实验四 土壤微生物的分离、纯化及无菌操作
土壤细菌的分离及纯化(1)
土壤细菌的分离及纯化(1)土壤中存在着丰富的微生物群落，其中细菌是占主导地位的一类微生物。
分离和纯化这些细菌有助于深入了解它们的特性并有利于相关应用的开发。
下文将从分离和纯化的流程、常用方法以及注意事项等方面进行详细阐述。
一、分离和纯化细菌的流程1. 采集土样首先，需要采集土样，并将其认真分层剖析，取相对均匀的土样。
避免受到环境中其他微生物的干扰，有时要在合适的温度、溶液中将其处理，以杀死其他未被分离出的细菌，确保最终分离到的细菌属于所期望的种类。
2. 筛选方法可以通过筛选的方式来分离目标细菌。
在将土样处理后，可以将土壤中的颗粒筛选出来，将其悬浮于适宜的培养基中。
通过培养基选择，可以筛选出自然界中对常规培养基营养要求不高的菌株。
3. 纯化法基于筛选法筛选出的细菌群，要进一步分离单菌株。
这时候，可以通过分泌落细菌的方式进行分离。
分泌落法是在无菌条件下，用匀染映到平板上，供菌落生长孵育，培养出纯净菌株。
二、常用分离和纯化方法1. 发酵罐法发酵罐法是在无菌环境下，将土壤样本与特定的培养基混合，形成发酵液，供细菌发酵并产生代谢产物。
根据代谢产物对目标微生物的要求特点，可以从代谢产物中充分筛选出目标菌株并进行单克隆的分离培养。
2. 过滤法将土样过滤后，混合在无固定菌相的培养基中，通过筛选培养环境中的单菌孵育，纯化出其中的某一菌株。
3. 土盘法所收集的土样经过处理后，均匀地坚着到培养皿的表面。
将培养皿置于恰当的条件下，等待细菌的生长，进行单克隆的分离。
三、注意事项1. 待分离土样尽量温和，避免对土壤环境造成较大影响，减少细菌数量的变化。
2. 培养到疑似有目标菌株生长为止，这就需要经验较丰富的实验人员进行分离纯化操作。
3. 需要从其他细菌中筛选出目标菌株，可以加入抗生素等各种筛选方法。
总之，提高细菌的分离和纯化技术，是深入探索土壤生物多样性、探索新型约束细菌等领域的很重要的手段。
微生物的分离纯化实验报告
微生物的分离纯化实验报告微生物的分离纯化实验报告引言：微生物是一类极小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等。
它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、空气中，对生态系统的平衡和物质循环起着重要作用。
微生物的分离纯化是微生物学研究的基础，通过分离纯化可以获得单一的微生物菌株，为后续的鉴定、培养和利用提供基础数据。
本实验旨在通过分离纯化微生物的方法，获得纯净的微生物菌株。
材料与方法：1. 实验材料：含有微生物的样品（如土壤、水样等）、琼脂平板培养基、无菌培养皿、无菌移液管、无菌匙、无菌培养管等。
2. 实验步骤：a. 取适量样品，加入适量的无菌生理盐水中，充分搅拌均匀。
b. 取一定体积的悬浮液，分别在琼脂平板上均匀涂布，避免重复涂布。
c. 将涂布好的琼脂平板培养基放置于恒温培养箱中，以适当温度孵育。
d. 孵育一段时间后，观察平板上的菌落情况，选择形态独特的单个菌落。
e. 用无菌匙将选中的菌落划取至无菌培养管中，加入适量的无菌生理盐水。
f. 将培养管中的菌液进行摇匀，称取一定体积的菌液，分别在琼脂平板上均匀涂布。
g. 重复以上步骤，直至获得纯净的微生物菌株。
结果与讨论：通过实验，我们成功地从样品中分离纯化了多个微生物菌株。
在观察菌落形态时，我们发现不同微生物菌株的菌落形态各异，有的呈圆形，有的呈不规则形状，有的呈乳白色，有的呈黄色等。
这些观察结果表明不同的微生物菌株具有不同的生长特性和代谢方式。
在分离纯化的过程中，我们注意到有些菌落会在培养基上形成菌落周围的透明区域，这是由于菌落分泌的溶解酶作用于琼脂平板中的胶原蛋白，导致胶原蛋白溶解而形成的。
这种现象被称为溶解圈，是一种常见的微生物特征，有助于鉴定微生物的溶解能力。
在实验过程中，我们还遇到了一些困难和挑战。
首先，样品中可能存在多种微生物，通过分离纯化的过程中需要进行多次的涂布和筛选，才能获得纯净的菌株。
其次，在涂布过程中需要注意避免交叉污染，以免影响结果的准确性。
实验四 土壤微生物的分离和计数
牛肉膏蛋白胨培养基； 高氏1号培养基； 马铃薯葡萄糖培养基（添加有抗生素）；
灭菌水、移液器、吸头、接种针、涂布器、灭 菌离心管、消毒酒精、试管架、记号笔、吸水 纸、酒精灯、平皿、漩涡振荡器、天平等。
实验内容
土壤微生物的分离和纯化 系列稀释法 划线法（讲解） 分离微生物的形态观察 （3天后） 细菌 放线菌 真菌
记录系列稀释法分离土壤微生物的结果：
真菌菌落的种类和数量，菌落特征描述； 细菌菌落的种类和数量，菌落特征描述； 放线菌菌落的种类和数量，菌落特征描述；
通过试验和查阅资料，独立完成思考题。 实验中出现问题的分析和讨论。
3天后观察记录分离试验结果，上交实验报告。
思考题：
在分离真菌时，有哪些方法可以避免或减少 细菌的污染？
