓冲液、DNA 连接酶、dNTPs和Taq DNA 聚合酶(TaKaRa 公司);DNA 纯化试剂盒(上海生工生物工程有限公司)等.其它生化试剂均为国产分析纯.2.1.3 培养基无机盐培养基(MSM)组成(g · L-1)：Na2HPO4，15.13;KH2PO4，3.0;NaCl，0.5;NH4Cl，1.0;MgSO4 · 7H2O，0.491;CaCl2 · 2H2O，0.026;pH 7.0.LB培养基组成(g · L-1)：蛋白胨，10;酵母膏，5;NaCl，10;pH 7.0~7.2.纯化培养基组成(g · L-1)：在MSM培养基中添加终浓度为200 mg · L-1的MG染料.2.2 实验仪器超净工作台;电热恒温鼓风干燥箱;高压蒸汽灭菌锅;全温恒温摇床;电子天平;pH计;高速冷冻离心机;Evolution 260紫外可见光分光光度计;Bio-rad PCR仪、自动凝胶图像分析仪及水平电泳仪等.2.3 实验方法 2.3.1 MG高效脱色菌株的富集、分离和纯化方法将1.0 g土样接入已灭菌的含100 mL MSM培养基的三角瓶中，同时在MSM培养基中添加已过滤除菌的MG母液作为唯一碳源，使其终浓度为20 mg · L-1.将三角瓶置于30 ℃、180r · min-1摇床中振荡培养1周后，吸取1 mL培养液转接至新鲜培养基(含40 mg · L-1的染料)中，连续驯化、富集.转接多次后，培养物可耐受的染料终浓度为200 mg · L-1.用接种环蘸取少许富集培养液，在纯化培养基平板上直接划线分离.在平板上选择不同形态特征的单菌落，重新转接至含200 mg · L-1 MG的纯化培养基平板上，转接多次直至获得单一形态的MG脱色菌纯培养物.2.3.2 菌株16S rRNA基因的PCR扩增与序列分析(1)提取基因组DNA：采用酚-氯仿法抽提基因组DNA，具体步骤参考《分子克隆实验指南》.(2)16S rRNA基因PCR反应：用于菌株DH-9 16S rRNA基因PCR反应的引物为一对通用引物，正向引物BSF8/20：5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′;反向引物BSR1541/20：5′-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3，PCR产物的纯化和测序由上海生工生物工程有限责任公司完成.所得序列用BLAST 程序与GenBank数据库(/blast)中的菌株进行比对，选取一些具有代表性的菌株用于系统发生树的构建.采用软件CLUSTAL X 1.8.3进行DNA序列同源性比较.比对结果用MEGA 4.1软件中的Neighbor-Joining的距离模进行UPGA分析后生成系统发育树.2.3.3 菌株DH-9对MG的脱色特性研究(1)培养基起始pH值对MG脱色的影响：用1.0 mol · L-1的HCl或NaOH将2.0 g · L-1酵母粉溶液的初始pH值分别调整到2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0.灭菌后添加过滤除菌的MG，使MG终浓度为100 mg · L-1，接种等量菌株DH-9过夜培养物(2%，V：V)，并于30 ℃、180 r · min-1条件下振荡培养.(2)培养温度对MG脱色的影响：分别设定培养温度为15、20、25、30、35和40 ℃.在2.0g · L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加过滤除菌的终浓度为100 mg · L-1的MG，接种等量菌株DH-9过夜培养物(2%，V∶V)，并于180 r · min-1条件下振荡培养.(3)接种量对MG脱色的影响：在2.0 g · L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加过滤除菌的终浓度为100 mg · L-1的MG，分别接种1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%和15%(V：V)的菌株DH-9过夜培养物，并于30 ℃、180 r · min-1条件下振荡培养.(4)碳氮源对染料脱色的影响实验：将所选碳源(葡萄糖、麦芽糖、乳糖、D-半乳糖、D-果糖、D-木糖和蔗糖)分别添加至MSM培养基中，使其终浓度为2.0 g · L-1.将所选氮源(NH4Cl、NaNO3、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、甘氨酸和L-谷氨酸)分别添加至无NH4Cl的MSM培养基中，使其终浓度为2.0 g · L-1.灭菌后添加过滤除菌的终浓度为100 mg · L-1的MG，接种等量菌株DH-9过夜培养物(2%，V∶V)，并于30 ℃、180 r · min-1条件下振荡培养(Parshetti et al., 2006; Kalme et al., 2009).