酶的固定化及在医药中的应用
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酶工程及固定化技术发展史
在20世纪20年代，就出现了酶工程，以自然酶制 20世纪20年代，就出现了酶工程， 世纪20年代 酶工程 剂在工业上大规模应用的特征， 剂在工业上大规模应用的特征，原料以动植物为主
1953年 1953年，Grubhoger Schleith 用重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂 对羧肽酶、蛋白酶、核酸酶等进行固定，产生了固定化酶技术 固定化酶技术。 对羧肽酶、蛋白酶、核酸酶等进行固定，产生了固定化酶技术。
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固定化酶及在医药中的应用
Contents
1 2 3 4
酶工程及固定化技术发展史
酶的固定化方法
应用
展望
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酶工程简介
酶工程是酶学和工程学相 酶工程是酶学和工程学相 互渗透发展而成的一门新的技 术科学。 术科学。它是从应用的目的出 研究酶，应用酶的特异性、 发，研究酶，应用酶的特异性、 催化功能，并通过工程化 工程化将相 催化功能，并通过工程化将相 应的原料转化成有用物质的技 术
固定化酶医药上的应用
• 1. 固定化酶在氨基酸生产上的应用
反应 DL-氨基酸 → D-氨基酸 + L-氨 基酸 苯酚 + 丙酮酸 + NH3 → L-酪氨 酸 吲哚 + 丙酮酸 + 醋酸铵 → 色 氨酸 DL-苯乙内酰脲 → D-苯甘氨酸 DL-5-对羟基苯乙内酰脲 → D-对 羟基苯甘氨酸 酶 氨基酰化酶 -酪氨酸酶 色氨酸酶 乙内酰脲酶 乙内酰脲酶
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共价结合法
• 是酶以共价键结合于载体上的固定化方法 是酶以共价键 共价键结合于载体上的固定化方法 • 常用载体： 常用载体：
天然有机载体：多糖、蛋白质、 天然有机载体：多糖、蛋白质、细胞等 无机物：玻璃、 无机物：玻璃、陶瓷等 合成聚合物：聚酯、聚胺、 合成聚合物：聚酯、聚胺、尼龙等 • 优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，酶不易 优点：酶与载体结合牢固，稳定性好， 脱落 • 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，可能会破坏 缺点：反应条件苛刻，操作复杂， 酶的活性中心
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交联法
• 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用， 双功能试剂使酶分子之间发生交联作用 成网状结构 • 特点：此法与共价结合法一样也是利用共价键固 特点： 定酶的， 定酶的，所不同的是不使用载体 • 常用交联剂：戊二醛、己二胺、双偶氮苯等 常用交联剂：戊二醛、己二胺、
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固定化酶及其相应产品
固定化酶 青霉素酰化酶 氨苄青霉素酰化酶 青霉素合成酶 5'-磷酸二酯酶 类固醇酯酶 多核苷酸磷酸化酶 前列腺素合成酶 辅酶A合成酶系 氨甲酰磷酸激酶 产品 6-APA,7-ADCA 氨苄青霉素酰胺 青霉素 5'-核苷酸 睾丸激素 多聚核苷酸 前列腺素 CoA ATP 固定化酶 短杆菌肽合成酶系 右旋糖酐蔗糖酶 天冬氨酸酶 色氨酸合成酶 转氨酶 腺苷脱氢酶 延胡索酸酶 酵母酶系 3'-核糖核酸酶 产品 短杆菌肽 右旋糖酐 L-天冬氨酸 L-色氨酸 L-苯丙氨酸 IMP L-苹果酸 ATP,FDP,间羟胺 3'-核苷酸
优点：结合牢固，可以长时间使用 优点：结合牢固， 缺点：因交联反应激烈， 缺点：因交联反应激烈，酶分子多 个基团被交联，酶活损失大， 个基团被交联，酶活损失大，颗粒 较小， 较小，使用不便
酶
双功 能剂
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包埋法
• 聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进 聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进 包括交联剂)的作用进行聚合 包括交联剂 的作用进行聚合， 剂(包括交联剂 的作用进行聚合，酶被包埋在聚合 物中以达到固定化 • 分类：网格型（凝胶包埋法）；微囊型（微囊化 分类：网格型（凝胶包埋法）；微囊型（ ）；微囊型 法）
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常用的酶固定化载体
•
物理吸附 活性炭 氧化铝 碳酸钙 胶棉 阳离子交换树脂 多孔玻璃 矾土 二氧化硅 淀粉 明胶 阴离子交换树脂
吸附法
包埋法
离子吸附 羟甲基纤维素 DEAE-纤维素 TEAT-纤维素 卡拉胶 海藻胶 硅胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂 聚乙烯醇
共价结合法
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酶工程及固定化技术发展史