称取土壤样品0.5~1.0 g加入含30ml灭菌水的塑料离心管 中振荡3～5分钟（旋涡振荡器），形成土壤悬浊液； 取0.1ml加入装有0.9ml灭菌水试管中，振荡均匀。依次稀 释，共5次。 细菌的分离：取第3，4，5 ，6四个稀释水平的样品分别 取0.1ml，均匀涂布在牛肉膏蛋白胨培养平板上； 放线菌的分离：取第1，2，3 ，4四个稀释水平的样品分 别取0.1ml，均匀涂布在高氏1号培养基； 真菌的分离：取第2，3，4 ，5四个稀释水平的样品分别 取0.1ml，均匀涂布在含抗生素的PDA平板上； 菌液被培养基吸收后，反转放置，做好标记，28℃培养。
细菌菌落的共同特征
湿润 粘稠 质地均匀 较透明 易挑取（与培养基结合不紧密） 菌落正、反面、边缘、中心颜色一致
注意事项：
土壤中微生物实验报告
一、实验目的1. 了解土壤中微生物的种类和数量；2. 掌握土壤微生物的分离和纯化方法；3. 熟悉微生物的形态和生理生化特性；4. 培养无菌操作和实验记录能力。
二、实验原理土壤是微生物生活的良好环境，其中含有大量微生物，包括细菌、放线菌、真菌、藻类、原生动物、噬菌体、病毒和线虫等。
微生物在土壤中发挥着重要作用，如土壤肥力的维持、植物生长的促进、有机物的分解等。
本实验通过分离和纯化土壤微生物，观察其形态和生理生化特性，进一步了解土壤微生物的种类和功能。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖、酵母提取物、琼脂、无菌水、无菌平板、无菌移液器、显微镜、培养箱等。
2. 实验仪器：天平、酒精灯、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、无菌操作台等。
四、实验方法1. 土壤样品的采集：选取有代表性的土壤样品，注意样品的均匀性和代表性。
2. 土壤微生物的分离和纯化：a. 制备牛肉膏蛋白胨培养基，高压蒸汽灭菌后备用；b. 将土壤样品与无菌水按1:10的比例混合，充分搅拌；c. 将混合液进行系列稀释，取适量稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上；d. 将平板倒置放入恒温培养箱中培养，观察菌落生长情况；e. 挑取单个菌落进行纯化，重复以上步骤，直至获得纯菌株。
3. 微生物的形态观察：a. 将纯菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基，培养后进行显微镜观察；b. 观察菌体的形态、大小、排列方式等特征。
4. 微生物的生理生化特性测定：a. 对纯菌株进行革兰氏染色，观察菌体的染色特性；b. 进行糖发酵试验，观察菌株对葡萄糖、乳糖、麦芽糖等糖类的分解能力；c. 进行氧化酶试验，观察菌株的氧化酶活性。
五、实验结果与分析1. 土壤样品的微生物数量：通过平板计数法，估算土壤样品中的微生物数量。
2. 微生物的分离和纯化：成功分离和纯化出多种微生物，如细菌、放线菌、真菌等。
3. 微生物的形态观察：观察到的菌体形态、大小、排列方式等特征与文献报道相符。
土壤微生物的分离和纯化实验
实验八土壤微生物的分离和纯化一、目的1．了解从土壤中分离与纯化微生物的基本原理及方法。
2．掌握几种常用的分离的基本操作技术。
二、原理在自然界中，土壤是微生物生活中的最适宜的环境，土壤中存在大量的微生物，但土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，因此，为了研究某一微生物的特性，或者要大量地培养和利用某种微生物，必须把它们从这些混杂的微生物群中分离出来。
从而获得某一菌株的纯培养。
这种获得纯培养的方法称之为微生物的分离和纯化三、器材1．牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏l号培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基。
2．盛有100毫升无菌水的三角瓶，9毫升无菌水的试管，无菌吸管，无菌玻璃涂抹棒，10％的酚液，25％的乳酸，土样，接种环，标签。
四、方法(一)涂抹平板分离法1．制备土壤稀释液称取土样10克，放入装有玻璃珠和100毫升无菌水的三角瓶中，振摇15—20分钟，使土与水充分混合，将菌分散，静止片刻，用吸管从中吸取1毫升土壤悬液注人盛有9毫升无菌水试管中，吹吸三次，并振摇使之充分混匀，然后再吸取1毫升注入另一支盛有9毫升无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、l0-3、10-4、l0-5……的各种稀释度的土壤悬液。
2．倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，马铃薯蔗糖培养基溶化。