(5)金属离子对MG脱色的影响：分别向2.0 g · L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加终浓度为1.0和2.0 mmol · L-1的CuCl2、FeCl3、CaCl2、ZnCl2、MgCl2和MnCl2，灭菌后添加过滤除菌的终浓度为100 mg · L-1的MG，接种等量菌株DH-9过夜培养物(2%，V：V)，并于30 ℃、180 r · min-1条件下振荡培养(Parshetti et al., 2006; Kalme et al., 2009).所有实验均重复3次以上，并同时设置对照实验.2.3.4 响应面设计优化菌株DH-9对MG的脱色条件在单因素实验的基础上，采用中心组合试验设计(Central Composite Design，CCD)对MG脱色条件进行优化，培养8 h后测定其脱色率.用标准多项式回归方法，对CCD设计实验数据进行拟合，得到一个二次多项式：式(1)中，Y为预测目标函数;β0为常数;βi为线性系数;βii为平方系数;βij为交互作用系数.本实验采用五因素三水平CCD设计来研究操作参数对MG脱色的影响，具体设计如表 1所示.2.4 数据统计分析CCD实验设计数据采用Minitab 14.0软件进行统计分析.3 结果与分析 3.1 MG高效脱色菌株的筛选与鉴定经多次富集、纯化培养后，获得了多株对MG有一定脱色能力的菌株，其中菌株DH-9对MG 的脱色效果最好，同时，全波长扫描结果显示脱色后有新的吸收峰产生(数据未给出)，加之脱色后菌体沉淀呈现无色，推测该菌株对MG的脱色可能是由生物降解引起的.因此，随后着重对菌株DH-9进行了鉴定.革兰氏染色结果显示菌株DH-9是革兰氏阴性菌，短杆状.菌落呈现圆形，乳白色，半透明，表面光滑湿润.以菌株DH-9基因组为模板，用引物BSF8/20和BSR1541/20进行PCR扩增，检测PCR产物、回收、纯化后测序，获得1475 nt的DH-9菌株的16S rRNA基因片段，在GenBank中的登录序号为KC736654.该序列经与GenBank中的数据比对后发现，其相似度与Enterobacter aerogenes strain ATCC 13048的相似度达到98%以上，并且在系统进化树中也与该菌株聚类在一起(图未给出)，表明菌株DH-9属于肠杆菌属.3.2 菌株DH-9对MG的脱色特性 3.2.1 pH值和温度对MG脱色的影响培养基初始pH值对MG脱色影响的结果如图 1a所示.培养12 h时，pH值在4.0~9.0之间的MG培养基脱色率在90%以上.培养24 h以后，pH值在3.0~9.0之间的MG培养基脱色率均在90%以上，说明该菌株对MG脱色的pH适应性较强，实际应用潜力较大.图 1图 1 pH(a)和温度(b)对MG脱色的影响温度对MG脱色的影响结果如图 1b所示.由图可知，培养12 h时，温度为30~40 ℃间的MG 脱色率在90%以上.随着脱色时间的延长，当培养时间超过24 h后，所测温度范围内(15~40 ℃)的MG脱色率均超过90%，表明该菌株对MG脱色的最适温度范围为30~40 ℃，温度适应性较好.碳氮源对MG脱色的影响如图 2a、图 2b所示.实验结果表明，培养48 h以内时，多数所测试碳源对MG脱色有抑制效应或无显著影响;而当培养时间超过72 h后，多数所测试碳源对MG脱色有促进作用，其中以乳糖、半乳糖和果糖促进效果最为显著，总体而言，所测试碳源中以半乳糖对MG脱色的促进效果最好.与碳源相比，多数所测试氮源对MG脱色的促进效果优于碳源，实验中所测试的氮源均能显著促进MG脱色.有机氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、甘氨酸和谷氨酸)比无机氮源(NH4Cl和NaNO3)的促进效果要好，其中尤以酵母粉、谷氨酸和甘氨酸的促进效果最好.图 2图 2 碳(a)、氮(b)源和金属离子(c)对MG脱色的影响 (1.1.0 mmol · L-1氯化铜; 2.2.0 mmol · L-1氯化铜; 3.1.0 mmol · L-1氯化铁; 4.2.0 mmo · L-1氯化铁; 5.1.0 mmol · L-1氯化钙; 6.2.0 mmol · L-1氯化钙; 7.1.0 mmol · L-1氯化锌; 8.2.0 mmol · L-1氯化锌;9.1.0 mmol · L-1氯化镁; 10.2.0 mmol · L-1氯化镁; 11.1.0 mmol · L-1氯化锰; 12.1.0 mmol · L-1氯化锰) Fig. 2 The effect of carbon(a)，nitrogen(b)resources and metal ions(c)on MG decolorization(1.1.0 mmol · L-1 CuCl2; 2.2.0 mmol · L-1 CuCl2; 3.1.0 mmol · L-1 FeCl3; 4.2.0 mmol · L-1 FeCl3; 5.1.0 mmol · L-1 CaCl2; 6.2.0 mmol · L-1 CaCl2; 7.1.0 mmol · L-1 ZnCl2; 8.2.0 mmol · L-1 ZnCl2; 9.1.0 mmol · L-1 MgCl2; 10.2.0 mmol · L-1 MgCl2; 11.1.0 mmol · L-1 MnCl2; 12.1.0 mmol · L-1MnCl2) 金属离子对MG脱色的影响如图 2c所示.