吸附层析法
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层析技术及原理
思考题 1. 血清r-球蛋白分离与纯度鉴定的原理?
层析可分哪几类？
3．简述离子交换层析和凝胶层析的原理? 4．主要有哪几个操作步骤?
图3-2 Rs计算示意图
图3-3 垂直线法计算Rs示意图
若Rs=1，则组分定会分离；Rs<1，则组分部分分离；Rs=0，组分不能分离或分离极差。
四.分配系数
在层析分离过程中，物质既进入固定相，又进入流 动相，此过程称分配过程。无论哪一种层析法，在一定条 件下，物质在固定相和流动相达到平衡时，它在两相中平 均浓度的比值称分配系数(K)。 分配系数是由溶质的性质(分子大小、电荷、分子量等) 所决定的。不同的层析机制，其K值涵义不同。吸附层析 中，K值表示吸附平衡常数；分配层析中，表示分配系数； 离子交换层析中，表示交换常数；亲和层析中，表示亲和 常数。K值大表示其溶质在固定相中浓度大，在洗脱过程 中，溶质出现较晚。K值小表示其溶质在流动相中浓度大， 故在洗脱液中出现较早。 若两组分在同一条件下具有相似的K值，则表明两组 分层析峰重叠大，分离效果差。为达到分离目的，需重新 选择实验条件，包括层析方式和流动相的改变。
ห้องสมุดไป่ตู้
实际计算理论塔板数时，只要在层析图谱 上测出某组分的保留值和在一定纸速下相应的 峰宽，就可计算出在某一实验条件下的理论塔 板数的近似值，以衡量柱效。若要得到真正的 塔板数时，必需扣除未被固定相所占有的空间 死体积(如柱的接口、连接柱接口的管路体积) 和流动相为充满死体积时所需的时间，此时得 到的塔板数称为有效塔板数(neff)。故上述公 式可转化为：
层析中的常用术语
一、保留值(Retention Value)
保留值表示样品中各组分 在层析柱中停留时间的长短或 组分流出时所需流动相体积的 多少。它用来描述层析峰在层 析图上的位置(图3-1)
第六章 层析技术
常用术语
固定相：是由层析基质组成的，其基质包括固体
物质（如吸附剂、离子交换剂）和液体物质（如固 定在纤维素或硅胶上的溶液），这些物质能与相关 的化合物进行可逆的吸附、溶解和交换作用。
流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向 一定方向移动的液体或气体称为流动相。在柱层 析时，流动相又称洗脱液或洗涤剂。在薄层层析 时流动相又称展层剂。
几个概念
吸附剂 吸附剂的选择主要依据吸附剂本身和被吸附物
质的极性，为活性多孔固体，表面积大、颗粒均 匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。
常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基 磷灰石等。
• 羟基磷灰石（HA）[Ca10(PO4)6.(OH)2]
表面有Ca2+和PO43-两种带电基团。酸性和中性蛋 白质可与Ca2+结合，碱性蛋白质可与PO43-结合。
*气体作为流动相
*吸附在固体上的液体为固定相
按两相所处的状态分为： 液相色谱 液-固层析 液-液层析 气相色谱 气-固层析 气-液层析
（2）按层析原理分类
吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶排阻层析
（3）按操作形式不同分类：
柱层析
纸层析
薄层层析
Liquid Chromatography
突出贡献: 预测气相色谱(1952年应用);提出用细小颗粒 作填料,而两端可以加压(HPLC).
1952年：马丁，辛格对分配层析的研究和发现， 诺贝尔化学奖
1952年，马丁同詹姆斯(James)一起，把分配层析应 用在分离气体上。各种气体或蒸汽的混合物可以利用氮 或氦一类情性载气的气流通过吸收性固体的表面。混合 的气体通过后，在另一端实现分离。
洗脱体积（Ve）：
是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度 达到最大值时的流动相体积。
层析分离技术
根据分离的原理不同分类 分为吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作 用层析、反相层析、亲和层析等。
4.2 吸附层析
吸附层析（Adsorption Chromatography ）是以吸附剂 为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而 达到分离目的的一种层析技术。
按吸附剂和吸附物之间的作用力不同，吸附可分为三 种类型： 物理吸附：范德华力，吸附解吸速度快，选择性较差 化学吸附：生成化学键，达到平衡慢，选择性较好 交换吸附：极性分子或离子之间发生交换吸附…….
的活性物质提取分离，如维生素B12、四环素、土霉 素等，还可用于污水处理、糖浆脱色等。
大孔吸附树脂的选择和使用
选择依据： 吸附剂及吸附物的极性
一般来说，非极性吸附剂易从极性溶剂中吸附非极性 物质；极性吸附剂易从非极性溶剂中吸附极性物质； 中等极性的吸附剂对上述两种情况都具有吸附能力。 吸附物质的大小 吸附物分子较大的，应选择大孔树脂中孔径大的。
常用吸附剂按其化学结构可分两类
有机吸附剂，如：活性炭、纤维素、大孔吸附 树脂、聚酰胺等
无机吸附剂，如：硅胶、氧化铝、硅酸镁、硅 藻土、羟基磷灰石等
常用吸附剂简介
硅胶 是一种极性吸附剂，又是一种弱酸性阳离子交换
剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子， 遇较强碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附 碱性化合物； 应用于萜类、固醇、生物碱、酸性化合物、磷脂、 脂肪、氨基酸等的吸附分离。
HA的吸附机理
HA机理的主要观点是：HA的Ca2+和生物分子表 面的负电荷基团的结合，对生物分子的分离起重 要作用；而HA的磷酸基团与生物分子表面的正 电荷基团的结合，则起次要作用。
大孔吸附树脂
特点 大孔型颗粒，其孔隙、骨架结构和极性可按需要选
4.2 吸附层析
吸附层析（Adsorption Chromatography ）是以吸附剂 为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而 达到分离目的的一种层析技术。
按吸附剂和吸附物之间的作用力不同，吸附可分为三 种类型： 物理吸附：范德华力，吸附解吸速度快，选择性较差 化学吸附：生成化学键，达到平衡慢，选择性较好 交换吸附：极性分子或离子之间发生交换吸附…….
