第9章 酶促反应动力学

酶与底物先络合成一个过渡态络合物，然后络合物进一步分解为产物和 游离态酶。这个学说的前提是酶与底物反应的“快速平衡”，即在反应的 开始阶段，两者反应速度很快，迅速建立平衡关系。
E+S
K1
K2
ES
K3
E+P
第一步：酶（E）与底物（S）作用，形成酶-底物中间产物 （ES）：E+S←→ES (k1和k2是正、逆反应的速度常数)
（2）米氏方程的推导(Michaelis-Menten)
根据中间络合物学说，酶促反应分两步进行: K1 k2
E+ S
ES
k3 k4
E+P
简单起见，只考虑单底物和单产物的催化反应。 E+ S
K1 k2
ES
ES
k3 k4
E+P
在反应初期，[P]的浓度非常低，因此整个反应可简化为 E+ S
K1 k2
ES
酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因 素的科学。
浓度对酶反应速率的影响
抑制剂对酶反应速率的影响
温度对酶反应速率的影响 pH对酶反应速率的影响 激活剂对酶反应速率的影响
一、化学动力学基础
化学反应的方向、可能性和限度 化学热力学(结果)
化学反应
化学反应的速率和机制 化学动力学（过程）
2.2 酶促反应动力学
（1）米氏方程
1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间络合物学说
对酶促反应的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底
物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程。
V=
Vmax [S] Km + [S]
Km — 米氏常数 Vmax — 最大反应速度
米氏方程——
Vmax和k3（kcat）的意义
k3 ES →E+P
当[S]很大时,v=vmax=k3[Et]
K3 表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子 数，这个常数又叫转换数，称为催化常数（kcat）， kcat越高， 表示酶的催化活力越高，所以，Vmax=kcat[E]
kcat/Km 的意义
生理条件下，大多数酶并不被底物所饱和，体内 [S]/Km 介 于0.01~1 之间。 Vmax ×[S] v= Vmax=kcat[Et] Km+[S] kcat[Et] ×[S] v= Km+[S] v=
例如酶促反应的最大速度
3. 各级反应的特征：
1. 一级反应： v=-dc/dt=kc 2. 二级反应 v=-dc/dt=kc1c2 3. 零级反应 v=-dc/dt=k
t1/2 ≈0.693/k 不论反应物初浓度 的多少，其半衰期 是一样的
t1/2=1/ka 初浓度越大，反应 物减少一半所需时 间越短

40
20
一级反应
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Henri的蔗糖水解实验 ——保持酶浓度不变
Concentration of Substrate(umol/L)
[S]
E + S ES E + P
v
Rate of Reaction(v)
100
E
80
混合级
60
40
20
t1/2=a/2k 初浓度越大，半衰 期越长
二、酶促反应动力学

概念
酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此 速率的各种因素的科学，是酶工程研究中的一个重要 内容。

影响因素包括有
酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。 研究一种因素的影响时，其余各因素均认为恒定。
1903 年Henri用蔗糖酶水解蔗糖研究底物浓度与反应速率的关 系，当保持酶浓度不变时，得到双曲线图，并提出酶底物中间 络合学说。
形成ES复合物后，酶的物理性质，例如溶解度或热稳定性发
生改变； 某些酶和底物相互作用的ES复合物已经得到分离； 酶和底物可形成共沉淀。
2.1.2 酶被底物饱和现象和“中间络合物”假说
E + S ES E + P
100
E
v
80
Rate of Reaction(v)
60
在底物浓度低时, 酶未被饱和，反应 速度V 取决于底物浓度，与底物浓度 [S]成正比，表现为一级反应特征。
kcat
当[S]<<Km时，自由酶浓度=Et
Km
[E][S]
比较不同酶或者同一种酶催化不同底物的催化效率
2.3 作图法测定Km和Vmax
作图法测定Km和Vmax——双倒数作图法
将米氏方程取双倒数： Vmax ×[S] v= Km+[S] =
-1/Km
1/v
斜率=Km/Vmax
1.0
0.8
0.6
0.4
([Et]－[ES]) ×[S] [ES]
＝
k2+k3
k1
米氏常数（Km）的意义
V=
V
Vmax Vmax/2
Vmax [S] Km + [S]
当反应速度等于最大速度一半时, 即V = 1/2 Vmax, Km = [S]

