雷公藤甲素

多种雷公藤甲素的递送系统已经开发出来，包括纳米粒子的聚合物胶束的[ 21 ]，[ 22 ]，[ 23 ] hydrogelthickened微乳液或溶菌酶结合物[ 24 ]。

但据我们所知，有没有研究文献中，对于一个以β-环糊精雷公藤甲素输送系统（CD）作为宿主分子。

一些萜类化合物的分辨率已经由CD的LC分离[ 25 ]流动相中添加改进。

事实上，环糊精是典型的主机分子在超分子化学的研究。

CD和d-glucopyrannose和1 macrolytic化合物，4-glycosodic债券，α-，β-gamma-CDs，自然cd分别包括6，7和8的葡萄糖单元，有几种多功能的CD衍生物可用来修改主机分子的理化性质。

例如，氨基酸的羧基CD，CD或硫酸镉是有用的工具分析研究。

通过分子间弱相互作用的宿主–客体包合物的形成，被描述为多种客体分子[ 26 ]。

在本研究中，我们研究了雷公藤内酯醇及其酯衍生物络合镉。

初步CE实验已经进行了描述两种化合物的电泳行为。

优化分离使用电离CD作为背景电解质修饰符允许定性分析雷公藤内酯醇（pg490）及阴离子琥珀酸模拟（pg490-88na）。

分子复合物的形成pg490或pg490-88na 和环糊精之间进行分离（CE），热力学（等温滴定量热法）和光谱（1D和2D NMR）在pH值接近生理pH技术。

使用这三个技术测定的两种化合物与中性的结合常数和电离的环糊精。

接下来，更先进的表明pg490-88na /氨基酸--CD复杂——表现最明显的结合常数——是通过核磁共振。

建立了化学计量学连续变异的方法[ 27 ] using1D核磁共振测量工作。

使用一维的选择性和2D ROESY实验研究了复杂的超分子结构的特点。

结果更精确地描述化合物和确定主机分子插入到环糊精空腔化工集团。

据我们所知，这是第一个广泛分析CD-triptolide复合物的表证。

2。

实验
2.1。

化学品
triptolide (PG490)和琥珀酸钠衍生物(PG490-88Na)是从皮埃尔·法布尔药剂实验室（位于法国兹）。

α-CD，γ-CD和羟丙基γ-CD（HP-γ-CD）购买来自瓦克Chimie（法国里昂），HP-α-CD和羧甲基β-CD(CM--CD)从Cyclolab和6-monodeoxy-6-monoamino-β-CD (amino-β-CD)Sigma–Aldrich (圣昆叮 Fallavier,法国). β-CD and HP--CD是馈赠罗盖特实验室（lestrem，法国）。

羟丙基化改性的环糊精代表的多组分混合物的平均摩尔取代度（MS）对C2, C3 和C6 3–4.8, 5.25–6.65, 4–6.4每CDmoleculeHP-α-CD, HP-β-CD和HP-γ-CD。

CM-
-CD提供了一个平均的MS 3，主要在C2。

他们的摩尔浓度的计算考虑到平均分子量。

氨基CD单取代对C6和MS 1／CD分子。

三（羟甲基）氨基甲烷（Tris），氢氧化钠和硼砂均购自默克（马恩河畔诺让，法国）。

硼酸，丙酮和DMSO的∑-–购买奥德里奇（圣昆廷fallavier，法国）。

磷酸（85%，W / W）购自贝克（德，荷兰）。

氧化氘（100%）和氘代甲醇分别从euriso 上购买（GIF河畔伊维特，法国）和奥德里奇（里昂，法国）。

2.2。

毛细管电泳
ACE实验were performed我们贝克曼P / ACE MDQ毛细管电泳系统，包括我们diodearray 年柱紫外光探测器。

整个系统是由一台个人电脑，32开的软件包系统控制数据采集和分析（贝克曼Coulter，维勒班，法国）。

这是配备了一个50.2cm（40cm有效长度）× 50 m I.D.治疗fused-silica毛细管（复合金属服务，克雷，英国）毛细管是分别安装在恒温在298 K ±0.1 K◦一个盒和和应用电压是10伏或15伏的分析离子或中性的CD。