由图可知，大多数所测试金属离子对MG脱色没有显著效应，仅Cu2+和Fe3+对MG脱色有显著抑制效应，钙离子对脱色有微弱促进效应.3.2.3 接种量对MG脱色的影响接种量对MG脱色的影响结果如图 3所示.当接种量从1%上升至3%时，MG脱色率上升趋势显著;而当接种量继续增大时，MG脱色率变化趋势则趋于平稳，均维持在90%以上.图 3图 3 接种量对MG脱色的影响3.3 菌株DH-9对MG的最优脱色条件 3.3.1 回归方程和预测模型的构建采用CCD设计优化MG的脱色条件和研究主效应因子间的交互作用，实验结果和模型预测结果如表 1所示.实验所得培养8 h后的孔雀石绿的脱色率分布在78.0%~99.2%之间，说明主效应因子对MG脱色影响显著.MG脱色率的实验值和预测值基本保持一致，说明所获得模型精确性较高.所获得模型的回归系数和统计学分析(ANOVA)结果如表 2和表 3所示.结果显示，模型的决定系数R2和校正决定系数(adjusted R2)分别为99.7%和99.2%，这就说明该模型精确性较高，可以用于MG脱色率的预测.因此，适于预测MG脱色率的二次模型公式可表示如下：式(2)中，DP是MG的脱色率，A到D是CCD设计的5个自变量，分别为pH、温度、半乳糖、酵母粉和氯化钙浓度.回归分析的F值和p值分别为201.26和<0.001，这说明该模型的显著性较高.线性和交互作用选项的p值也<0.001，这说明线性选项和交互作用选项AC、AD、AE、BC、BD、BE、CD、CE、DE对MG脱色的影响显著.此外，“lack of Fit”选项的F值和p值分别为4.57和0.058，说明相对于纯误差“lack of Fit”不显著，进而说明该模型与响应值(MG的脱色率)的拟合效果较好.3.3.2 主效应因子间的相互作用用Minitab 14.0软件分析获得的因素间交互作用的2D图如图 4～6所示.图 4显示了pH 和半乳糖、酵母粉、氯化钙浓度之间的交互作用及其对脱色的联合影响，结果表明pH和这3种因素之间的交互作用显著.如图所示，随着pH值逐渐升高，脱色率随半乳糖和酵母粉浓度的升高而逐渐降低，但其随氯化钙浓度的升高则呈现出先升高再降低的趋势.图 4图 4 pH和半乳糖(a)、酵母粉(b)、氯化钙(c)浓度对MG脱色的影响图 5显示了温度和半乳糖、酵母粉、氯化钙浓度之间的交互作用及其对脱色的联合影响，结果表明温度和这3种因素之间的交互作用显著.由图可知，随着温度逐渐升高，脱色率随半乳糖和酵母粉浓度的升高而逐渐降低，但其随氯化钙浓度的升高则呈现出先降低再升高的趋势.图 5图 5 温度和半乳糖(a)、酵母粉(b)、氯化钙(c)浓度对MG脱色的影响图 6显示了半乳糖浓度和酵母粉、氯化钙浓度之间以及酵母粉浓度和氯化钙浓度之间的显著的交互作用及其对脱色的联合影响.图 6a和6b表明随着半乳糖浓度的逐渐升高，脱色率随酵母粉和氯化钙浓度的升高而呈现降低趋势.由图 6c可知，随着酵母粉浓度的逐渐升高，脱色率随氯化钙浓度的升高也呈现降低趋势.图 6图 6 半乳糖和酵母粉(a)、氯化钙(b)及酵母粉和氯化钙(c)浓度对MG脱色的影响3.3.3 预测模型的验证为了确定CCD实验所获得二次模型的精确性，我们进行了验证实验.由软件分析获得的最优操作参数如下：pH值为6.0，半乳糖、酵母粉和氯化钙浓度分别为1.0 g · L-1、1.0 g · L-1和3.0 mmol · L-1，培养温度为34.5 ℃.在此条件下进行的验证实验结果表明孔雀石绿的最高脱色率为99.4%，在置信范围(100%±1%)区间内，因此，该模型对响应值的拟合效应较好.具体参见污水宝商城资料或更多相关技术文档。
Trametes_hirsuta_漆酶的分离纯化及其对活性染料脱色研究
山东农业大学学报(自然科学版),2024,55(1):076-083Journal of Shandong Agricultural University ( Natural Science Edition )VOL.55 NO.1 2024 doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2024.01.011Trametes hirsuta漆酶的分离纯化及其对活性染料脱色研究刘飞，李治宏，张仕豪，刘璇，郑晓晴，焦若若，朱友双*济宁医学院生物科学学院，山东日照 276800摘要：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在生物检测、工业染料脱色、有机农药降解、纸浆漂白及食品饮料等领域具有广泛的应用价值。
本研究使用实验室自主筛选鉴定的漆酶高产菌株粗毛栓菌（Trametes hirsuta），液态发酵后，培养液经硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose FF 阴离子交换层析分离纯化，酶活总得率57.2%，纯化倍数6.0倍，比活力为758.5 U/mg，漆酶的分子量约为50 kDa。
利用粗毛栓菌粗酶液分别对结晶紫、溴酚蓝、孔雀石绿、詹姆斯绿B进行脱色，同时研究了染料浓度、脱色温度、pH和NaCl对溴酚蓝和孔雀石绿脱色率的影响。
