吸附层析
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第六章 层析技术
常用术语
固定相：是由层析基质组成的，其基质包括固体
物质（如吸附剂、离子交换剂）和液体物质（如固 定在纤维素或硅胶上的溶液），这些物质能与相关 的化合物进行可逆的吸附、溶解和交换作用。
流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向 一定方向移动的液体或气体称为流动相。在柱层 析时，流动相又称洗脱液或洗涤剂。在薄层层析 时流动相又称展层剂。
几个概念
吸附剂 吸附剂的选择主要依据吸附剂本身和被吸附物
质的极性，为活性多孔固体，表面积大、颗粒均 匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。
常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基 磷灰石等。
• 羟基磷灰石（HA）[Ca10(PO4)6.(OH)2]
表面有Ca2+和PO43-两种带电基团。酸性和中性蛋 白质可与Ca2+结合，碱性蛋白质可与PO43-结合。
*气体作为流动相
*吸附在固体上的液体为固定相
按两相所处的状态分为： 液相色谱 液-固层析 液-液层析 气相色谱 气-固层析 气-液层析
（2）按层析原理分类
吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶排阻层析
（3）按操作形式不同分类：
柱层析
纸层析
薄层层析
Liquid Chromatography
突出贡献: 预测气相色谱(1952年应用);提出用细小颗粒 作填料,而两端可以加压(HPLC).
1952年：马丁，辛格对分配层析的研究和发现， 诺贝尔化学奖
1952年，马丁同詹姆斯(James)一起，把分配层析应 用在分离气体上。各种气体或蒸汽的混合物可以利用氮 或氦一类情性载气的气流通过吸收性固体的表面。混合 的气体通过后，在另一端实现分离。
洗脱体积（Ve）：
是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度 达到最大值时的流动相体积。
薄层色谱法详解
黏合剂及添加剂：为了使固定相(吸附剂)牢固地附着在载板上以增加薄层的机械强度，有利于操作，需要时在吸附剂中加入合适的黏合剂：有时为了特殊的分离或检出需要，要在固定相中加入某些添加剂。
薄层板的活化：硅胶板于105-110℃烘30分钟，氧化铝板于150-160℃烘4小时，可得活性的薄层板。
点样
点样
点样方式：分为手动点样和自动点样。手动点样主要器具为微量毛细管、微量注射器等。自动点样采用半自动点样仪或全自动点样仪，按预设程序自动点样。手动点样灵活方便，常用于各种TCL鉴别中，器具以微量毛细管最常用。仪器的自动点样准确性好，常用于薄层扫描法的含量测定。
影响展开的因素
制备离心色谱仪
A相对湿度的影响
B溶剂蒸汽的影响(a展开室的饱和b预吸附)
C温度的影响
D展距的影响与分离度仅正比与展距的平方根
显色
A光学检出法
a自然光(400~800nm)
b紫外光(254nm或365nm)
c荧光一些化合物吸收了较短波长的光，在瞬间发射出比照射光波长更长的光，而在纸或薄层上显出不同颜色的荧光斑点(灵敏度高、专属性高)
B蒸汽显色法
显色
多数有机化合物吸附碘蒸气后显示不同程度的黄褐色斑点，这种反应有可逆及不可逆两种情况，前者在离开碘蒸气后，黄褐色斑点逐渐消退，并且不会改变化合物的性质，且灵敏度也很高，故是定位时常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸气氧化、脱氢增强了共轭体系，因此在紫外光下可以发出强烈而稳定的荧光，对定性及定量都非常有利，但是制备薄层时要注意被分离的化合物是否改变了原来的性质。
显色方法a喷雾显色：显色剂溶液以气溶胶的形式均匀的喷洒在纸和薄层。b浸渍显色：挥去展开剂的薄层板，垂直的插入盛有展开剂的浸渍槽中，设定浸板及抽出速度和规定在显色剂中浸渍的时间。