进行水动力注射用5s在1.0psi的压力。

检测波长为214 nm pg490和pg490-88na。

两个缓冲器被用来作为背景电解质（BGE）：硼酸盐缓冲液（100毫米，pH值7.7）和Tris缓冲液（25毫米，pH值7.7）。

新的毛细血管冲洗20分钟和0.1 M氢氧化钠（NaOH）（P = 20磅）和5分钟的水（P = 20磅）。

每一天的毛细管被先后用NaOH（5分钟，20磅），水（1分钟，20磅），然后与BGE（3
分钟，20磅）。

每次运行之间，水处理（1分钟，20psi）和2分钟，20psi）。

示例解决方案在乙醇/硼酸缓冲50uM(5/95, v/v)是植物1mM乙醇的解决方案。

使用乙醇作为标记物测定的电渗迁移率。

对于中性pg490化合物，明显的和平均的结合常数K只能计算带电氨基酸-β-CD 和CM-β-CD.对电离pg490-88na化合物，它们分别计算中性和带电CDs(α-CD, β-CD, γ-CD, HP-α-CD, HP-β-CD, HP-γ-CD, amino-β-CD 和CM-β-CD). 加入BGE CD的增加量进行了表观结合常数的测定：从 0到 12 mM for the α-CD, β-CD, γ-CD, HP-α-CD and HP-γ-CD; 从0 到 50 mM HP-β-CD; 从0 到 16 mM 的氨基酸β-CD 和从 0 到 20 mM CM-β-CD.
2.3。

等温滴定量热法
等温量热仪（itc200，Microcal Inc.，USA）进行同时测定和研究形成常数和包括焓和熵的复合物。

采用滴定协议：204.5 L PG490 或 PG490-88Na脱气解决方案(Tris buffer, 25 mM, pH 7.7)在298k与某种特定的HP-β-CD的解决方案（缓冲区）40L注射器。

环糊精浓度等于5mmHP- β-CD和氨基-β-CD ，而pg490和pg490-88na浓度分别为0.2mm和0.5mm。

加入0.4·L的初始等分试样后，6个等分试样的6.3·L的环糊精溶液的交付（超过12.6对于每次注射）。

相应的热流量被记录作为时间的函数。

连续两次注射之间的时间间隔为120秒，搅拌速度为1000 rpm的全部实验。

此外，热环糊精稀释连续被eliminatedby进行空白滴定。

每次注射后（由原信号进行积分得到）的峰下面积，表示为每摩尔添加环糊精的热效应。

利用Microcal Origin 7软件包内使用内建的结合模式和结合等温线的非线性回归分析，最终确定结合常数和夹杂物的焓（Microcal，北安普顿，MA）。

化学计量被认为是1:1，每个环糊精分子可用网站N个被固定在1。

每个滴定实验为了确保结果，可重复性进行了三次。

2.4。

核磁共振波谱
一维（1D）核磁共振光谱进行了实验，在Bruker的Avance300光谱仪工作在300.09 MHz 的质子，并配备了BBI探头。

二维（2D）和选择性1D NMR光谱实验在BrukerAvance500与500.13 MHz的碳质子和125.8 MHz操作TXI探头实现。

500·L的溶液引入一个标准5毫米的NMR管中，在300 K进行实验。

分析物（PG490和PG490-88Na）和取代CD的1H信号的由NMR实验实现：同核双标量的相关性1H-1H COSY带（相关光谱）和1D选择性TOCSY（全相关谱）实验中使用的为80毫秒，异核相关1H-13C HSQC与混合时间的布鲁克脉冲程序库中找到的标准脉冲序列（异核单量子相干性）。

对于同核偶极correlations1H-1H，ROESY2D 和1D选择性实验与500 ms的混合时间的记录。

利用连续变化法在Tris缓冲液pH值7.7，确定了pg490-88na /氨基 -镉配合物的化学计量比。

相互作用的物种的总浓度保持恒定在2.5毫米。

摩尔分数R（R =[分析]/（[分析]+[CD]或R=[CD]/（[分析]+[CD]））变化范围在0-1之间。

对于表观结合常数，要按照斯科特的模型，并考虑到CD的平衡摩尔浓度等于总共推出了CD的浓度，在复合形式的CD浓度的测定必须是微不足道。

该[CD] / [分析物]比率从5到30的递增。

表观结合常数分别为HP-β-CD 或氨基-β-CD PG490或PG490-88Na之间形成的复合物。

由于PG490的水溶性不足，其络合CD是研究了在25毫摩尔Tris缓冲液pH 7.7中加入氘代甲醇中的25％。

选择性1D和2D ROESY实验实现使用等摩尔浓度分析物和CD（2.5mm的25mm的Tris缓冲液pH7.7）的PG490-88Na/amino-β-CD复合物。

3。

结果与讨论
3.1。

通过CE的pKa值的测定
合成的化合物的电离常数的知识来理解和预测的溶质CE迁移行为是必要的。

因此，对PG490-88Na的pKa的计算之前测量的相互作用实现的。

由于CE PKA，被公认为是一个方便
和精确的技术[ 28,29 ]，用3乙酸盐缓冲液的pH值为6.5（离子强度0.01米）。

pKa值为4.8（正如所料，这个值接近乙酸的pKa值）。

因此，在我们的电泳条件，在pH值为7.7，pg490-88na完全是在游离形式。

3.2。

的pg490和pg490-88na CD分析
这两种化合物的分析是第一个使用中性的CDS进行(α-CD, β-CD, γ-CD, HP-α-CD, HP-β-CD and HP-γ-CD)。