1969年 1969年，千田一郎等用固定化氨基酰化 酶技术拆分了DL 氨基酸，生产L 氨基酸， DL酶技术拆分了DL-氨基酸，生产L-氨基酸， 随后固定化天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸 随后固定化天冬氨酸酶生产L 开创了固定化酶应用的局面 固定化酶应用的局面。 等，开创了固定化酶应用的局面。
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离子结合法
• 利用含有离子交换基团的固相载体与酶蛋白分子 利用含有离子交换基团的固相载体与酶蛋白分子 离子交换基团 带电基团互相吸引 靠离子链） 互相吸引（ 的带电基团互相吸引（靠离子链）而形成络合物 • 载体：多糖类离子交换剂、合成高分子交换树脂 载体：多糖类离子交换剂、 纤维素， 如DEAE-纤维素，IR-45等 纤维素 等 • 优点：操作简单，处理条件温和，能得到酶活回 优点：操作简单，处理条件温和， 收率较高的固定化酶 • 缺点：载体和酶的结合力较弱，离子键结合较松 缺点：载体和酶的结合力较弱， 易受缓冲液种类或pH的影响 的影响， 散，易受缓冲液种类或 的影响，
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新型载体
磁性体Fe3O4与聚苯乙烯、含醛基聚合 物一起溶解混合后，再除去溶剂可获得 磁性载体
磁性载体 导电聚合物
新型 载体
光敏性基团的载体 温敏载体
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应用
医药
食品工业 环境保护
生物传感器
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固定化技术
固定化酶
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固定化酶制备原则
（1）维持酶的催化活性及专一性 （2）有利于生产自动化、连续化 有利于生产自动化、 （3）应有最小的空间位阻 （4）酶与载体必须结合牢固 （5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或 反 应有最大稳定性，载体不与废物、 应液发生化学反应 （6）成本要低
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展望
• 酶固定化技术已在食品工业、精细化学品工 业、医药，尤其是手性化合物等行业得到广 泛应用，在废水处理方面也取得了一定进展 • 固定化酶技术目前还存在固定效率低、载体 的有毒性、成本高、稳定性差、不能大规模 生产等问题 • 如何充分利用天然高分子载体对其改性，或 利用超临界技术、纳米技术、膜技术等来固 定酶，必定会成为研究的热点
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固定化酶医药上的应用 • 2. 用大孔径N-聚氨乙基丙烯酰胺为载 体，将前列腺素合成酶固定化，合成前 列腺素衍生物E1 • 3.将葡聚糖磁性毫微粒固定化L-天冬酰 胺酶，通过血液注射治疗急性淋巴白血 病 • 4.琼脂糖固定化牛胰核糖核酸酶能很好 地催化合成重要的寡核苷酸
纤维素 Sephadex A 200 琼脂 对氨基苯纤维素 聚丙烯酰胺 尼龙 多孔玻璃珠
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传统载体材料的改性
• 载体材料的性能直接影响其固定化酶的催化 活性 • 理想的载体材料应具备良好的机械强度、热 稳定性、化学稳定性、耐生物降解性及对酶 的高度亲和性，并能保持较高的酶活性等 • 传统的无机载体材料一般是借助吸附方法来 制备固定化酶，或经小分子化学改性以共价 键合方式制备固定化酶
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固定化酶的优点
长时间使用， 长时间使用， 在绝大多数情 况下提高了酶 的稳定性， 的稳定性，有 利用工艺的连 续化和管道化 续化和管道化
1
2
极易将固定化 酶与底物、 酶与底物、产 物分开
优点
酶反应过程可以 严格控制， 严格控制，有利 于工艺自动化和 微电脑化 酶的使用效率 提高， 提高，适合于 多酶反应
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传统无机载体存在问题
结构不易调控
传质差
键合酶的能力差
利用组成和结构 可调控的有机聚 合物对传统无机 载体材料改性修 饰，制备兼具两 者优良特性的复 合载体
如用右旋糖苷对硅胶表面改性修饰可改善其表面的生物亲和性， 如用右旋糖苷对硅胶表面改性修饰可改善其表面的生物亲和性， 用于固定葡萄糖苷酶时可大大提高酶的负载量
包埋法
网格型 微囊型
物 理 吸 附 法
离 子 结 合 法
共 价 结 合 法
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载体结合法
1
2
3
共价结合法
离子结合法
物理吸附法
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物理吸附法
• 通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用， 通过氢键、疏水作用和 电子亲和力等物理作用， 电子亲和力等物理作用 氢键 将酶固定于水不溶载体上． 将酶固定于水不溶载体上．从而制成固定化酶 • 常用载体： 常用载体： 无机载体：活性炭，多孔玻璃，氧化铝， 无机载体：活性炭，多孔玻璃，氧化铝，硅胶等 天然高分子载体：淀粉， 天然高分子载体：淀粉，谷蛋白等 优点：操作简单，条件温和， 优点：操作简单，条件温和，不 会引起酶变性失活，载体廉价易得， 会引起酶变性失活，载体廉价易得， 可反复使用 缺点：物理吸附结合能力弱， 缺点：物理吸附结合能力弱，酶 与载体结合不牢固易脱落