结果表明，溴酚蓝和孔雀石绿浓度分别为40 mg/L 和50 mg/L时脱色率较高；在脱色温度为50 ℃时，漆酶对溴酚蓝和孔雀石绿的脱色率较高，最高脱色率分别为68.51%和83.06%；溴酚蓝在pH 3.5时脱色率最高达到72.61%，而孔雀石绿的脱色率在pH 4.5时最高达到83.49%；NaCl对Trametes hirsuta漆酶催化染料脱色有一定的抑制作用。
本研究表明Trametes hirsuta漆酶在染料脱色中具有较大的应用前景，在工业废水的处理中具有良好的应用潜力。
关键词：粗毛栓菌；漆酶；分离纯化；染料脱色中图法分类号：Q939.5文献标识码： A文章编号：1000-2324（2024）01-0076-08 Isolation and Purification of Laccase from Trametes hirsuta and Its Application in Reactive Dye DecolorizationLIU Fei, LI Zhi-hong, ZHANG Shi-hao, LIU Xuan, ZHENG Xiao-qing,JIAO Ruo-ruo, ZHU You-shuang*School of Biological Science/Jining Medical University, Rizhao 276800, ChinaAbstract: Laccase is a copper-containing polyphenol oxidase with a wide range of application, including bio-detection, industrial dye decolorization, organic pesticide degradation, pulp bleaching, and the food and beverage industries. We utilized a high-yield laccase strain of Tramete hirsuta identified in the laboratory. The laccase was separated and purified through ammonium sulfate precipitation and DEAE Sepharose FF anion exchange chromatography. The enzyme activity yield was 57.2%, with a purification fold of 6.0 and a specific activity of 758.5 U/mg. The molecular weight of laccase was about 50 kDa. The crude enzyme solution from Tramete hirsuta was used to decolorize crystal violet, bromophenol blue, malachite green, and Janus green B. The effects of dye concentration, temperature, pH and NaCl on the decolorization rate of bromophenol blue and malachite green were also investigated. The decolorization rates were higher when the dye concentration was 40 mg/L for bromophenol blue and 50 mg/L for malachite green. The decolorization rates of laccase on bromophenol blue and malachite green were 68.51% and 83.06%, respectively, at the temperature of 50℃. Bromophenol blue exhibited the highest decolorization rate of 72.61% at pH 3.5, while malachite green showed the highest decolorization rate of 83.49% at pH 4.5. NaCl had an inhibitory effect on the dye decolorization catalyzed by Trametes hirsuta laccase. Our study showed Trametes hirsuta laccase has a great application potential in dye decolorization and industrial wastewater treatment.Keywords: Trametes hirsuta; laccase; isolation and purification; dye decolorization漆酶是一种古老的含铜多酚氧化还原酶，最早发现于日本漆树中(Rhusvernicifera)[1]，属于铜蓝氧化酶。