的活性物质提取分离，如维生素B12、四环素、土霉 素等，还可用于污水处理、糖浆脱色等。
大孔吸附树脂的选择和使用
选择依据： 吸附剂及吸附物的极性
一般来说，非极性吸附剂易从极性溶剂中吸附非极性 物质；极性吸附剂易从非极性溶剂中吸附极性物质； 中等极性的吸附剂对上述两种情况都具有吸附能力。 吸附物质的大小 吸附物分子较大的，应选择大孔树脂中孔径大的。
常用吸附剂按其化学结构可分两类
有机吸附剂，如：活性炭、纤维素、大孔吸附 树脂、聚酰胺等
无机吸附剂，如：硅胶、氧化铝、硅酸镁、硅 藻土、羟基磷灰石等
常用吸附剂简介
硅胶 是一种极性吸附剂，又是一种弱酸性阳离子交换
剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子， 遇较强碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附 碱性化合物； 应用于萜类、固醇、生物碱、酸性化合物、磷脂、 脂肪、氨基酸等的吸附分离。
HA的吸附机理
HA机理的主要观点是：HA的Ca2+和生物分子表 面的负电荷基团的结合，对生物分子的分离起重 要作用；而HA的磷酸基团与生物分子表面的正 电荷基团的结合，则起次要作用。
大孔吸附树脂
特点 大孔型颗粒，其孔隙、骨架结构和极性可按需要选
吸附层析法
化学分离分析 ——吸附色层法
②组：
2014年8月1日星期五
色层分析法
第1页
一．吸附层析
（adsorption chromatography）
1.原理 2.吸附剂的类型及其选择 3.流动相及其选择
吸附
指在固体或液体内部或表面的选择性传递。 被吸附的物质称为溶质，固体材料称为吸附剂。
图15.1
吸附层析
一般Ａl2O3用量为样品量的5～２０倍。
活度级别
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
含水量（%）
Al2O3 ０ ３ ６ １０ １５ 硅胶 ０ ５ １５ ２５ ３８
（3）羟基磷灰石
化学式[Ca5(PO4)3OH]2，简称HA。HA有三种规 格，分别适用于不同条件。由于HA的吸附容量 高，稳定性好（在T<85℃，PH5.5~10.0均可使 用）。 HA的Ca2＋基团和生物表面的负电荷基团的相 互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要 的作用。HA的PO43-基团与生物分子表面的阳 电荷基团的相互反应，起着次要的作用。
硅胶是由聚硅酸脱水制得的颗粒状吸附剂
（2）氧化铝
Al2O3是由Al(OH)３脱水制得，Al2O3表面存在铝羟基Al－ ＯＨ，由于羟基的Ｈ键作用而能吸附其它物质。 Ａl2O3可分为中性、酸性、碱性三种。 中性氧化铝适用于醛、酮、酯、内酯化合物及某些苷的分离； 酸性氧化铝适用于酸性化合物，如酸性色素、某些氨基酸， 以及对酸稳定的中性物质的分离； 碱 性Ａl2O3适用于分离碱性化合物如生物碱、醇以及其它中 性和碱性物质。 一般讲，能用酸性或碱性氧化铝分离的物质 也可 用中性的氧化铝分离。
乙烯、吡啶
含氮极性化合物 带强极性基团 苯酚甲醛缩合物 苯乙烯
二乙烯苯
二乙烯苯 二乙烯苯
②组：
2014年8月1日星期五
色层分析法
第1页
一．吸附层析
（adsorption chromatography）
1.原理 2.吸附剂的类型及其选择 3.流动相及其选择
吸附
指在固体或液体内部或表面的选择性传递。 被吸附的物质称为溶质，固体材料称为吸附剂。
图15.1
吸附层析
一般Ａl2O3用量为样品量的5～２０倍。
活度级别
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
含水量（%）
Al2O3 ０ ３ ６ １０ １５ 硅胶 ０ ５ １５ ２５ ３８
（3）羟基磷灰石
化学式[Ca5(PO4)3OH]2，简称HA。HA有三种规 格，分别适用于不同条件。由于HA的吸附容量 高，稳定性好（在T<85℃，PH5.5~10.0均可使 用）。 HA的Ca2＋基团和生物表面的负电荷基团的相 互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要 的作用。HA的PO43-基团与生物分子表面的阳 电荷基团的相互反应，起着次要的作用。
硅胶是由聚硅酸脱水制得的颗粒状吸附剂
（2）氧化铝
Al2O3是由Al(OH)３脱水制得，Al2O3表面存在铝羟基Al－ ＯＨ，由于羟基的Ｈ键作用而能吸附其它物质。 Ａl2O3可分为中性、酸性、碱性三种。 中性氧化铝适用于醛、酮、酯、内酯化合物及某些苷的分离； 酸性氧化铝适用于酸性化合物，如酸性色素、某些氨基酸， 以及对酸稳定的中性物质的分离； 碱 性Ａl2O3适用于分离碱性化合物如生物碱、醇以及其它中 性和碱性物质。 一般讲，能用酸性或碱性氧化铝分离的物质 也可 用中性的氧化铝分离。
乙烯、吡啶
含氮极性化合物 带强极性基团 苯酚甲醛缩合物 苯乙烯
二乙烯苯
二乙烯苯 二乙烯苯
层析分离技术二吸附层析
凉干，120℃烘干12小时即可重新使用。
羟基磷灰石的再生 用0.4MpH6.8的PBS缓冲液洗柱至平衡即
可重新使用。
四、吸附层析工艺
固定床吸附 流化床吸附 膨胀床吸附 移动床吸附
1、固定床吸附
吸附柱内填充固相吸附介质，含目标产物的料液输入吸附 柱，流经吸附剂后，溶质被吸附剂吸附。
料液
液泵
吸
分析仪
适应条件：在低浓度范围之内 成立。当浓度较高时，吸附平衡常 呈非线性，上式无效。
（2）Freundlich 型吸附平衡
其经验公式为
q* kc1/n
其中，k和n为常数，n一 般在1-10之间。
Freundlich 等 温 线 可 描 述大多数抗生素、类固醇、 甾类激素等在溶液中的吸附 过程。
（3）Langmuir型吸附平衡
应停止进料吸附操作，顺次 转入杂质清洗、吸附溶质洗
脱和吸附剂再生操作。
活化： 110℃烘烤0.5~1h。活化后立即使用或短期贮存与干燥器中
要想分离物质重复性好，每次所用的硅胶活性必须一致。 活性测定习惯采用6种染料进行。
1．偶氮苯；2．对甲氧基偶氮苯；3．苏丹黄； 4．苏丹红；5．对氨基偶氮苯； 6．对羟基偶氮苯。
原理：在吸附柱上，因吸附剂对6种染料吸附的能力不同，所以它们经洗脱 后的位置不同，借此即可测定吸附剂的活性级别。 具体操作是：取上述6种染料各20mg溶于l0ml苯溶剂中，加50ml石油醚稀释， 然后取20ml此溶液加到1.5cm×l0cm的硅胶柱上，再加20ml苯与石油醚(1：4) 的混合液进行冲洗，洗毕根据各种染料的位置，找出硅胶的活性级别。
注：吸附剂表面要平整，应一直浸泡在溶剂液面以下，严 防产生气泡。湿法装柱均匀，不易留有气泡
羟基磷灰石的再生 用0.4MpH6.8的PBS缓冲液洗柱至平衡即
可重新使用。
四、吸附层析工艺
固定床吸附 流化床吸附 膨胀床吸附 移动床吸附
1、固定床吸附