待冷至50—60℃时，在高氏l号培养基中加入10％酚2滴，在马铃薯蔗糖培养基中加入25％乳酸2滴，然后分别倒平板，每支培养基倒一皿(用右手持盛培养基的试管，左手拨出棉花塞，试管口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿在火焰附近打开少许，迅速注入培养基，加盖后轻轻摇动培养皿使培养基均匀分布，平放在桌面上，待凝后即成平板。
(见图18)。
3．涂抹将上述每种培养基平板标上10-3、10-4、10-5稀释度，然后用无菌吸管分别从10-5、10-4、10-3稀释度的试管中吸取土壤悬液，每一平板注入0.2毫升，再用灭菌玻璃涂抹刮棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，静止5分钟。
【精品】实验四 土壤微生物的分离和计数
【精品】实验四土壤微生物的分离和计数实验目的：1.掌握土壤微生物的分离方法。
2.利用平板计数法和涂布法等方法进行土壤微生物的计数。
实验原理：1.微生物分离法微生物分离法是将微生物从混合物或样品中分离出来的方法，是微生物学中最常用的一种基本方法。
常用的方法有稀释平板法、涂布法等。
2.平板计数法平板计数法又称菌落计数法，是通过数目测定评估微生物数量的方法。
通常在固体培养基上用微生物悬液接种，培养出菌落，以评估菌群密度。
计算微生物数量时应选择符合菌落特征的一个菌落，如颜色、密度、大小等，并使用总体积、稀释因子及加样体积计算。
3.涂布法涂布法又称涂布分离法，是一种快速、容易、简单、实用的微生物分离和计数方法。
方法是取少量样品加入到无菌的琼脂培养基中，将琼脂培养基均匀地涂布在培养皿中，然后在恰当的温度下和时间内使菌落正常增殖及显像，最后计算菌落单位体积的数量。
实验材料和设备：1.土壤样品；化学试剂：蒸馏水、1%碳酸氢钠溶液、1%双氧水溶液、1.5%琼脂等。
2.培养皿；吸管；移液管；吸胶头；灭菌器；微量注射器等。
实验步骤：1.准备样品：取土壤样品，干燥，粉碎，筛选出粒径较小的部分备用。
2.制备0.1g/ml的悬液：取粉碎好的土壤样品0.1克，加入到10ml的蒸馏水中，用吸管吸取混合后的液体，摇匀后待沉淀，取稠泥状上清液，稀释成0.1g/ml的土壤悬液。
3.平板法计数：取一定体积的土壤悬液接种在称量好的琼脂平板上，进行涂布，涂布均匀后，放置在恰当的温度下，培养约24小时，以单个菌落的数量（单位：cfu/ml）计数，并使用公式计算微生物数量。
4.涂布法计数：用吸管吸取一定体积的土壤悬浊液，加入到10ml的液体琼脂培养基中，均匀地涂布在培养皿中，在适当的温度下和时间内使菌落正常增殖及显像，然后计算菌落单位体积的数量。
实验记录和数据处理：1.记录实验过程、结果和分析。
2.计算平板菌落数量和涂布法菌落数量。
3.对实验结果进行分析比较，得出结论。
土壤中细菌总数的测定实验
1 / 6实验四细菌总数的测定——纯种分离一、目的1.掌握从环境（土壤和活性污泥等）微生物群体中获得纯种微生物的分离和培养技术。
2.掌握无菌操作技术。
二、材料和器皿1.扭力天平、取土样工具、涂布棒(接种棒)。
2.无菌三角瓶、试管、培养皿、移液管、玻璃珠。
3.无菌水。
4.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。
三、实验操作步骤1、取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
盛土的容器应是无菌的。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。
土样取回后应尽快投入实验，同时取10- 15g，称重后经105oC烘干8h，置于干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。
2、倒平板2 / 6熔化已灭菌的上述4种培养基并冷却至45oC左右倒平板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。
3、编号取5支无菌空试管（15×150mm）依次编号为10- 3、10- 4、10- 5、10- 6、10-7。
4、分装无菌水按无菌操作用5mL移液管分别吸取4.5mL无菌水于编号的各无菌空试管中。
5.制备土壤稀释液称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液。
用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次、摇匀，此即为10-3浓度。
同样方法，依次稀释到10-7。
稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。
环境要求：琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。
3 / 6代表性：取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。