白腐真菌F1对染料脱色特性的研究
Ａｂ ｔａ ｔ Ｆ１ ｐ ｃｅ ｆｗｒ ｅｒ ｔｆ ｎ ｉ ｓｒ ｃ ，ａｓ ｅ ｉｓｏ ｉ ｏ ｕ ｇ ，ｗａ ｓ ｌｔｄ ｆｏ ｔ ｅｓ ｍｐｅ ｔｋ ｎ ｆｏ ｗｏ ｄ ｎ Ｂｅ ｇ， ｔ ｓｉ ａｅ ｒ ｍ ｈ ａ ｌ ａ ｅ ｒ ｍ ｏ ｓｉ ｉ ｎ ｏ ｊ ｉ
Ｃｈｉ ｎａ．Ｉｓｇｒ ｗｉ ｇ ｃ ｎｄ ｔｏ ｓ ａ ｔ ｅ ｏｏｒｚ ｔｏ ｂｉ ｔｅ ｏｒｆ ｕ ｎ ｄ ｇ ａ ａ ｌ ｅ ｏ ａ ｅ ｏ Ｐｈ ｅ ｔ ｏ ｎ ｏ ｉｉｎ ｎｄ ｉｓｄ ｃ ｌ ｉａ ｉｎ ａ ｌ ｉｓｆ ｏ ｒｎｏ — ｅ ｒ ｄ ｂ ｅｄｙ ｓ ｃ ｍｐ ｒ ｄ ｔ ａｎ — ｉ ｒ ｃ ａ ｔ ｈｒ ｓ ｓ ｏ ｉ ｏ ｈ ｅ ｅｃ ｙ ｏ ｐ ｒ ｕｍ ｗｅ ｅｔ ｓ ｅ ｒ ｅ ｔｄ．Ｔｈ ｅ ｕ ｔ ｎ ｃ ｔ ｄ ｔ ａ ａ ｅ ｖ ｂ ｖｅ９ ｅ ｒ ｓ ｌｓｉ ｄｉａ ｅ ｈ ｔＦ１ ｃ ｎ ｒ ｍｏ ｅ ａ ｏ ０％ ｏ ｈｅｃ ｏ ｆＮｅ — ｆｔ ｏｌｒｏ ｕ ｔ ａ ｒ ｌ ｗ ｒ ｌＤａ ｋ Ｙｅ ｌ ｏ ＧＬ，Ｍ ｏ ｄ ｎ ｕｅ １ ａ ｄ Ｃｏ ｇ ｄ． Ｗ ｈｉｅ ｒ ｔ ｆ ｎ ｃ ｎ ｄ ｃ ｌｒｚ ｈ ｈ ｚ ｒ ｏｕ ｅ， ｒ ａ ｔ Ｂｌ ｎ ｎ ｏ Ｒｅ ｔ ｏ ｕ ｇｉ ａ ｅ ｏｏ ｉｅ ｔ ｅ ａ ａ ｄ ｓ ｄｙ Ｍ ｏ ｄ ｎｔＢｌ ｆｉｉｎｔｙ ｔ ｕ ｔ ｏ ｒｃ ｎｃ ｎ ｒ ｔｏ ｒ ａ ｕｅ１ ｅ ｆｃｅ ｌ ｏ ｑ ｉｅｌ ｗｅ ｏ ｅ ｔ ａ ｉｎ．Ｍ ｏｒ ｏ ｅ ，ｗｈｉｅｒ ｔｆ ｎｇ ｅ ｏｄ ｃ ｄ ａ ｒ ｗ ｅｖ ｒ ｔ ｏ ｕ ｉｒ ｐｒ ｕ ｅ ｎｄ ｇ ｅ ｗｈｉ ｌ ｅ
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Ｊ １． ２ ０ ０脱 色 特 性 的研 究
白腐真菌的研究
简介
菌种及原理
木质素降解酶系
应用
总结及结尾
总结及结尾
由于白腐真菌对底物非特异性机制，使得该菌不仅可应用在木 质素—纤维素基质加工中，如制浆，饲料生产，在环境科学中， 如漂白废水处理，环境芳香物降解也日益受重视。
黄孢原毛平革菌研究为主
白腐真菌
系木 质 素 降 解 酶
木质素
更多底物
降解成 CO2,H2O
10
简介
菌种及原理
木质素降解酶系
应用
总结及结尾
应用
饲料
目前白腐菌降解木质素的模式菌株是黄孢原 毛平革菌．秸秆经白腐真菌发酵后，大部分 的低质非蛋白氮转 化为较高质量的菌体蛋白， 蛋白质品质也得到较大幅度的改进．秸秆经 白腐菌处理不仅营养成分有极大的提 高，而 且其pH值由未处理前的5.7降到4.0，呈愉快的 水果香味，同时由于大部分的木质素被降解 或破坏，秸秆 质地柔软，适口性明显改善； 可提高动物对饲料的消化， 并且已经突破了 秸秆仅用于反刍动物饲料的禁区， 对饲养猪、 鸡的实验效果已有报道．利用白腐真菌处理 秸秆能够快速、高质量地利用和转化秸秆资 源，扩大饲 料来源，减少环境污染
7
简介
菌种及原理
木质素降解酶系
应用
总结及结尾
木质素降解酶系
木素过氧化物酶
/R为催化底物,最上面Fe为+3价，其余+4价 8
简介
菌种及原理
木质素降解酶系
应用
总结及结尾
木质素降解酶系
锰过氧化物酶
锰过氧化物酶(MnP)普遍存在于白腐菌的各个菌种 中．与 LiP 一样它的催化循环也需要由 H2O2启 动．不同 之处在于，它以木质素组织中广泛存在的 Mn2+作为反应底物，同时以 Mn3+作为介质氧化木 素。
白腐真菌及其漆酶的应用研究
白腐真菌及其漆酶的应用研究白腐真菌是一类产生漆酶的真菌，广泛存在于自然界中，能够分解植物纤维素和木质素。
漆酶是一种蛋白质，具有高度催化活性，能够氧化各种有机物质。
因此，白腐真菌及其漆酶的应用研究在多个领域具有重要意义。
首先，在生物质能源转化中，白腐真菌及其漆酶的应用得到了广泛关注。
生物质能源是可再生能源的重要组成部分，其潜在资源非常丰富。
然而，植物纤维素和木质素的高度结晶性和抗酶解性限制了生物质的高效转化。
而白腐真菌及其漆酶能够有效降解植物纤维素和木质素，促进生物质的降解和转化。
因此，基于白腐真菌及其漆酶的生物质能源转化技术可以有效提高生物质的利用效率。
其次，在环境污染治理中，白腐真菌及其漆酶的应用也具有潜力。
许多有机污染物，如农药、染料和有机废物等，对环境和人类健康造成了严重威胁。
传统的污染物处理技术通常昂贵且不具备高效环保的特点。
而白腐真菌及其漆酶通过催化氧化有机物质，能够将有机污染物降解为无毒的物质。
因此，基于白腐真菌及其漆酶的环境污染治理技术有望成为一种高效、经济和环保的处理方法。
此外，白腐真菌及其漆酶的应用还可以推动生物医药领域的发展。
近年来，特别是在抗癌药物的研发方面，白腐真菌及其漆酶被广泛用于合成生物活性化合物。
漆酶作为一种催化剂，具有选择性催化和高效的特点，能够催化各种有机合成反应，合成具有药理活性的化合物。
因此，基于白腐真菌及其漆酶的生物活性化合物合成技术极大地推动了新药研发的进程。
综上所述，白腐真菌及其漆酶在生物质能源转化、环境污染治理和生物医药等领域的应用研究具有重要的意义。