吸附柱内填充固相吸附介质，含目标产物的料液输入吸附 柱，流经吸附剂后，溶质被吸附剂吸附。
料液
液泵
吸
分析仪
适应条件：在低浓度范围之内 成立。当浓度较高时，吸附平衡常 呈非线性，上式无效。
（2）Freundlich 型吸附平衡
其经验公式为
q* kc1/n
其中，k和n为常数，n一 般在1-10之间。
Freundlich 等 温 线 可 描 述大多数抗生素、类固醇、 甾类激素等在溶液中的吸附 过程。
（3）Langmuir型吸附平衡
应停止进料吸附操作，顺次 转入杂质清洗、吸附溶质洗
脱和吸附剂再生操作。
活化： 110℃烘烤0.5~1h。活化后立即使用或短期贮存与干燥器中
要想分离物质重复性好，每次所用的硅胶活性必须一致。 活性测定习惯采用6种染料进行。
1．偶氮苯；2．对甲氧基偶氮苯；3．苏丹黄； 4．苏丹红；5．对氨基偶氮苯； 6．对羟基偶氮苯。
原理：在吸附柱上，因吸附剂对6种染料吸附的能力不同，所以它们经洗脱 后的位置不同，借此即可测定吸附剂的活性级别。 具体操作是：取上述6种染料各20mg溶于l0ml苯溶剂中，加50ml石油醚稀释， 然后取20ml此溶液加到1.5cm×l0cm的硅胶柱上，再加20ml苯与石油醚(1：4) 的混合液进行冲洗，洗毕根据各种染料的位置，找出硅胶的活性级别。
注：吸附剂表面要平整，应一直浸泡在溶剂液面以下，严 防产生气泡。湿法装柱均匀，不易留有气泡
层析法-理论ppt课件
方法：
(1) oligo(dT)-纤维素层 析柱法
(2) oligo(dT)-纤维素液 相结合离心法
(3)磁珠分离法
oligo(dT)-纤维素层析柱法
磁 珠 分 离 法
配体与载体结合
(固相化)
亲和层析
装柱
的基本过程
(亲和层析柱)
解吸附 洗柱
亲和吸附
(生物高分子与配体专一结合)
配体与载体的联接方法
固定相——滤纸上的吸附水 流动相——溶剂(乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶
的溶剂)
分离示意图
层 析 纸
层析缸
溶剂前沿
y x2
x1 起始线
(原点)
展开剂
Rf > 0.02 ，A 、B可分离. 与标样比较可定性鉴定
. 如果两种氨基酸的迁移速率相近，
或者氨基酸的Rf值相同，如何来分
离？
氨基酸的Rf值
展开剂 正丁醇+吡啶+水
名称
分离原理
固定相只能与一种待分离
亲和层析法 组份专一结合，以此和无 亲和力的其它组份分离
层析法的分类
• 按操作形式不同分类
名称
操作形式
柱层析法 固定相装于柱内，使样品沿着 一个方向前移而达分离
纸层析法 用滤纸作液体的载体，点样后 用流动相展开，使各组份分离
将适当的高分子有机吸附剂制成 薄膜层析法 薄膜，以类似纸层析方法进行物
加入样品 层析后
实验：胡萝卜的 柱层析分离法
柱层析示意图
薄层吸附层析
( Thin layer absorption chromatography)
薄层吸附层析是将吸附剂 均匀地在玻璃板上铺成薄层， 再把样品点在薄层板上，点样 的位置靠近板的一端。然后将 板的这端浸入适当的溶剂(流 动相)中，使溶剂在薄层板上 扩散，并在此过程中通过吸附 →解吸→再吸附→再解吸的反 复进行，而将样品各个组分分 离出来。
层析(包括：吸附层析、分配层析、离子交换层析、亲和层析等)
32
几个概念：
外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积 、洗脱体积
33
对某物质在凝胶柱 内洗脱体积Ve、Vo和 Vi之间的关系可用下 式表示：
Ve＝Vo＋Kd.Vi
可改写为：
（Ve-Vo） Kd = －－－－
Vi
34
当Kd＝0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子质量大，完 全不能进入凝胶颗粒微孔内，被排阻于凝胶颗粒之外而最先 洗脱下来；
14
迁移率
迁移率（ Rf或比移值）是指：在一定条件下，在 相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流 动相本身移动的距离之比值 。常用Rf来表示
实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率 是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在 固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移 动的距离之比 值。常用Rx来表示
27
像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉 ，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在溶剂 中能自动溶胀成胶。
根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可 分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表 示，从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P后面的阿拉伯 数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）， 所以数字越大，可分离的分子量也就越大目前。
3
4、按照不同的标准层析法有不同的分类。 根据层析峰的位置及峰高或峰面积,可以定 性及定量。层析法与光学、电学或电化学 仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度 或质量，同时绘出层析图。层析仪与电子 计算机联用，可使操作及数据处理自动化 ，大大缩短分析时间。
4
5、由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好 、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂 样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。近年来 ，已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在 医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面 也得到了广泛的应用。
几个概念：
外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积 、洗脱体积
33
对某物质在凝胶柱 内洗脱体积Ve、Vo和 Vi之间的关系可用下 式表示：
Ve＝Vo＋Kd.Vi
可改写为：
（Ve-Vo） Kd = －－－－
Vi
34