减少误差：每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。
6、培养及计数培养条件：倒置于36±1℃xx箱内培养48±2h 计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。
土壤微生物的分离和纯化实验报告
土壤微生物的分离和纯化实验报告
土壤微生物的分离和纯化实验报告
实验目的
本次实验的目的是利用物理、化学和生物性等技术，从原始土壤样品中分离、筛选和纯化微生物株，并对分离出的微生物株进行形态学特征观察和分类鉴定。
实验材料
1. 原始土壤样品
2. 饱和淡盐水
3. 10% (v/v) 的平衡磷酸盐溶液
4. 0.85% (w/v) 的千顷盐溶液
5. 2% (w/v) 的体糖酸钠溶液
6. 氯仿
7. 板藻素
8. 无菌玻璃管
实验步骤
1. 将原始土壤样哮放入摇瓶内，加入淡盐水攪拌均匀，进行粗筛提取。
2. 将1ml混合液放入无菌玻璃管，8次补充磷酸盐溶液悬浮液进行细筛提取。
3. 将细筛提取的悬浮液转移到新的无菌容器中，加入盐溶液攪拌均匀。
4. 加入盐溶液之后，用氯仿消毒，然后加入体糖酸钠溶液留取微生物株悬浮液。
5. 使用板藻素进行单菌株筛选，筛选出单菌株。
6. 将筛选出的单菌株进行形态学特征观察和分类鉴定。
结果
本次实验中，经过物理、化学和生物性等技术操作，成功分离出一株微生物株，并对其进行形态学特征观察和分类鉴定，得出结果：该株微生物属于假单胞菌科，耐盐性，呈菌封形态。
结论
本次实验成功分离纯化出一株微生物株，该株微生物属于假单胞菌科，耐盐性，呈菌封形态。
土壤中微生物的分离与纯化实验报告
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以下是一篇关于土壤中微生物分离与纯化实验报告的示例文章，按照清晰的标题和不同级别的小节编写：实验报告：土壤中微生物的分离与纯化。
土壤中微生物的分离与鉴定实验报告
Sdu微生物大实验土壤微生物的分离纯化与鉴定【实验目的】1、从各地区土壤中筛选含几丁质酶的真菌及含果胶酶的菌株；2、通过从土壤中分离纯化菌株，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的筛选、分离纯化方法和无菌操作技术。
3、复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。
4、掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。
【实验原理】1、微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
此次实验采取平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：a.选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。
b.微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。
微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。
前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。
2、霉菌：霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。
霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。
霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 3-10μm ），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。
观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法，本实验采用载玻片培养观察法。
3、果胶酶筛选培养基：配制以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用果胶的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。
刚果红（Congo Red,简称CR）是一种染料，它可与果胶形成红色复合物，但并不和果胶水解后的产物发生这种显色反应，在含有果胶的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的果胶形成红色复合物。
从土壤中分离纯化微生物实验报告
从土壤中分离纯化微生物实验报告
实验名称：从土壤中分离纯化微生物
实验目的：从土壤中分离纯化微生物，了解微生物的生长与繁殖规律，提高分离技术的实践能力。