正如预期的那样，在中性PG490的流动性是通过加入中性的CD （与乙醇标记共同迁移）的改变。

然而，在BGE中性CD除了涉及减少的阴离子PG 490-88 Na 迁移时间（由于在EOF的相对感增加其自身的流动性）。

如该图所示。

2 forβ-CD 和 HP-β-CD,theneutral CD浓度的增加涉及最低的迁移时间。

阻滞因素（在存在和不存在的CdS 的迁移时间比）在 2 mm存在计算的，分别是α-CD，β-CD，γ-CD，HP-α-CD，HP-β-CD 和HP-γ-CD是0.95，0.91，0.93，0.87，0.91和0.89。

这些结果表明，络合与雷公藤甲素PG490-88那应该是大致相当的任何性质的CdS（见3.3节）。

然后，使用离子型CD进行了PG490和PG490-88Na由CE在pH7.7的同步分析。

值得一提的是，使用带电的CD应该具有极大的兴趣，以解决这两个EOF和PG490信号。

阴离子CM-β-CD或阳离子氨基-β-CD进行研究。

首先，不同操作参数进行优化，提供最佳的检测信号（高度），分析时间和分辨率。

最佳的电泳条件在实验section.The阴离子CM-β-CD所述的第一个研究用浓度递增，从1到20毫米。

正如所料，CM-β-CD，其中migratesin EOF的方向相反，使得减少这两种化合物的电泳迁移率，因此解决了成功EOF和PG490峰。

其次研究氨基-β-CD，是使用2浓度的增加到14毫米。

在这种情况下，通过其相互作用与阳离子CD，pg490在EOF信号检测。

pg490–pg490-88na混合物在BGE和阳离子或阴离子的CD获得另外的电泳（与最佳的镉浓度）在图3中显示的。

为了分析PG490，在CM-β-CD已被选择，以允许更高的分辨率与EOF 信号。

对于一个4毫米CM-β-CD的浓度，分别在EOF，PG490和PG490-88Na的迁移时间为5.93，7.22和10.18分和相应的分辨率是6.5和17。

3.3。

表观结合常数测定
Benesi–希尔德布兰德法[ 30 ]和史葛的修正方程【31】允许，用于分析物/Cd复合假设1:1，从线性方程后得到数学重排的表观结合常数的计算（yreciprocal）：
其中，K为表观结合常数，[CD]被认为是总浓度由于络合CD浓度必须是微不足道的，Ri分别为所观察到的实验反应与Rf和R c在它们的自由络合形式的分析物的反应，。

所计算的结合常数明显由于考虑了浓度（非活动）和当络合发生的平均取代度修饰的CdS。

在ACE或NMR 谱的研究响应分别是电泳迁移率（i）或化学位移（II）中。

表观迁移率（app）是电泳迁移率的总和与电渗流动性迁移率（eof），可以计算如下：
eof被从标记物（乙醇）的迁移时间来计算。

ACE研究的pg490 / CD和pg490-88na /CD配合物与ITC和核磁共振光谱研究的两个CDS显示高的结合常数进行研究：氨基-β-CD和HP-β-CD。

3.3.1亲和毛细管电泳（ACE）
表观络合常数计算分别在pH7.7的中性PG490和离子化的氨基-β-CD与CM-β-CD和电离PG490-88Na与α-CD，β-CD，γ-CD之间形成的复合物，HP-α-CD，HP-β-CD，HP-γ-CD，氨基-β-CD和CM-β-CD。

按照在y倒数模型的变化进行研究：对于线性拟合的相关系数均大于0.97，证实为1:1的复合物的模型是否充足。

对于中性CDs，BGE 粘度变化可以用通常的比例I/I0[32]，其中i和i0是，目前在CDs存在或不存在分别予以校正。

然而，电流的变化太弱，影响的K值。

使用任一硼酸盐或Tris缓冲液（pH7.7）进行了调查的缓冲区上的络合的性质。

它表明，缓冲液的性质并不显著影响配合物的稳定性。

例如，对K valuesdetermined为PG490-88Na/β-CD配合物是159 M-1和162 M-1的使用硼酸和Tris缓冲液，分别。

表1显示了使用硼酸盐缓冲液获得的结果。

对于中性CDs，明显获得最高平均结合常数β-CD, γ-CD, HP-α-CD,HP-β-CD和
HP-γ-CD并包含在窄幅135-167 M-1。

通过比较适用于HP-β-CD得到的结果（167 M-1）和β-CD（相互作用太弱进行量化），现在看来，已知以β-CD提高空腔大小，羟丙基化可能有利于在空腔中的分析物的配合。