随着对可再生能源、环境保护和药物研发的需求不断增加，相信白腐真菌及其漆酶的应用将继续得到进一步的研究和开发。
白腐真菌处理染料废水研究进展
环境学 院环境工程专业 ２０ 级 硕士研究生 ， ０４ 主要研 究方 向为水污染控 制。
相比之下 ，生物法具有运行费用低且处理量较 大的特点。但是 由于染料生产废水 的 Ｂ Ｄ Ｃ Ｄ比 Ｏ／Ｏ 值低 ，可生化性差，导致常见的生物法不能够获得 满意的处理效果。同时现有的研究表明，生物法对 染料废水的脱色处理主要发生在厌氧条件下 ，降解 过程中往往生成有毒性 的中问产物 （ 如苯胺 ） ，影
维普资讯
６ 期
朱建军等 ：白腐真菌处理染料废水研究进展
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响染料的后续生化降解。因此，需要进一步探索能
抵御生物降解等特性。染料在生产的过程中，大约 化法、 氧化法） 、辐照法 、离子交换法 、电解法
等。一般来讲物理化学法能够获得较高 的处理效 率 ，但是存在的主要问题是处理量较小 、处理费用
较高 ，投加的化学药品还会引起二次污染 。
会有 １％ ～１％的染料 随废水 排 出［ ０ ５ 引。其 中含有
朱建 军 ，曾抗 美
（ 四川大学建筑 与环境学 院 ，成都 ６０６ ） １０５
摘要 ：本文针对染料废水处理 中存在 的问题 ，介绍 了利用 白腐真茵处理废水 的一般机理及 其优 势。在此基础上 ，对该 茵种在 处理 染料废水研究应用 中的筛选 与降解机理、主要工 艺条件对处理效果 的影响和反 应 器类型 等方面的研 究成果
ｉｃｕｉｇｔｅｓｌｃ ｏ ｆｂ ｃ ｒ ｐ ｃｅ ， ｍａｎａ ｅｔ ｇｆｃ ｒ ｎ ｐ ｓｏ ａｔｒ ｎ ｌｄｎ ｅｅ ｔ ｎｏ ａｔ ｉ ｓｅ ｉ ｈ ｉ ｅａ ｓ ｉ ｆｃｉ ｔ ，ａ ｄｔ ｅ ｆｒ ｃ ． ｎ ａ ｏｓ ｙ ｅ ｏ
不同外源条件对4种白腐真菌溶藻效果的影响_唐黎
Abstract: [Objective] In order to evaluate the application potential of white-rot fungi Irpex lacteus XX-5, Trichaptum abietinum 1302BG, Ceriporia lacerata P2 and Bjerkandera adusta XX-2 in treating Microcystis aeruginosa. [Methods] Batch experiments were carried out to study the effect of pH, temperature, concentration of M. aeruginosa, metal ions, nitrogen source and phosphorus source on inhibition of M. aeruginosa by whiter-rot fungi. [Results] The results showed that under different exogenous conditions, four white fungi all showed good inhibition effect, achieving 60% of inhibiting rate. C. lacerata P2 and B. adusta XX-2 strains were less effected by environmental factors, and the inhibiting rates of both strains were over 70% and 60% respectively. The algal inhibiting rate of T. abietinum 1302BG and I. lacteus XX-5 could be slightly affected by experimental factors, however the inhibiting rates were still over 60%. [Conclusion] Therefore, the four white-rot fungi, especially for C. lacerata P2 and B. adusta XX-2, had a good potential for
孔雀石绿降解菌的筛选及降解研究的开题报告
孔雀石绿降解菌的筛选及降解研究的开题报告一、选题背景孔雀石绿是一种禽畜养殖中常用的抗菌药物，但其在生产和用药过程中容易残留在动物产品中，对人体健康产生潜在危害。
因此，孔雀石绿在各国的监管中被列为限制或禁止使用。
但是，由于其化学性质稳定，常规的物理和化学处理方法难以有效去除孔雀石绿。
因此，孔雀石绿降解菌的筛选及降解研究具有重要的理论和实际意义。
二、选题目的本研究旨在通过筛选具有高效降解孔雀石绿能力的菌株，并探究其降解孔雀石绿的机理和途径，为孔雀石绿的污染治理提供新的技术手段和理论支持。
三、研究内容与方法（一）菌株筛选：在禽畜养殖废水和土壤样品中筛选出具有高效降解孔雀石绿能力的菌株。