当Kd＝0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子质量大，完 全不能进入凝胶颗粒微孔内，被排阻于凝胶颗粒之外而最先 洗脱下来；
14
迁移率
迁移率（ Rf或比移值）是指：在一定条件下，在 相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流 动相本身移动的距离之比值 。常用Rf来表示
实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率 是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在 固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移 动的距离之比 值。常用Rx来表示
27
像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉 ，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在溶剂 中能自动溶胀成胶。
根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可 分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表 示，从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P后面的阿拉伯 数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）， 所以数字越大，可分离的分子量也就越大目前。
3
4、按照不同的标准层析法有不同的分类。 根据层析峰的位置及峰高或峰面积,可以定 性及定量。层析法与光学、电学或电化学 仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度 或质量，同时绘出层析图。层析仪与电子 计算机联用，可使操作及数据处理自动化 ，大大缩短分析时间。
4
5、由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好 、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂 样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。近年来 ，已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在 医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面 也得到了广泛的应用。
吸附层析法柱层析法
检测器
五、高效液相层析
• 正相层析法：固定相极性大于流动相极性 • 正相层析由于极性化合物更容易被极性固定相所保留 • 正相层析流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。 • 正相层析法一般可用于分离纯化极性大的分子，如磷脂、
甾体化合物、脂溶性维生素、前列腺素等
五、高效液相层析
• 反相层析法：流动相极性大于固定相极性 • 反相层析流出顺序极性大的先流出，极性小的后流出，
高压泵、进样装置、色谱柱、检测器
HPLC的特点 1.高压 2.高速 3.高效 4.高灵敏度
三、层析技术原理
• 层析系统由两相组成： 一是固定相，另一是流动相 • 流动相：携带流过整个系
统的流体 • 固定相：静止不动的一相
三、层析技术原理
• 当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份 的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶 解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比） 不同，各组分移动速度各异，因而可将各组份分离
• 吸附层析法(absorption chromatography)：固定相是 固体吸附剂，利用各组份在吸附剂表面吸附能力的差别 而分离。
• 分配层析(partition chromatography)：固定相为液体， 利用各组份在两液相中的分配系数不同而分离。
• 离子交换层析(ion exchange chromatography)：是以 具有离子交换性能的离子交换剂作固定相，利用他与流 动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合 物的一种方法。
• 若分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份， 最终达到分离各组分的目的。
四、层析技术分类
毛细管电泳
气相层析法
超临界层析 法
实验 色素的分离(层析法)
实验色素的分离(层析法)一、目的要求1．进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质。
2．学会用层析法分离色素的操作技术，了解层析分析的有关知识。
二、实验原理层析分离技术是一种物理分离方法，按分离原理的不同，层析法可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、亲和层析等数种方法。
按操作方式的不同，又可分为柱型、薄层和纸型。
在本实验中采用柱吸附层析法分离叶色素，由于叶色素中各色素被吸附剂吸附的程度不同以及它们被溶剂溶解的能力不同，所以在层析柱中向下移动的距离不同而得以分离。
用适当的溶剂如石油醚、甲醇、丙酮、苯等，可将绿叶中的色素（叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素、叶黄素）提取出来，提取液通过吸附柱将其中的各种色素分开，吸附柱常用蔗糖、碳酸钙、氧化铝等吸附剂制成。
三、实验器材抽滤瓶、研钵、带托玻璃棒、层析柱(20㎝×1㎝)、分液漏斗、烧杯，具塞试管。
40 ℃烘干的菠菜叶、脱脂棉四、实验试剂1.石油醚2.甲醇3.苯4.无水硫酸钠5.细粉状蔗糖6.无水碳酸钙7.氧化铝8.海砂五、操作步骤1．取烘干的菠菜叶1 g置于研钵中，加少许海砂研碎。
浸入含有22.5 mL 的石油醚、2.5 mL苯和7.5 mL甲醇的混合溶剂中，放置约1 h。
2．将上述溶液置于分液漏斗中，加5 mL水轻轻上下颠倒数次，静置后弃去水层（其中溶有甲醇），应避免剧烈振荡，否则发生乳化现象。
将剩余的液体通过装有无水硫酸钠（5 g）的漏斗过滤除去水分，即得到色素提取液(必要时可在通风橱中小心浓缩)。
提取液于干燥的试管中保存，并用塞子将试管塞紧。