实验步骤：
1. 采集土壤样品，从不同深度、不同地点取样，放入消毒过的容器中，避免污染。
2. 准备好细菌培养基，如Luria-Bertani（LB）培养基、营养琼脂培养基等。
3. 取少量土样，加入LB培养基中，振荡混合，放入42℃的恒温培养箱中培养。
4. 24小时后，观察培养基上是否有生长菌落，若有，则取一部分菌落接种到新的LB培养基上再次培养。
5. 重复以上步骤，直至获得单个菌种菌落。
用无菌线圈挑取单一菌落，接种到新的培养基上，进行进一步鉴定。
实验结果：从土壤样品中获得多种不同形态和颜色的微生物。
通过分离和纯化，最终得到单一微生物菌落。
实验结论：从土壤样品中分离纯化微生物能够获得纯净的菌落，为进一步鉴定和研究微生物提供了基础。
同时，这也证明了分离技术在微生物研究中的重要性和必要性。
土壤分离微生物实验报告
土壤分离微生物实验报告土壤分离微生物实验报告一、引言土壤是地球上最为丰富的自然资源之一，其中存在着丰富的微生物群落。
这些微生物在土壤生态系统中发挥着重要的作用，包括有机质分解、养分循环、植物生长促进等。
本实验旨在通过分离土壤中的微生物，了解土壤微生物的多样性和功能。
二、实验方法1. 样品采集在实验开始前，我们选择了三个不同的土壤样品，分别来自农田、森林和草地。
使用无菌勺子将土壤样品采集到无菌离心管中，并尽量避免与外界环境接触。
2. 稀释与涂布将采集到的土壤样品分别加入无菌的盐水中进行稀释，制备出一系列不同浓度的土壤悬浮液。
然后，将这些悬浮液均匀涂布在含有富营养培养基的琼脂平板上。
3. 培养与分离将涂布好的琼脂平板置于恒温培养箱中，在适宜的温度下培养一段时间。
待菌落形成后，使用无菌勺子将单个菌落分离到含有富营养培养基的琼脂管中，形成单菌株。
4. 鉴定与保存对于分离得到的单菌株，我们进行了形态学观察、生理生化特性测试以及16S rRNA基因测序等鉴定工作。
同时，我们将这些单菌株保存在低温条件下，以备后续的实验研究。
三、实验结果通过上述实验方法，我们成功分离出了大量的土壤微生物。
经过鉴定和分类，我们发现这些微生物主要包括细菌、放线菌和真菌等不同类群。
其中，细菌是数量最多的一类，占据了总菌落数的70%以上。
进一步的研究表明，这些细菌在形态、生理和生化特性上存在较大的差异。
有些细菌形成了光滑的菌落，而另一些则呈现出粗糙的表面。
此外，它们对不同的碳源和氮源的利用能力也有所差异，表明这些微生物在土壤中具有不同的功能和代谢特性。
四、讨论与分析土壤微生物的多样性和功能对土壤生态系统的稳定性和健康发展起着至关重要的作用。
通过本实验的分离与鉴定工作，我们初步了解了土壤微生物的多样性，并发现了它们的形态、生理和生化特性的差异。
这为进一步研究土壤微生物的生态功能提供了基础。
然而，本实验仅仅是初步的分离与鉴定工作，还需要进一步的研究来揭示土壤微生物的生态功能。
微生物的分离与纯化- 从土壤中分离纯化微生物
1)超净工作台、恒温培养箱、酒精灯 2）1000ul及100ul移液枪、1000ul及100ul枪头、无菌
1.5ml的离心管、离心管架 3）无菌平皿、涂布棒、接种环 实验试剂:无菌水;
实验内容
1、采土样:
选择肥沃土壤,去表层土,挖5－20cm深度的土壤数10g, 装入已灭菌的牛皮纸袋,封好袋口,带回实验室。
所有菌落数均不在30~300间 以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数
6、挑菌划线分离
挑取单个菌落（细菌菌落），分别在平板上做分区和 连续划线。
370C培养48h检查菌落是否单纯。
划线方法：详见实验指导书P72、P237
无菌操作（ 近火焰处操作）： 接种环 Nhomakorabea烧灭菌、冷却
微生物的分离与纯化技术的应用：分离具有特殊功能的微生物、优良菌 种及纯化被污染的菌种等。
土壤是微生物的大本营，混杂着大量的微生物，从中分离可得到只含有 这一种微生物的纯培养。
稀释分离法有倾注法和涂布法两种；菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬 液常用划线法进行纯种分离。
要获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适 培养基及培养条件。
微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间详见实验指导书P67 表格。细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，在30-37℃ 温度下培养1-2天。
平板菌落计数——活菌计数
0.1ml
0.1ml
0.1ml
0.1ml
00..11ml
0.1ml
0.1ml
0.1ml
0.9ml
0.9
分离纯化 基本流程
环境微生物学-实验四(五) 细菌的纯培养、分离