方法：利用孔雀石绿为唯一碳源进行菌株筛选，采用常规细菌学和分子生物学方法对菌株进行鉴定和分类。
（二）降解实验：对筛选出的菌株进行降解实验，考察不同降解条件对降解效果的影响。
方法：在不同条件下进行降解实验，如不同底物浓度、温度、pH值等条件，同时通过高效液相色谱法(HPLC)对底物和降解产物进行检测和分析，以确定降解效果。
（三）降解机理研究：通过分析降解产物和代谢途径，探究菌株降解孔雀石绿的机理和途径。
方法：采用色谱质谱联用技术（LC-MS）对降解产物进行分析和鉴定，同时结合代谢途径推测和酶活性检测等方法，研究降解机理和途径。
四、预期结果和意义本研究预计筛选出一株具有高效降解孔雀石绿能力的菌株，并对其降解机理进行深入研究，为孔雀石绿的污染治理提供新的技术手段和理论支持。
同时，本研究建立的研究方法也有望为其他有机污染物降解研究提供借鉴和参考。
真菌M2对染料脱色的研究
了不同脱色条件下 Ｍ ２对孔雀绿脱色效果． 结果表 明， ２对染料 的脱 色过程是 先吸 附 Ｍ
然后逐渐降解． 在添加 ０ １％吐温 一 ０ 导荆时， ．５ ８诱 培养 ４ ， ｄ 该茵脱 色率 由无诱 导剂 时
的 ７％ 提 高到 ９ ％ ． ６ ６ 在保 证 良好 的 降解 效 果 的前 提 下 ， ２能耐 受 ６ 的 盐度 ． Ｍ ％ 而辅 助
作者简介 ： 张丽芳（９５ ）女 ， １７一 ， 辽宁东港 人， 讲师 ， 博士研究生
实验用真菌菌株是从土壤 中反复分 离、 纯化
维普资讯
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８ ４・
沈 阳 理 工 大 学 学 报
２０ 年 ０６
获得并保存在 Ｐ Ａ培养基上 ， Ｄ 然后将真菌分别点 种于含 甲基橙 、 刚果红 、 中性红 、 孔雀绿 染料筛选 培养基上，ｄ ７ 后观察菌落周围脱色圈的大小＋ 真菌 产木质素酶特性的检测参见文献［ ］ ５．
维普资讯
２ ６ 月 年ｌ ０ ０ ２
第２ ５卷 第 ６期
沈 阳 理 工 大 学 学 报
ＨＥ ＯＮＧ Ｕ ＶＥ Ｉ ＮＩ ＲＳ ＴＹ Ｔ ＡＮＳ Ｔ ＯＮＳ ０Ｆ Ｓ ＮＹＡＮＧ Ｕ Ｇ Ｒ ＡＣ Ｉ
Ｖ０ １． ２ ５ Ｎ０ ． ６ Ｄｅ ． ２ ０ ０ ６ ｃ
Ｓ ４ ． ｇＬ， ａ １ｌ／ ， ｅ Ｏ ． ｇ Ｌ 酒 石 酸 铵 Ｏ ５ ／ Ｎ Ｃ ｇ Ｌ Ｆ Ｓ ４ １／ ， ０ ０
０ ２／ ， ．ｇＬ 染料 ５ ｍ ／ ， ０ ｇＬ 葡萄糖 ５ｇ Ｌ ／ ．
收 稿 日期 ：０ ６—０ ２０ ３—１ ４ －
１３ 高效 脱色菌 的 筛选分 离 ．
吸附 、 离子交换 、 超滤、 渗析 、 化学氧化 、 光氧化 、 电 主要药品 ： 葡萄糖 、 酒石酸铵 、 ｇＯ ７ 、 Ｍ Ｓ ・ Ｈ ０ 解、 萃取法等 ． Ｊ然而， 这些方法 去除各 种染料适 Ｋ Ｏ 、 Ｐ Ｈ Ｐ Ｋ Ｈ Ｏ 等均为分析纯． 试验中使用 的染
孔雀石绿的分析
结果处理：
用酶标仪于450nm处测定各孔溶液的吸光度(A)。标 准溶液中无色孔雀石绿的浓度越大,吸光度越小。以A～ logC作图得到测定无色孔雀石绿的标准曲线,从图中可以 算出检出限(DL)和IC50值。IC50值越小,灵敏度越高。待 测样品中无色孔雀石绿的浓度可根据其相应的吸光度从标 准曲线中求出。
二、多克隆抗体的制备
将免疫原(LMG-BSA)与福氏完全佐剂以1∶1混溶, 对两只新西兰大白兔进行多次免疫(第一次动物免疫将 免疫原与福氏完全佐剂混溶,之后的动物免疫将免疫原 与福氏不完全佐剂混溶),经5次免疫后,制得多克隆抗体。
三、间接酶联免疫吸附分析法步骤
用包被抗原(LMG-OVA)包被酶标板,200μL/孔， 4℃过夜。 用PBST缓冲液洗板3次, 300μL/孔，加入1%Casein进行 封阻，室温放置1h,洗板。 加入抗体,标液(或样品稀释液)各100μL/孔,室温孵育1h。 包被在酶标板上的固定抗原(LMG-OVA)和添加的标液中 的LMG游离抗原与竞争抗体的结合位点。PBS洗涤扣干3 次，游离的抗原抗体复合物被洗涤去除。 加入用PBS稀释的山羊抗兔 IgG2辣根过氧化物酶偶合物 (GaRIgG-HRP), 200μL/孔,室温1h。形成抗原-抗体-酶标 二抗的复合物固定在酶标二抗上，洗板, 。PBS洗涤扣干3 次，游离的酶标二抗被洗涤除去。 加入TMB底物溶液200μL/孔,显色,避光反应,在微量振荡器 上振摇约15～20min。 加入5%硫酸,80μL/孔,终止反应。
二、免疫学检测主要用酶联免疫检测法。
国内孔雀石绿检测标准
酶联免疫检测法
理化检测方法适用于专业检测和实验室使用，,但难以满足现 场快速检测和基层样品初筛的要求。近年来发展迅速的免疫分析 法(IA)集免疫反应、有机合成、酶催化等先进技术于一身,具备快 速准确,成本低廉等特点,可以满足现场初筛,快速判定的要求。
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白腐真菌处理染料孔雀石绿的研究
实验研究了白腐真菌B在不同振荡条件下、不同染料浓度、不同碳源浓度等环境因素对孔雀石绿脱色效果的影响。
实验结果表明菌株B在染料浓度为100mg·L-1，振荡速度为150r·min-1，碳源浓度为20g·L-1时，其脱色率最高。