3．取层析柱1支（也可用25 mL酸式滴定管代替），在下端塞上一块脱脂棉，将约2 g细粉状氧化铝装入柱中，每装少许就用带托的玻璃棒压紧，尤其四周要与柱壁紧密相接，不得留有空隙。
装到3 cm高为止。
用同样的方法装入约2.5 g 细粉状碳酸钙，高度为5 cm，然后再用同样的方法将约3.5 g的细蔗糖粉末装入柱内，高度为7 cm。
第三章-吸附层析
吸附层析的概念
吸附层析（absorption chromatography）又 称色层法或色谱法；是根据各种被分离组分在固 定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的一 类分离纯化方法。
教学目的
掌握基本原理和操作方法 吸附柱层析 薄层层析 聚酰胺薄层层析
层析方法的类型
第一节 吸附柱层析
吸附柱层析的概念
第三章 吸附层析
层析又称为色谱或色层，是俄国植物学家茨维 特在分离植物色素时发现并最先应用的一种分离 纯化方法。其总的原理是根据各种被分离组分在 固定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的。
层析法根据层析类型分，可分为柱层析、纸层析和 薄层层析；根据具体分离原理分，可分为吸附层析、分 配层析、疏水层析、离子交换层析、亲和层析、凝胶过 滤层析等具体层析方法
②将收集的每管溶液进行浓缩和活性测定。以管号或洗脱体积 为横坐标，每管样品的浓度或活度为纵坐标，若层析峰无重叠， 则各成分能完全分离（图3-7）
③为了获得满意分离效果，洗脱速度恰当控制（若太快，洗脱 物在两相中平衡不完全；太慢，则洗脱物会扩散；结果都会导 致分离度下降）
④分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定及保存
第三节 聚酰胺薄膜层析
一、聚酰胺薄膜层析的概念
聚酰胺薄膜层析是1966年之后发展起来的一种层析方 法。特别应指出的是，用此法分析氨基酸衍生物DNP-氨基 酸、PTH-氨基酸、DNS-氨基酸以及DABTH-氨基酸1）时， 具有灵敏度高、分辨力强、展层迅速和操作简便等优点， 它超过了这类化合物过去使用的纸层析、纸电泳和薄层层 析(茚三酮法)等方法
➢HA为干粉时，需事先浸泡膨胀达到2~3ml/g后，按1∶6加 入缓冲液悬浮，除去细小的颗粒
➢HA悬浮液需用旋涡振荡器混合，因为其他搅拌器如磁棒、 玻棒等易破坏其晶体结构
吸附层析
吸附剂的分类
常用的吸附剂有：极性吸附剂和非极性吸附剂两 种 。 极性吸附剂：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造 沸石等。 非极性吸附剂：主要是活性炭。
1.1几种极性吸附剂的简要介绍
(1)硅胶 硅胶是应用最广泛的一种极性吸附剂，具有多孔性网状 结构，它的主要优点是化学惰性，具有较大的吸附量，容 易制备不同类型，孔径，表面积的多孔性硅胶。 硅胶的吸附能力与吸附物的性质有关，硅胶能吸附非极 性化合物，也能吸附极性化合物，对极性化合物的 吸附能 力更大。硅胶的吸附能力与其本身的含水量密切相关，硅 胶吸附活性随含水量的增加而降低，当含水量小于1%时， 活性最高，而当含水量大于20%时，硅胶的吸附活性最低。 硅胶表面上带有大量的羟基，有很强的亲水性，能吸附 多量水分，因此硅胶一般于105～110摄氏度活化1～2小时后 使用，活化后的硅胶应马上使用。
4、应用
4.1纯化生命物质
使用吸附剂的柱层析或分批吸附法(见实例1)可纯
化生命物质。
如用羟基磷灰石吸附剂能把酸性、中性和碱性蛋 白质分开，也能把不同结构的核酸分开(见图3-8)。 用该吸附剂分离含不同磷酸基团的蛋白质和脂类 等化合物也是有效的。
4.2 分离蛋白质的亚基
一般蛋白质经SDS(十二烷基硫酸钠)或Triton X100(聚氧乙基十六烷基酚醚)等去污剂处理后，会产生 分子质量不同的蛋白质亚基。
(按体积或时间分管收集)。 随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定 。
3.3绘制出洗脱曲线，以每管溶液中样品的浓
度或活性为纵坐标)。 理想的洗脱曲线如图3-7所示。 图中的A峰和B峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明 样品液中的组分已完全分开。 层析峰的面积(EFG)、峰高(BE)和半峰高的宽度(HI)等参 数是定性、定量洗脱物的依据。
硅胶柱层析
硅胶柱层析一、硅胶柱层析原理根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附,极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。
二、硅胶柱层析流动相极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸三、硅胶柱层析惯用方法1。
称量200—300目硅胶，称30—70倍于上样量;如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H.干硅胶的视密度在0.4左右,所以要称40g硅胶,用烧杯量100ml也可以.2.搅成匀浆加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。
如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌.如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话,必须预先用无水硫酸钠久置干燥。
氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1％的醇。
如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。
3.装柱将柱底用棉花塞紧，不必用海沙,加入约1/3体积石油醚（氯仿）,装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内.随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。
4.压实沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定.柱床约被压缩至9/10体积。
无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步,可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。
5。
上样干法湿法都可以。
海沙是没必要的.上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面.然后就可以放心地加入大量洗脱剂,而不会冲坏硅胶表面。