实验四（五）环境中微生物分离与培养一、实验目的1、掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾堆肥等）中分离培养细菌的方法，获得若干种细菌纯种培养技能。
2、掌握几种接种技术。
3、了解菌种的保藏方法。
二、实验仪器和材料恒温箱、涂布器、细铁丝、接种环、酒精灯、吸耳球、棉花、记号笔；无菌培养皿（直径90毫米）、无菌移液管（1毫升和10毫升）；肉汤蛋白胨培养基、高氏１号培养基、马铃薯培养基；活性污泥或土壤10克、无菌水90毫升、9毫升无菌水（试管中）；酵母、大肠杆菌。
三、细菌纯种分离的操作方法细菌纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法。
（一）稀释平板分离的方法1、取样用无菌锥形瓶到现场取一定数量的活性污泥或土壤，迅速带回实验室。
2、稀释水样将1瓶90毫升和5管9毫升的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10- 4、10-5、10-6依次编号。
在无菌操作条件下，将样品（10克）置于第一瓶90毫升无菌水中，用手摇10分钟，将颗粒状样品打散，即为10-1浓度的菌液。
用1毫升无菌移液管吸取1毫升10-1浓度的菌液于一管9毫微升无菌水中，同样方法，依次稀释到10-6。
每次稀释时，需用不同的无菌移液管，或将同一移液管用无菌水洗三次。
3、平板的制作取10套无菌培养皿编号，10-4、10-5、10-6各3个，另1个为空气对照。
取1支1毫升无菌移液管从浓度小的10-6菌液开始，以10-6、10-5、10-4为序分别吸取0.5毫升菌液于相应编号的培养皿内（注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀），加热熔化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30℃恒温箱中培养48小时，然后观察结果。
取对照无菌培养皿，打开皿盖10分钟后盖上皿盖，倒置30℃恒温箱中培养48小时后，观察结果。
土壤的稀释分离、纯化微生物及无菌操作技术
实验3 土壤的稀释分离、纯化微生物及无菌操作技术一、实验目的和内容目的：学习从土壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术。
内容：l．用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌。
2．用平板划线方法分离微生物。
3．学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。
二、实验材料和用具金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和普通变形菌(Proteus vulgaris)斜面菌种。
已灭菌的牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基各1瓶，49.5mL无菌水(带玻璃珠)1瓶，4.5mL无菌水6管，80%乳酸，10%酚液，95%乙醇。
无菌培养皿12套，1mL无菌移液管10支，土壤样品及天平、称量纸、药勺、试管架、玻璃铅笔、橡皮头(用75%乙醇浸泡)、玻璃刮。
三、操作步骤(一)土壤稀释分离1．取土壤取表层以下5—10cm处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。
2．制备稀释液(要无菌操作)(1)制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的49.5mL无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡5～10min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。
(2)稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-8的稀释液(图3-1)。
注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。
]图3—1 稀释法分离土壤微生物操作过程图解3. 混菌法测定菌落数的方法(1)细菌：取10-7、10-6两管稀释液各1mL，分别接人相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。
然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底高1.5～2mm为宜)，迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。
倒平板时要注意无菌操作，见图3-2。
实验四 土壤微生物的分离与纯化