1971年 1971年，第一次国际酶工程会议在美国召 开，会议主题是固定化酶的研制和应用
确定固定化酶（Immobilized Enzyme）统一名称 确定固定化酶（ Enzyme）
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酶工程及固定化技术发展史
• 1973年，日本首次在工业上固定化大肠杆菌菌体中天门冬 1973年 氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L 氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸 固定化死菌体 • 1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精 1976年 固定化细胞 • 1979年固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功 1979年固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功 固定化植物细胞 • 1982年日本固定化黄色短杆菌原生质体生产谷氨酸 1982年日本固定化黄色短杆菌原生质体生产谷氨酸 固定化原生质体
3
4
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固定化酶的缺点
酶固定化时酶的 活力有所损失.
增加了固定化的成本， 增加了固定化的成本，使 工厂开始投资大
只能用于可溶性的底物和小 分子底物， 分子底物，对大分子底物不 适宜
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酶的固定化方法
酶的固定方法
载体结合法
交联法
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固定化酶
• 固定化酶(Immobilized Enzyme）：通过物 固定化酶( ）：通过物 ）： 理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载 束缚于水不溶的 理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载 或将酶束缚在一定的空间内， 体上，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶 分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作 分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作 用 水溶性酶 水不容性的载体
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酶工程及固定化技术发展史
在20世纪20年代，就出现了酶工程，以自然酶制 20世纪20年代，就出现了酶工程， 世纪20年代 酶工程 剂在工业上大规模应用的特征， 剂在工业上大规模应用的特征，原料以动植物为主
1953年 1953年，Grubhoger Schleith 用重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂 对羧肽酶、蛋白酶、核酸酶等进行固定，产生了固定化酶技术 固定化酶技术。 对羧肽酶、蛋白酶、核酸酶等进行固定，产生了固定化酶技术。
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固定化酶及在医药中的应用
Contents
1 2 3 4
酶工程及固定化技术发展史
酶的固定化方法
应用
展望
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酶工程简介
酶工程是酶学和工程学相 酶工程是酶学和工程学相 互渗透发展而成的一门新的技 术科学。 术科学。它是从应用的目的出 研究酶，应用酶的特异性、 发，研究酶，应用酶的特异性、 催化功能，并通过工程化 工程化将相 催化功能，并通过工程化将相 应的原料转化成有用物质的技 术
固定化酶医药上的应用
• 1. 固定化酶在氨基酸生产上的应用
反应 DL-氨基酸 → D-氨基酸 + L-氨 基酸 苯酚 + 丙酮酸 + NH3 → L-酪氨 酸 吲哚 + 丙酮酸 + 醋酸铵 → 色 氨酸 DL-苯乙内酰脲 → D-苯甘氨酸 DL-5-对羟基苯乙内酰脲 → D-对 羟基苯甘氨酸 酶 氨基酰化酶 -酪氨酸酶 色氨酸酶 乙内酰脲酶 乙内酰脲酶
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共价结合法
• 是酶以共价键结合于载体上的固定化方法 是酶以共价键 共价键结合于载体上的固定化方法 • 常用载体： 常用载体：
天然有机载体：多糖、蛋白质、 天然有机载体：多糖、蛋白质、细胞等 无机物：玻璃、 无机物：玻璃、陶瓷等 合成聚合物：聚酯、聚胺、 合成聚合物：聚酯、聚胺、尼龙等 • 优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，酶不易 优点：酶与载体结合牢固，稳定性好， 脱落 • 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，可能会破坏 缺点：反应条件苛刻，操作复杂， 酶的活性中心
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交联法