上式表示,米氏常数是反应速度为 最大值的一半时的底物浓度。

因此,米氏常数的单位为mol/L。
k3
E+P
在整个酶促反应中，反应的限速步骤为[ES]分解生成[E]和
[P]的过程，因此反应的初速度可以表示为
V = k3[ES]
在反应过程中，游离的酶浓度可以表示为
[Et]= [E] + [ ES] ，其中Et为酶的总浓度
在反应过程中，底物浓度[S]是远远高于酶浓度的[Et] ，即 [S]>>[Et], 所以游离的底物浓度可以用[S]计算。
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Concentration of Substrate(umol/L)
[S]
随着底物浓度的增高, ES生成量多，反应速率取决于ES浓度， 而反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。
E + S ES E + P
v
Rate of Reaction(v)
•Michaelis和Menten根据中 间复合物学说提出： E+S E+P ES Briggs 和 Haldance对其 进行修正，提出了稳态理 论： E+S ES E+P
所谓稳态是指反应进行一段时间以后，系统 复合物ES的浓度由零增加到一定数值，在一 定时间内，尽管底物浓度和产物浓度在不断 变化，ES也在不断生成和分解，但是当反应 系统中ES的生成速度和分解速度相等时候， ES浓度保持不变的反应状态成为稳态，即 d[ES]/dt=0
第二步：中间产物分解，形成产物（P），释放出游离酶(E)：
ES←→P+E 许多实验事实证明了 E －S 复合物的存在，E －S 复合物形成的速率与酶
和底物的性质有关。
酶和底物中间复合体的证据：
ES复合物已经被电子显微镜和X射线晶体结构分析直接观察 到； 酶和底物形成ES复合物后光谱特性发生改变；
化学动力学的研究内容具体为确定反应速率，了解浓度、温 度、pH值、催化剂等因素对反应速率的影响，揭示化学反应 机制。 反应速率：单位时间内反应物或者生成物浓度的改变。 v=(±)dc/dt
1. 反应速率及测定
反应速率：单位时间内反应物或者生成物浓度的改变。
监测反应物的浓度变化： v=(c2-c1)/(t2-t1)= -dc/dt 监测生成物的浓度变化： v=(c2-c1)/(t2-t1)= dc/dt
2) 序列反应-随机机理：
E+A←→EA B EAB←→EPQ E+B←→EB A P EQ←→E+Q Q EP←→E+P
3) 乒乓反应机理（转氨酶的反应属于这类型） ：
A E P B Q E
两种不同模式的双底物反应
顺次式(sequential)
乒乓式(ping-pong)
双底物反应的米氏方程
当P1, P2 = 0 时
100
v
80
Rate of Reaction(v)
60
40
20
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Henri的蔗糖水解实验 ——保持酶浓度不变
Concentration of Substrate(umol/L)
[S]
2.1 底物浓度对酶反应速度的影响
2.1.1 中间络合物学说
100
零级反应
E
80
Vmax
60
40
20
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Concentration of Substrate(umol/L)
当底物浓度达到相当高时，底物浓度对反应速率影响变小， 最后反应速率与底物浓度无关，反应达到最大速率 Vmax。 只有酶的催化反应具有这样的饱和现象。
=
竞争性米氏方程 米氏方程
α=1+[I]/Ki Vmax不变，Km变大，双倒数作图与正常直线相交于纵轴
3.2 非竞争性抑制


底物和抑制剂结构上没有共同之处，但酶可同时与底物及抑制剂结 合形成三元复合物，但复合物不能进一步分解为产物。由于这类物 质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。 如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子 的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性 抑制。
酶的活性。
根椐可逆抑制剂与酶结合情况可分为竞争性抑 制、非竞争性抑制与反竞争性抑制三类。