稀释涂板：新鲜土壤。 实验材料：新鲜土壤。 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏 一号培养基、马铃薯蔗糖培养基。 一号培养基、马铃薯蔗糖培养基。 实验仪器与用具 ∗ 无菌水：带有玻璃珠装有 无菌水：带有玻璃珠装有90ml无菌水三角瓶、 无菌水三角瓶、 无菌水三角瓶 装有9mL无菌水的试管。 无菌水的试管。 装有 无菌水的试管 ∗ 其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、 其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、 电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴等。 电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴等。
高氏一号培养基
∗ 用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方 用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。 如下： 如下： 20.0g 可溶性淀粉 ∗ KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4• 7H2O 0.5g ∗ NaCl 0.5g FeSO4• 7H2O 0.01g pH 7.4~7.6 20g 琼脂 1000mL 自来水 灭菌： 灭菌： 1.05kg/cm2 30min
制备无菌水
∗ 无菌水为下一次微生物分离实验中所需要的材 料。 ∗ 250mL三角烧瓶（装有玻璃珠），装自来水 三角烧瓶（ ），装自来水 三角烧瓶 装有玻璃珠）， 45mL，试管中装 自来水， ，试管中装9.0mL自来水，塞上棉塞，包 自来水 塞上棉塞， 灭菌备用。 扎、灭菌备用。
物品的准备
∗ 三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等的包扎准备。 三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等的包扎准备。
一实验目的土壤是微生物生活的大本营为了获得某种微生物的纯培养一般是根据该微生物对营养酸碱度氧等条件要求不同而供给它适宜的培养条件或加入某种抑制剂淘汰其他一些不需要的微生物再用各种方法分离纯化该微生物直至得到纯菌二实验原理稀释涂板法稀释混合平板法划线分离培养基
微生物的分离纯化实验报告
一、实验目的1. 理解微生物分离纯化的基本原理和方法。
2. 掌握倒平板、涂布平板等微生物接种技术。
3. 学习观察微生物的菌落形态特征，进行初步鉴定。
4. 培养无菌操作意识和实验室基本操作技能。
二、实验原理微生物的分离纯化是指从混杂的微生物群体中，分离出只含有一种或某一株微生物的过程。
实验中常用的分离纯化方法有稀释平板法、涂布平板法、划线分离法等。
通过在固体培养基上形成单菌落，可以实现对微生物的纯化。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂糖、无菌水、无菌棉签、无菌镊子、无菌培养皿、酒精灯、酒精棉球、显微镜等。
2. 仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、电子天平、无菌操作台等。
四、实验步骤1. 土壤样品的处理- 称取适量土壤样品，加入10倍体积的无菌水，充分振荡混匀。
- 以无菌操作，取1ml土壤悬液，加入9ml无菌水中，制成10^-1稀释液。
- 重复上述步骤，制成10^-2、10^-3等不同稀释度的土壤悬液。
2. 倒平板- 将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，待冷却至50-55℃时，倒入无菌培养皿中，使培养基厚度约为2-3mm。
- 待培养基凝固后，用无菌镊子取适量不同稀释度的土壤悬液，分别滴加到培养皿中。
- 将培养皿倒置，放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。
3. 涂布平板- 将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，待冷却至50-55℃时，倒入无菌培养皿中，使培养基厚度约为2-3mm。
- 待培养基凝固后，用无菌棉签蘸取适量土壤悬液，均匀涂布在培养皿表面。
- 将培养皿倒置，放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。
4. 划线分离- 将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，待冷却至50-55℃时，倒入无菌培养皿中，使培养基厚度约为2-3mm。