6.过柱和收集柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡.太低的洗脱强度并不好,推荐用梯度洗脱。
收集的例子:10mg上样量，1g硅胶H，0。
5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶（200—300目），20—50ml收一馏分。
7.检测要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯,会损失较多产品,紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。
实验五 层析实验
分子量适用范围为1，500～30，000。
血红蛋白本身有红色，鱼精蛋白无色，故将黄色的DNP（2，4–二 硝基氟苯）偶联于鱼精蛋白，使其着色，便于观察。
【操作步骤】 1．凝胶的准备 称取l g Sephadex G–50，置于锥形瓶中，加蒸馏水30ml， 沸水浴中放置1小时，冷至室温备用。 2．装柱 取直径0.8～1.2cm，长25～30cm的层析柱一支，垂直安装于铁 架台上。底部填少许玻璃纤维，下部装一“再”形夹以调节流速（见 图4-1）。首先关闭“再”形夹，自顶部缓缓加入上述备用的 Sephadex G–50 悬液，待底部凝胶沉积1～2cm时，打开“再”形夹， 并边缓加Sephadex G–50悬液，边调整适当流速，至凝胶层积集约 18cm高，停止加Sephadex G–50悬液，连通洗脱液，进行平衡（调整 流速）。操作过程中，应防止气泡进入和凝胶分层现象。 3．样品制备 临上样前，将0.3ml血红蛋白溶液和0.5ml DNP–鱼精蛋白溶 液混匀即可。 4．加样与洗脱 切断洗脱液，当层析柱中液面下降与凝胶表层平齐时， 即用滴管将样品液缓缓沿柱壁加入，不使凝胶表层扰动，待样品液面 与凝胶表层平齐时，再加少许蒸馏水，开始洗脱。注意观察层析柱中 红色的血红蛋白与黄色的DNP–鱼精蛋白分离的情况，记录现象。
【操作步骤】
1．填料的预处理：在一只100ml烧杯中，置约10g树脂，加2M HCl 25ml，
搅匀，放置2小时，倾弃上层酸液，蒸馏水洗3次，再加2 M NaOH 25ml， 搅匀，放置2小时，倾弃上层碱液，用蒸馏水洗至中性（pH试纸检查）。 将树脂悬浮于大约50ml pH 2.2的0.1M柠檬酸缓冲液中备用。
影响氨基移换过程的观察，因此在反应体系中添加一碘醋酸(或 一溴醋酸)以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。
常用的层析分析方法
常用的层析分析方法在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。
一、吸附层析1、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。
这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
3、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。
这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。
层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。
因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
二、离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。
离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
`三、凝胶过滤凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。
当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
四、亲和层析亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。
正如在酶与底物的反应中，特异的废物(S ‘)才能和一定的酶(E)结合，产生复合物(E－S‘)一样。
在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。
而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体(类似底物)是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。
实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。
胡萝卜素吸附层析实验结果及讨论
胡萝卜素吸附层析实验结果及讨论
胡萝卜素是一种具有重要营养和生理活性的物质,在食品加工和医药工业中有广泛的应用。
吸附层析是一种有效的分离和纯化胡萝卜素的技术。
下面是一份可能的胡萝卜素吸附层析实验结果及讨论：
实验方法：
1. 准备胡萝卜素吸附层析柱,并用0.1M PBS冲洗柱子。
2. 用0.1M PBS溶液将含有胡萝卜素的样品加入柱子。
3. 用0.1M PBS洗涤柱子,直到洗涤液中的吸附物质不再明显。
4. 用0.1M PBS-95％乙醇混合溶液洗脱吸附到胡萝卜素的物质。
5. 通过紫外光谱法检测洗脱液中的胡萝卜素。
实验结果：
在吸附层析柱中,胡萝卜素和其他物质被分离和固定在柱子里。
通过用PBS和PBS-95％乙醇混合溶液进行洗脱,胡萝卜素可以很好地从柱子中洗脱出来。
紫外光谱法检测结果显示,洗脱液中存在胡萝卜素的吸收峰。
实验讨论：
本实验采用的是吸附层析法来纯化胡萝卜素,该方法主要依赖于吸附剂对目标物质的特异性吸附作用来实现分离和纯化。
在本实验中,吸附剂是柱子内部的固定相,而目标物质是胡萝卜素。
柱子内部的固定相通常是一种多孔性的材料,具有与目标物质相对应的表面化学性质,以便实现特异性吸附。
而对柱子进行洗涤和洗脱是为了将非目标物质从固定相中去除,最终得到较纯的目标物质。
总之,本实验结果表明,吸附层析法是一种有效的分离和纯化胡萝卜素的方法,可用于工业生产和科研实验中。
吸附层析法
吸附层析法是一种分离和浓缩有机物的方法，常用于分析和浓பைடு நூலகம்有机溶剂中的有机物。该方法的基本原理是，有机物在固定相（吸附剂）的表面上吸附，而溶剂则穿过固定相流出。
吸附层析法的步骤如下：
1.准备吸附剂：选择适当的吸附剂，将其装入容器中。
2.溶解样品：将样品溶解在溶剂中，得到溶液。
3.进行吸附：将溶液流入容器中，让有机物在吸附剂的表面上吸附。