• 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用， 双功能试剂使酶分子之间发生交联作用 成网状结构 • 特点：此法与共价结合法一样也是利用共价键固 特点： 定酶的， 定酶的，所不同的是不使用载体 • 常用交联剂：戊二醛、己二胺、双偶氮苯等 常用交联剂：戊二醛、己二胺、
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固定化酶及其相应产品
固定化酶 青霉素酰化酶 氨苄青霉素酰化酶 青霉素合成酶 5'-磷酸二酯酶 类固醇酯酶 多核苷酸磷酸化酶 前列腺素合成酶 辅酶A合成酶系 氨甲酰磷酸激酶 产品 6-APA,7-ADCA 氨苄青霉素酰胺 青霉素 5'-核苷酸 睾丸激素 多聚核苷酸 前列腺素 CoA ATP 固定化酶 短杆菌肽合成酶系 右旋糖酐蔗糖酶 天冬氨酸酶 色氨酸合成酶 转氨酶 腺苷脱氢酶 延胡索酸酶 酵母酶系 3'-核糖核酸酶 产品 短杆菌肽 右旋糖酐 L-天冬氨酸 L-色氨酸 L-苯丙氨酸 IMP L-苹果酸 ATP,FDP,间羟胺 3'-核苷酸
优点：结合牢固，可以长时间使用 优点：结合牢固， 缺点：因交联反应激烈， 缺点：因交联反应激烈，酶分子多 个基团被交联，酶活损失大， 个基团被交联，酶活损失大，颗粒 较小， 较小，使用不便
酶
双功 能剂
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包埋法
• 聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进 聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进 包括交联剂)的作用进行聚合 包括交联剂 的作用进行聚合， 剂(包括交联剂 的作用进行聚合，酶被包埋在聚合 物中以达到固定化 • 分类：网格型（凝胶包埋法）；微囊型（微囊化 分类：网格型（凝胶包埋法）；微囊型（ ）；微囊型 法）
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常用的酶固定化载体
•
物理吸附 活性炭 氧化铝 碳酸钙 胶棉 阳离子交换树脂 多孔玻璃 矾土 二氧化硅 淀粉 明胶 阴离子交换树脂
吸附法
包埋法
离子吸附 羟甲基纤维素 DEAE-纤维素 TEAT-纤维素 卡拉胶 海藻胶 硅胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂 聚乙烯醇
共价结合法
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酶工程及固定化技术发展史
1969年 1969年，千田一郎等用固定化氨基酰化 酶技术拆分了DL 氨基酸，生产L 氨基酸， DL酶技术拆分了DL-氨基酸，生产L-氨基酸， 随后固定化天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸 随后固定化天冬氨酸酶生产L 开创了固定化酶应用的局面 固定化酶应用的局面。 等，开创了固定化酶应用的局面。
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离子结合法
• 利用含有离子交换基团的固相载体与酶蛋白分子 利用含有离子交换基团的固相载体与酶蛋白分子 离子交换基团 带电基团互相吸引 靠离子链） 互相吸引（ 的带电基团互相吸引（靠离子链）而形成络合物 • 载体：多糖类离子交换剂、合成高分子交换树脂 载体：多糖类离子交换剂、 纤维素， 如DEAE-纤维素，IR-45等 纤维素 等 • 优点：操作简单，处理条件温和，能得到酶活回 优点：操作简单，处理条件温和， 收率较高的固定化酶 • 缺点：载体和酶的结合力较弱，离子键结合较松 缺点：载体和酶的结合力较弱， 易受缓冲液种类或pH的影响 的影响， 散，易受缓冲液种类或 的影响，
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新型载体
磁性体Fe3O4与聚苯乙烯、含醛基聚合 物一起溶解混合后，再除去溶剂可获得 磁性载体
磁性载体 导电聚合物
新型 载体
光敏性基团的载体 温敏载体
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应用
医药
食品工业 环境保护
生物传感器
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固定化技术
固定化酶
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固定化酶制备原则
（1）维持酶的催化活性及专一性 （2）有利于生产自动化、连续化 有利于生产自动化、 （3）应有最小的空间位阻 （4）酶与载体必须结合牢固 （5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或 反 应有最大稳定性，载体不与废物、 应液发生化学反应 （6）成本要低
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展望
• 酶固定化技术已在食品工业、精细化学品工 业、医药，尤其是手性化合物等行业得到广 泛应用，在废水处理方面也取得了一定进展 • 固定化酶技术目前还存在固定效率低、载体 的有毒性、成本高、稳定性差、不能大规模 生产等问题 • 如何充分利用天然高分子载体对其改性，或 利用超临界技术、纳米技术、膜技术等来固 定酶，必定会成为研究的热点