标签：白腐菌；染料；孔雀石绿；脱色
孔雀石绿是一种合成染料，广泛应用于水产养殖业，在养殖鱼类中作为杀菌剂来防治原生动物和真菌感染。
在纺织品和皮革工业，被用来给丝绸、羊毛和皮革等进行染色[1]。
然而使用这种染料会产生大量问题，因为孔雀石绿具有毒性较高，致癌、致畸、致突变等副作用。
而且毒性效应会随着接触时间、温度和浓度而增加，其消除速率非常缓慢[2]。
因此，需要找到一种从池塘和工业废水中去除过量/残留孔雀石绿的有效方法。
人们采用各种非生物方法，但是需要昂贵的催化剂和试剂，这本身是不环保的。
而利用微生物分泌的酶是消除这种染料最好的方式，具有环境友好性。
白腐真菌，是分解合成染料非常有效的类群，然而微生物降解孔雀石绿是很难的，因为它具有杀菌性，从而阻止了原生物修复策略的执行。
但是白腐真菌分泌的木质素降解酶能够降解这类污染物，对脱色具有良好的效果[3]。
本实驗通过研究白腐真菌对孔雀石绿的降解，研究了不同振荡情况、不同染料浓度、不同培养时间等条件下对染料孔雀石绿的脱色效果的影响。
1 实验材料与方法
1.1 实验材料与仪器
菌株：白腐真菌糙皮侧耳B（本实验室保存菌种）。
其他材料：孔雀石绿，土豆，琼脂，葡萄糖，硫酸铵，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素B1。
实验仪器：紫外-可见分光光度计，立式压力蒸汽灭菌器，振荡培养箱，电子分析天平，恒温培养箱。
1.2 实验方法
1.2.1液体培养基
葡萄糖20g·L-1，（NH4）2SO40.5g·L-1，KH2PO42g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5g·L-1，VB10.02g·L-1。
1.2.2 白腐真菌对孔雀石绿的降解
将菌种活化后接种到内装150mL培养基的500mL锥形瓶中，150r·min-1，30℃摇床培养3-4天，使其形成光滑均匀，大小适中的菌丝球，过滤收集菌球，将白腐真菌菌球接种到装有100ml的已灭菌的孔雀石绿共培养液的锥形瓶中，用棉花塞塞住瓶口，放入振荡培养箱（150r·min-1，30℃）培养。
1.2.3 培养液吸光度的测定
连续几天每天取实验样品进行测定，分别用紫外-可见分光光度计在618nm 波长下测量其吸光度，记录其数据。
1.2.4 脱色率的计算
脱色率η=（A0-A1）/A0×100%
式中：η为脱色率；
A0为降解前孔雀石绿溶液的吸光度；
A1为处理后孔雀石绿溶液的吸光度。
2 结果与讨论
2.1 不同孔雀石绿浓度对脱色率的影响
配制浓度为50、100、150、200、250、300、350mg·L-1的染料共培养液，在无菌环境中接种已培养好的菌体。
按1.2.4的方法测定脱色率，考察孔雀石绿浓度对脱色效果的影响，结果见表1。
由表1可知，孔雀石绿浓度在50～350mg·L-1范围内，菌株B对孔雀石绿的脱色活性都很高。
这说明菌株B对孔雀石绿的适应浓度范围较广，脱色效果显著。
表1 孔雀石绿浓度对脱色效果的影响
2.2 培养箱转速对脱色率的影响
培养箱转速对脱色率的变化如图1所示。
从图1可见，在80-170r·min-1的转速范围内，初始时脱色率随着转速增大而增大，在150r·min-1时达到最大，之后呈减小趋势，说明转速过高会影响白腐真菌的生长，降低脱色效率，最适宜的转速取150r·min-1。
图1 培养箱转速对脱色效果的影响
图2 不同碳源浓度对脱色效果的影响
2.3 不同碳源浓度对脱色率的影响
配制碳源浓度分别为5、10、15、20、25、30g·L-1的培养基，在同一染料浓度下接种白腐真菌B进行脱色。
振荡培养4天后，分别测定其脱色率，如图2所示。
从图2可见，碳源浓度在5～20g·L-1时，脱色率随着碳源浓度增加而增大，当碳源浓度超过20g·L-1时，脱色率开始下降，说明过高的碳源浓度会抑制菌株B的生长，进而影响其降解能力，故取碳源浓度为20g·L-1。
3 结束语
（1）白腐真菌菌株B对孔雀石绿溶液有良好的脱色作用。
（2）菌株B在染料浓度为100mg·L-1，振荡速度为150r·min-1，碳源浓度为20g·L-1时，其脱色率最高，达到90%。
参考文献
[1]Maalej-Kammoun M，Zouari-Mechichi H，Belbahri L，et al. Malachite green decolourization and detoxificationby the laccase from a newly isolated strain of Trametes sp[J]. Int Biodeterior Biodegrad，2009，63：600-606.
[2]Diwaniyan S，Kharb D，Raghukumar C，et al. Decolorization of synthetic dyes and textile effluents by basidiomycetous fungi[J]. Water Air Soil Pollut，2010，210：409-419.
[3]颜克亮，吴航军，王宏勋，等.木质纤维素水提物促进白腐菌降解孔雀绿研究[J].环境污染与防治，2009，31（7）：25-29.。