4.流出溶剂：将吸附剂上的溶剂流出，留下吸附的有机物。
5.解吸：使用适当的溶剂将吸附的有机物解吸出来。
吸附层析法具有分离效率高、适用于各种有机物、操作简单等优点，广泛应用于有机合成、分析化学、药物分析等领域。
吸附层析法的步骤如下：
1.准备吸附剂：选择适当的吸附剂，将其装入容器中。
2.溶解样品：将样品溶解在溶剂中，得到溶液。
3.进行吸附：将溶液流入容器中，让有机物在吸附剂的表面上吸附。
4.流出溶剂：将吸附剂上的溶剂流出，留下吸附的有机物。
5.解吸：使用适当的溶剂将吸附的有机物解吸出来。
吸附层析法具有分离效率高、适用于各种有机物、操作简单等优点，广泛应用于有机合成、分析化学、药物分析等领域。
吸附层析法
◆能形成氢键基团较多的溶质，其吸附能力较 大；
◆对位、间位取代基团都能形成氢键时，吸附 能力增大，邻位的使吸附能力减少；
◆芳香核具有较多共轭双键时，吸附能力增大； ◆能形成分子内氢键者，吸附能力减少。
（5）吸附树脂
吸附树脂是由人工合成的具有大孔结构和大 表面积的吸附剂，可在150℃以下使用，不溶 于溶剂及酸碱。它在使用过程中膨胀或收缩都 很小，在重复多次后性能仍然稳定。
在选择洗脱剂时,还可以由各种 溶剂按不同配比配成混合溶剂作为 流动相；因此流动相的种类很多， 流动相的选择也就比固定相的选择 更为复杂。 为了获得物质的最佳分离，尤 其是极性相差大的物质，应采用洗 脱能力递增的流动相。在实践中一 般从极性小到极性大溶剂，通过实 验来选择。
谢谢！
祝大家分离分析考得好成绩！
iii)忌用柠檬酸缓冲液和PH<5.5的缓冲液。当用过 的HA层析柱再生时，要先挖去顶部的一层HA，然 后用一倍床体积1mol/LNaCl溶液洗涤，接着用4倍 床体积的平衡液洗涤平衡，如此处理后即可使用。 iv)就操作容量来说，一般细颗粒HA比粗的大；从分 辨率比较，粗颗粒HA也没有细的好。但是用细的 颗粒层析时，柱子直径大些才能达到满意的流速。
吸附树脂是一种亲脂性物质，由于其表面性质 不同，可吸附溶液中的不同有机物，它的作用 力主要是范德华力，这种结合力比起静电引力 来要弱得多，所以说从吸附树脂上把被吸附物 解吸下来是比较容易的，只要改变其亲水-疏 水平衡即可。
单体 Amberlite XAD-1 XAD-2 XAD-4 Xad-7 XAD-9 XAD-10 XAD-12 Diaion 系列 HP-10 HP-20 苯乙烯 苯乙烯 苯乙烯 苯乙烯 苯乙烯 α -甲基丙烯酸甲 酯 亚砜 丙烯酰胺 氧化氮类
◆对位、间位取代基团都能形成氢键时，吸附 能力增大，邻位的使吸附能力减少；
◆芳香核具有较多共轭双键时，吸附能力增大； ◆能形成分子内氢键者，吸附能力减少。
（5）吸附树脂
吸附树脂是由人工合成的具有大孔结构和大 表面积的吸附剂，可在150℃以下使用，不溶 于溶剂及酸碱。它在使用过程中膨胀或收缩都 很小，在重复多次后性能仍然稳定。
在选择洗脱剂时,还可以由各种 溶剂按不同配比配成混合溶剂作为 流动相；因此流动相的种类很多， 流动相的选择也就比固定相的选择 更为复杂。 为了获得物质的最佳分离，尤 其是极性相差大的物质，应采用洗 脱能力递增的流动相。在实践中一 般从极性小到极性大溶剂，通过实 验来选择。
谢谢！
祝大家分离分析考得好成绩！
iii)忌用柠檬酸缓冲液和PH<5.5的缓冲液。当用过 的HA层析柱再生时，要先挖去顶部的一层HA，然 后用一倍床体积1mol/LNaCl溶液洗涤，接着用4倍 床体积的平衡液洗涤平衡，如此处理后即可使用。 iv)就操作容量来说，一般细颗粒HA比粗的大；从分 辨率比较，粗颗粒HA也没有细的好。但是用细的 颗粒层析时，柱子直径大些才能达到满意的流速。
吸附树脂是一种亲脂性物质，由于其表面性质 不同，可吸附溶液中的不同有机物，它的作用 力主要是范德华力，这种结合力比起静电引力 来要弱得多，所以说从吸附树脂上把被吸附物 解吸下来是比较容易的，只要改变其亲水-疏 水平衡即可。
单体 Amberlite XAD-1 XAD-2 XAD-4 Xad-7 XAD-9 XAD-10 XAD-12 Diaion 系列 HP-10 HP-20 苯乙烯 苯乙烯 苯乙烯 苯乙烯 苯乙烯 α -甲基丙烯酸甲 酯 亚砜 丙烯酰胺 氧化氮类
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Lewapol G7318
苯乙烯
二乙烯苯 二乙烯苯 二乙烯苯 二乙烯苯 二乙烯苯 二乙烯苯
极性 非极性 非极性 非极性 强极性 极性 强极性 极性 非极性
孔径 比表面m2/g 600-700 400-500 590 370 80 90 128 42
吸附树脂在中药提取分离中的发展和应用
中药提取液－通过吸附树脂－吸附上有效成分的树脂 －洗脱－洗脱液－回收溶液－药液－干燥－半成品
强极性的组分容易被吸附剂所吸附， 应选用极性较强的流动相才能把它从吸 附剂上洗脱下来，使之沿着层析柱前进；
弱极性的组分则应选用弱极性的流 动相洗脱。
以聚酰胺为吸附剂时,一般用水作流动相。
以吸附树脂为吸附剂时，由于分子间吸附 力较弱，可用低级醇、酮或其水溶液洗脱。
原则：
弱酸性物质在酸性下吸附，碱性下洗脱；弱碱 性物质在碱性下吸附，酸性下洗脱。
吸附等温线：在一定温度下，某种组分在
吸附剂表面达平衡状态时在两相中浓度的相对 关系曲线。
吸附等温线的斜率KD表示分配系数，Cs表 示溶质在固定相中的浓度，Cm表示溶质在流动 相中的浓度达到平衡时在固定相中的浓度
线形的吸附等温线 非线形的吸附等温线
2．吸附剂的选择
高选择性以实现很好分离； 高容量以减少吸附剂的使用量； 对于快速吸剂具有很好的动力学和传递特性； 具有化学和热稳定性，在流动相中不溶解以保持吸附剂特性； 具有一定的机械强度和惰性，防止破碎和腐蚀； 易于充填或铺层； 不会与欲分离试样和流动剂发生化学反应； 抗污染性强； 价格便宜。
iii)忌用柠檬酸缓冲液和PH<5.5的缓冲液。当用过 的HA层析柱再生时，要先挖去顶部的一层HA，然 后用一倍床体积1mol/LNaCl溶液洗涤，接着用4倍 床体积的平衡液洗涤平衡，如此处理后即可使用。
iv)就操作容量来说，一般细颗粒HA比粗的大；从分 辨率比较，粗颗粒HA也没有细的好。但是用细的 颗粒层析时，柱子直径大些才能达到满意的流速。
◆能形成氢键基团较多的溶质，其吸附能力较 大；
◆对位、间位取代基团都能形成氢键时，吸附 能力增大，邻位的使吸附能力减少；
◆芳香核具有较多共轭双键时，吸附能力增大； ◆能形成分子内氢键者，吸附能力减少。
（5）吸附树脂
吸附树脂是由人工合成的具有大孔结构和大 表面积的吸附剂，可在150℃以下使用，不溶 于溶剂及酸碱。它在使用过程中膨胀或收缩都 很小，在重复多次后性能仍然稳定。
化学分离分析 ——吸附色层法
②组：
2020年4月10日星期五
色层分析法 第 1 页
一．吸附层析
（adsorption chromatography）