- 待培养基凝固后，用无菌接种针取适量土壤悬液，在培养皿表面进行划线分离。
- 将培养皿倒置，放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。
5. 菌落观察与鉴定- 观察不同平板上的菌落形态，记录菌落的颜色、大小、形状、边缘等特征。
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（3）首先将接种环伸入有菌试管，使接种环接触菌苔取少量菌，取出接种环，立即将管口通过火焰灭菌后将接种环伸入斜面管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上的蜿蜒涂布，或直接自斜面底部向上蜿蜒涂布。此步注意接种环不可碰试管壁和接种时不要划破培养基。
《微生物学实验指导》，主编黄秀梨等，高等教育出版社、2008年1月第二版
教学目的要求：
1、掌握从土壤中分离微生物的方法
2、掌握常用的分离纯化微生物的操作技术（划线分离法）
重点与难点：
重点：土壤微生物分离方法、划线分离纯化微生物操作技术
难点：划线分离法、无菌操作
教学方法（请打√选择）：
讲授法√讨论法□启发式□自学辅导法□练习法(习题或操作) √读书指导法□ＰＢＬ（以问题为中心的教学法）□其他□
在医学检验和研究中为什么要分离单个微生物？
二、实验用品
1、菌种：上次实验灭好菌的三种培养基：牛肉膏蛋白胨、高氏一号、马丁氏培养基。
3、仪器及用具：99ml无菌水（最好带玻璃珠）3瓶（视情况而定，土样有几种就用几瓶），每份土样对应有含9ml无菌水的试管6支，10%酚液，无菌培养皿，1ml无菌移液器，土样，天平，称量纸，钥匙，试管架，接种环（涂布器）。
2、制备土样稀释液
另留一管不稀释留作对照（CK）
3、培养基的准备
将前次实验灭好菌的培养皿培养基和试管斜面培养基放在无菌操作台上（或桌面上，放有酒精灯、酒精棉球等无菌操作器具）
4、分区划线法纯化
（1）用接种环从待纯化菌落或待分离斜面菌种沾取少量菌种，在相应培养基平板中按如下方法划线分离
平板划线分离，其划线方法有以下两种：
5、斜面接种
此法主要用于移种纯菌，使其增殖后用于鉴定或保存菌种。通常是从平板培养物上挑取某一单独菌落或者从一支已长好的斜面菌种，移种至斜面培养基上，接种步骤如下（以从已长好的斜面菌种转接为例）：
（1）左手拿两支试管，一支为经灭菌的斜面，另一支为已长好的菌种。右手持接种环或接种针通过火焰灭菌后俟冷，并同时以右手小指和无名指轻轻拔取两支试管的棉塞或试管帽（先转动棉塞后拔去），夹持于手指间。
（4）烧试管口，塞好棉塞或盖好试管帽，将接种环插到酒精瓶中。
6、培养：30℃，细菌1-2天、放线菌5-7天、霉菌3-5天。
五、注意事项
做完实验后，学生对自己操作进行总结，说出一些重点注意的关键步骤。老师最后总结。
六、实验结果分析
此列为提示栏（包括重点、难点、教学方法、教学手段、更新教学内容、教书育人等）
长沙医学院教案
课程名称
微生物学
授课题目（章节或主题）
实验三土壤微生物的分离、纯化及无菌操作技术
授课教师
黄秋霞
所属系（部）
基础医学系
所属教研室
生物教研室
职称
助教
授课时间
2011年10月24日第9周星期一第9-11节
授课时数
3学时
授课班级
生物技术专业（本科）2010级1班
教学课型
实验课
教材名称、作者、出版社及出版时间
复习举例
原理和方法等都要做重点讲解，要求学生掌握，加深学生对理论和实践的结合学习。
教师重点讲解并做示范
学生操作：
老师先用一个未灭菌的滤器做演示。
学生操作
每个学生做一个平板划线和接一个斜面菌种
时间分配
(分钟)
15
20
15
40
复习思考及作业题布置
思考题（见实验指导P7）
授课的创新点：
参考资料（包括辅助教材、参考书、文献等）：
教研室意见：
教研室主任签章：年 月 日
课后记（即通过收集教学督导专家、同行和学生的反馈信息，认真整理分析成功的经验和不足之处，在课程结束后填写）
生物技术专业实验课刚开始，很多材料、试剂不齐全，做得不是很到位，在讲解过程中也有很多遗漏之处，具体见记录本。力争在以后的实验课中逐步完善，得到质的提高。
三、实验原理
提问：我们这里链霉素应该用什么方法灭菌呢？
四、实验内容和方法
（一）内容：平板划线法分离土壤中的细菌、放线菌和霉菌
斜面接种
（二）方法
1、土壤样品采集
在待测田块上，若田块面积小于50平方米则按对角线三点采样，若田块面积大于50平方米按对角线五点采样。采样一般定点于耕作层0-20cm，先除去表土1-2cm，以无菌铲采土足量充分混匀后用无菌塑料袋分装。
教学手段（请打√选择）：
板书√实物√标本□挂图□模型□投影□幻灯□录像√ CAI（计算机辅助教学）□
教学过程设计和教学内容：
实验三土壤微生物的分离、纯化及无菌操作技术
一、实验目的
1、掌握从土壤中分离微生物的方法
2、掌握常用的分离纯化微生物的操作技术（划线分离法）
补充提问：复习一些关于微生物纯培养、分离技术概念。