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固定化酶医药上的应用 • 2. 用大孔径N-聚氨乙基丙烯酰胺为载 体，将前列腺素合成酶固定化，合成前 列腺素衍生物E1 • 3.将葡聚糖磁性毫微粒固定化L-天冬酰 胺酶，通过血液注射治疗急性淋巴白血 病 • 4.琼脂糖固定化牛胰核糖核酸酶能很好 地催化合成重要的寡核苷酸
纤维素 Sephadex A 200 琼脂 对氨基苯纤维素 聚丙烯酰胺 尼龙 多孔玻璃珠
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传统载体材料的改性
• 载体材料的性能直接影响其固定化酶的催化 活性 • 理想的载体材料应具备良好的机械强度、热 稳定性、化学稳定性、耐生物降解性及对酶 的高度亲和性，并能保持较高的酶活性等 • 传统的无机载体材料一般是借助吸附方法来 制备固定化酶，或经小分子化学改性以共价 键合方式制备固定化酶
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固定化酶的优点
长时间使用， 长时间使用， 在绝大多数情 况下提高了酶 的稳定性， 的稳定性，有 利用工艺的连 续化和管道化 续化和管道化
1
2
极易将固定化 酶与底物、 酶与底物、产 物分开
优点
酶反应过程可以 严格控制， 严格控制，有利 于工艺自动化和 微电脑化 酶的使用效率 提高， 提高，适合于 多酶反应
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传统无机载体存在问题
结构不易调控
传质差
键合酶的能力差
利用组成和结构 可调控的有机聚 合物对传统无机 载体材料改性修 饰，制备兼具两 者优良特性的复 合载体
如用右旋糖苷对硅胶表面改性修饰可改善其表面的生物亲和性， 如用右旋糖苷对硅胶表面改性修饰可改善其表面的生物亲和性， 用于固定葡萄糖苷酶时可大大提高酶的负载量
包埋法
网格型 微囊型
物 理 吸 附 法
离 子 结 合 法
共 价 结 合 法
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载体结合法
1
2
3
共价结合法
离子结合法
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物理吸附法
• 通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用， 通过氢键、疏水作用和 电子亲和力等物理作用， 电子亲和力等物理作用 氢键 将酶固定于水不溶载体上． 将酶固定于水不溶载体上．从而制成固定化酶 • 常用载体： 常用载体： 无机载体：活性炭，多孔玻璃，氧化铝， 无机载体：活性炭，多孔玻璃，氧化铝，硅胶等 天然高分子载体：淀粉， 天然高分子载体：淀粉，谷蛋白等 优点：操作简单，条件温和， 优点：操作简单，条件温和，不 会引起酶变性失活，载体廉价易得， 会引起酶变性失活，载体廉价易得， 可反复使用 缺点：物理吸附结合能力弱， 缺点：物理吸附结合能力弱，酶 与载体结合不牢固易脱落
1971年 1971年，第一次国际酶工程会议在美国召 开，会议主题是固定化酶的研制和应用
确定固定化酶（Immobilized Enzyme）统一名称 确定固定化酶（ Enzyme）
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酶工程及固定化技术发展史
• 1973年，日本首次在工业上固定化大肠杆菌菌体中天门冬 1973年 氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L 氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸 固定化死菌体 • 1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精 1976年 固定化细胞 • 1979年固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功 1979年固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功 固定化植物细胞 • 1982年日本固定化黄色短杆菌原生质体生产谷氨酸 1982年日本固定化黄色短杆菌原生质体生产谷氨酸 固定化原生质体
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固定化酶的缺点
酶固定化时酶的 活力有所损失.
增加了固定化的成本， 增加了固定化的成本，使 工厂开始投资大
只能用于可溶性的底物和小 分子底物， 分子底物，对大分子底物不 适宜
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酶的固定化方法
酶的固定方法
载体结合法
交联法
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固定化酶
• 固定化酶(Immobilized Enzyme）：通过物 固定化酶( ）：通过物 ）： 理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载 束缚于水不溶的 理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载 或将酶束缚在一定的空间内， 体上，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶 分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作 分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作 用 水溶性酶 水不容性的载体