1.原理
2.吸附剂的类型及其选择
3.流动相及其选择
吸附
指在固体或液体内部或表面的选择性传递。 被吸附的物质称为溶质，固体材料称为吸附剂。
图15.1
吸附层析
解决实际应用问题。
建立树脂的药用标准。
3．流动相及其选择
流动相一般指洗脱吸附柱的溶液,它需要 满足以下要求:
稳定性好, 粘度小（0.4~0.5）×10-3Pa·s, 易于分离, 易于洗脱所分离组分。
流动相的洗脱作用实质上是流动相分 子与被分离的溶质分子竞争占据吸附剂 表面活性中心的过程。
是络合作用。
分子筛吸附树脂
除去分子量较小的杂质，提高分子量较 大的有效成分的含量。
除去中药提取物中的农药残留。
展望
树脂吸附技术优点
缩小剂量，提高中药 内在质量和制剂水平
减小产品的吸潮性
树脂吸附技术能缩短 生产周期, 所需设备 简单
明确纯化的目的，采 用树脂纯化的必要性 和方法的合理性，尤 其是复方混合提取的 上柱纯化。
活度级别
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
Al2O3 ０ ３ ６
１０ １５
含水量（%）
硅胶 ０ ５
１５ ２５ ３８
（3）羟基磷灰石
化学式[Ca5(PO4)3OH]2，简称HA。HA有三种规 格，分别适用于不同条件。由于HA的吸附容量 高，稳定性好（在T<85℃，PH5.5~10.0均可使 用）。 HA的Ca2＋基团和生物表面的负电荷基团的相 互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要 的作用。HA的PO43-基团与生物分子表面的阳 电荷基团的相互反应，起着次要的作用。
由于吸附和筛选原理，有机化合物根据吸附力的不同 及分子量的大小，在吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而 分开
吸附树脂吸附作用的影响因素
树脂本身化学结构 溶剂 被吸附的化合物的结构 洗脱液
吸附树脂的安全性
化学稳定性 交联三维网状结构＝〉机械稳定性
生物稳定性
新型吸附树脂的开发 氢键型吸附树脂
依靠与被吸附物质之间形成氢键而实现选择性分离 ADS-17，它能与黄酮类、多元酚类形成氢键。 ADS-21树脂氢键型极性吸附树脂，酰胺基聚苯乙烯结构 可与酚、多元酚、取代酚类和黄酮类化合物的羟基形成氢 键。对含有酸性酚羟基的化合物在酸性和弱碱性条件下均 能保持良好的吸附性能。 ADS-F8树脂凝胶氢键型极性吸附树脂，对黄酮类、多元 酚类有较高的吸附选择性。
剂化作用以及吸附剂的预处理、吸附剂的物理 状态
在选择吸附剂时，一般是根据吸附剂和被吸附 物质理化性质进行的。极性强的吸附剂易吸附 极性强的物质、非极性的吸附剂易吸附非极性 的物质。但是为了便于解吸附，分离弱极性的 组分选用极性强的吸附剂，分离极性较强的组 分应选用极性小的吸附剂。
常用的吸附剂有Al2O3，硅胶， 羟基磷灰石，聚酰胺等。
离子-偶极型吸附树脂
具有疏水性和离子偶极作用的双功能吸附树脂。 ADS-7，它为聚苯乙烯结构、强极性吸附树脂，用于 吸附皂甙或其它甙类。
特点是兼具吸附和脱色两种功能。
吸附树脂 AB-8
洗脱液色素吸光度 （420nm)
>1.0
甜菊甙纯度 (%)
80
ADS-7
<0.1
90
用于色层分离的选择性吸附树脂
在高浓度盐溶液中进行吸附常用水解吸。
常用的流动相按其极性增强顺序排列为:
石油醚 < 环己烷 < 二硫化碳 < 四氯化碳
<苯 <甲苯<氯仿<乙醚<乙酸乙脂<丙酮<正丙醇<
乙醇<甲醇<吡啶<酸。
在实践中一般从极性小到极性大溶剂，通过实 验来选择。
在选择洗脱剂时,还可以由各种 溶剂按不同配比配成混合溶剂作为 流动相；因此流动相的种类很多， 流动相的选择也就比固定相的选择 更为复杂。
混合物随流动相通过由吸附剂组成 的固定相时在固定相和流动相作用下发 生吸附、脱附、再吸附、再脱附的反复 过程。
1．原理
吸附层析是通过样品在固定相和流动相之间的 吸附、脱附作用而实现分离的，这种吸附作用 是一种物理吸附，通常是单分子层或双分子层 或多分子层。
包括几种作用力，被分离样品与吸附剂之间相 反电荷基团与基团之间的静电引力，氢键、偶 极分子之间定向力及范德华力等。
（4）聚酰胺
由己内酰胺聚合而成，层析用聚酰胺是白色 多孔性的非晶形粉末，对碱比较稳定，对酸的稳 定性较差。
聚酰胺分子内存在着很多的酰胺键，可与酚 类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键，因而 对这些物质有吸附作用。各种化合物因其与聚酰 胺形成氢键能力的不同，吸附能力也就不同，因 此可以得到分离。
一般讲来 ，具有以下规律：
（1）硅胶
硅胶是由聚硅酸脱水制得的颗粒状吸附剂
（2）氧化铝
Al2O3是由Al(OH)３脱水制得，Al2O3表面存在铝羟基Al－ ＯＨ，由于羟基的Ｈ键作用而能吸附其它物质。
Ａl2O3可分为中性、酸性、碱性三种。
中性氧化铝适用于醛、酮、酯、内酯化合物及某些苷的分离； 酸性氧化铝适用于酸性化合物，如酸性色素、某些氨基酸， 以及对酸稳定的中性物质的分离； 碱 性Ａl2O3适用于分离碱性化合物如生物碱、醇以及其它中 性和碱性物质。 一般讲，能用酸性或碱性氧化铝分离的物质 也可 用中性的氧化铝分离。 一般Ａl2O3用量为样品量的5～２０倍。
XAD-9
苯乙烯 苯乙烯 苯乙烯 α-甲基丙烯酸甲
酯 亚砜
二乙烯苯
非极性
二乙烯苯
非极性
二乙烯苯
非极性
双（α-甲基丙烯酸） 中极性 乙二醇酯
极性
XAD-10丙烯酰胺极性XAD-12
氧化氮类
强极性
Diaion 系列
HP-10
苯乙烯
二乙烯苯
非极性
HP-20
苯乙烯
二乙烯苯
非极性
HP-30
苯乙烯
二乙烯苯
非极性
吸附树脂是一种亲脂性物质，由于其表面性质 不同，可吸附溶液中的不同有机物，它的作用 力主要是范德华力，这种结合力比起静电引力 来要弱得多，所以说从吸附树脂上把被吸附物 解吸下来是比较容易的，只要改变其亲水-疏 水平衡即可。
单体
交联剂
极性
Amberlite
XAD-1 XAD-2 XAD-4 Xad-7
吸附剂的多孔结构，粒度和粒子形状是影响色 层系统特性的基本因素。
吸附剂一般可分为极性和非极性两类。
极性吸附剂包括氧化物、氢氧化物和盐，在吸
附过程中，离子与偶极、偶极与偶极的相互作 用起主导作用。
非极性吸附剂如活性碳，硅胶等，吸附作用主
要是色散力作用的结果。
影响吸附剂性质因素：化学结构、吸附剂的溶
在使用HA作为固定相基质时，有几点 应注意：
i) HA系干粉末时，要先在蒸馏水中浸泡，使其 膨胀度（水化后所占有的体积）达到2～ 3mL/g后，再按1:6体积加入缓冲液（如 0.01mol/L NaP(磷酸钠缓冲溶液)，PH6.8）悬 浮，以除去细小颗粒。
ii) HA悬浮液须用漩涡振荡器混合，若用磁棒 或玻璃棒搅拌时，HA的晶体结构会受破坏。