然而，这种羟丙基化的α-CD或β-CD的，不影响络合（可以得到同样的K值）。

因为较低的结合常数与β-CD和HP-β-CD获得，既CD的空腔尺寸可能太大，以有利于主 - 客体相互作用。

通过比较获得的pg490和阴离子cm- β-CD或阳离子氨基-β-CD之间形成的配合物的研究结果，看来，CD的电荷有一个非常温和的影响相似的亲和力K值计算：72 M-1和100 M-1的分别为PG490/amino-β-CD和PG490/CM-β-CD复合物。

与此相反，CD的电荷具有阴离子PG490-88Na的络合产生重大影响，因为所得到的的K值分别为PG490-88Na/amino-β-CD或PG490-278 M-1或38的M-188Na/CM-β-CD复合物。

这些观察结果可能相关联的，在第一种情况下，建立了药物和铵功能的琥珀酸基团，或在第二种情况下，静电斥力阴离子CM-β-CD 和阴离子酯侧链之间。

3.3.2等温滴定量热法
pg-490和pg490-88na复合物的形成，导致与等温滴定量热法的负面信号，根据这种包合现象的放热性质，作为一般的观察与CD包含的化合物。

代表性的热分析加成氨基-环糊精到PG490-88Na溶液呈现在图4。

而热释放是足以形成常数的准确评价HP--CD/PG490-88Na，氨基-β-CD/PG490和氨基-β-CD/PG490-88Na复合物（见表1），观察到的HP--CD/PG490强度太弱，使结合强度的正确评价复杂。

值得一提的是，所有这些配合物的特征在于低怀兹曼参数C值[33]，这是由在细胞内形成恒定浓度浓度和客体之间的产品进行评估，确实不如0.2所有研究的化合物。

因此，这种复合物的热分析是具有挑战性的[34]。

在HP-β-CD/PG490复杂的情况下，除了PG490和其用于HP-β-CD的亲和力低水溶性差（根据ACE和NMR测量），列入焓可能是太弱，导致很好的解决高峰ITC实验。

在相反的情况下HP-β-CD/PG490-88Na, amino-β-CD/PG490和amino-β-CD/PG490-88Na复合物，所得到的形成常数与ACE和核磁共振结果一致，所得到的形成常数与ACE和核磁共振结果，三种技术已接近相对的不确定性，以每个方法（接近10％）之间的差异相吻合。

此外，在包含焓的变化测量值分别等于-2521，-4608和-4762千卡/摩尔用于HP--CD/PG490-88Na，氨基-β-CD/PG490和氨基-β-CD/PG490-88Na络合物。

3.3.3 1H-NMR谱
通过研究分析物/CD复合物提供振动性，通过比较各个结合常数获得多种分析物和CD复合物，但是这些数据是整个分子的平均值。

相反，1H-NMR谱研究质子的化学位移信号，可以获
得单个原子所处的环境。

NMR光谱研究两种CD S分子（HP-β-CD和氨基-β-CD）显示了高的络合能力。

值得一提的是NMR研究方法可以用来研究中性PG490和中性分子HP-β-CD的形成，其与ACE不同。

1H信号提供了最高的化学位移，可以通过它来计算表观结合常数；选择H20信号。

获得了所有研究化合物的线性关系，相关系数大于0.97.通过ACE、ITC和NMR获得的值可以粗略地进行比较。

例如，对于ACE、ITC和NMR，PG490-88Na/氨基- CD的表观结合常数是278，336和273M-1，PG490-88Na/HP—CD表观结合常数是153，144和161 M-1。

3.4 复合物PG490-88Na/氨基- CD的NMR研究
PG490-88Na/氨基- β-CD有一种更高的特性（化学计量学和结构），它显示了最高的表观结合常数。

3.4.1化学计量学信息
Job的方法，是一种连续变化的方法，它以分析物和CD的1H-NMR的化学位移为基础，用于确定PG490-88Na/氨基- CD的化学计量学信息。

只有一些PG490-88Na H原子可以被选择用来测定他们的化学位移的变化。

H16 (max = 19 Hz), H17 (max = 16 Hz), H20 (max = 14 Hz), H21 orH22 (max =22 Hz) and H12 (max = 52 Hz). 深入研究，通过照射H11实施选择性TOCSY实验证明因为氨基-β-CD的质子共振隐藏了PG490-88Na的H12的化学位移信息。

为了研究每一个信号，成立了相似的工作组（最大值观察了0.5摩尔比）。

图5揭示了化合物的n:n的化学计量学。

对于CD，研究氨基-β-CD的亚基取代的H5（最大值为32HZ）证实了n:n的化学计量。

此质子位于插入CD空腔，在分析物和CD空腔之间具有一个与环糊精的空腔一致的空腔。