薄层板的活化：硅胶板于105-110℃烘30分钟，氧化铝板于150-160℃烘4小时，可得活性的薄层板。
点样
点样
点样方式：分为手动点样和自动点样。手动点样主要器具为微量毛细管、微量注射器等。自动点样采用半自动点样仪或全自动点样仪，按预设程序自动点样。手动点样灵活方便，常用于各种TCL鉴别中，器具以微量毛细管最常用。仪器的自动点样准确性好，常用于薄层扫描法的含量测定。
影响展开的因素
制备离心色谱仪
A相对湿度的影响
B溶剂蒸汽的影响(a展开室的饱和b预吸附)
C温度的影响
D展距的影响与分离度仅正比与展距的平方根
显色
A光学检出法
a自然光(400~800nm)
b紫外光(254nm或365nm)
c荧光一些化合物吸收了较短波长的光，在瞬间发射出比照射光波长更长的光，而在纸或薄层上显出不同颜色的荧光斑点(灵敏度高、专属性高)
B蒸汽显色法
显色
多数有机化合物吸附碘蒸气后显示不同程度的黄褐色斑点，这种反应有可逆及不可逆两种情况，前者在离开碘蒸气后，黄褐色斑点逐渐消退，并且不会改变化合物的性质，且灵敏度也很高，故是定位时常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸气氧化、脱氢增强了共轭体系，因此在紫外光下可以发出强烈而稳定的荧光，对定性及定量都非常有利，但是制备薄层时要注意被分离的化合物是否改变了原来的性质。
显色方法a喷雾显色：显色剂溶液以气溶胶的形式均匀的喷洒在纸和薄层。b浸渍显色：挥去展开剂的薄层板，垂直的插入盛有展开剂的浸渍槽中，设定浸板及抽出速度和规定在显色剂中浸渍的时间。
吸附层析法
化学分离分析 ——吸附色层法
②组：
2014年8月1日星期五
色层分析法
第1页
一．吸附层析
（adsorption chromatography）
1.原理 2.吸附剂的类型及其选择 3.流动相及其选择
吸附
指在固体或液体内部或表面的选择性传递。 被吸附的物质称为溶质，固体材料称为吸附剂。
图15.1
吸附层析
一般Ａl2O3用量为样品量的5～２０倍。
活度级别
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
含水量（%）
Al2O3 ０ ３ ６ １０ １５ 硅胶 ０ ５ １５ ２５ ３８
（3）羟基磷灰石
化学式[Ca5(PO4)3OH]2，简称HA。HA有三种规 格，分别适用于不同条件。由于HA的吸附容量 高，稳定性好（在T<85℃，PH5.5~10.0均可使 用）。 HA的Ca2＋基团和生物表面的负电荷基团的相 互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要 的作用。HA的PO43-基团与生物分子表面的阳 电荷基团的相互反应，起着次要的作用。
硅胶是由聚硅酸脱水制得的颗粒状吸附剂
（2）氧化铝
Al2O3是由Al(OH)３脱水制得，Al2O3表面存在铝羟基Al－ ＯＨ，由于羟基的Ｈ键作用而能吸附其它物质。 Ａl2O3可分为中性、酸性、碱性三种。 中性氧化铝适用于醛、酮、酯、内酯化合物及某些苷的分离； 酸性氧化铝适用于酸性化合物，如酸性色素、某些氨基酸， 以及对酸稳定的中性物质的分离； 碱 性Ａl2O3适用于分离碱性化合物如生物碱、醇以及其它中 性和碱性物质。 一般讲，能用酸性或碱性氧化铝分离的物质 也可 用中性的氧化铝分离。
乙烯、吡啶
含氮极性化合物 带强极性基团 苯酚甲醛缩合物 苯乙烯
二乙烯苯
二乙烯苯 二乙烯苯
②组：
2014年8月1日星期五
色层分析法
第1页
一．吸附层析
（adsorption chromatography）
1.原理 2.吸附剂的类型及其选择 3.流动相及其选择
吸附
指在固体或液体内部或表面的选择性传递。 被吸附的物质称为溶质，固体材料称为吸附剂。
图15.1
吸附层析
一般Ａl2O3用量为样品量的5～２０倍。
活度级别
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
含水量（%）
Al2O3 ０ ３ ６ １０ １５ 硅胶 ０ ５ １５ ２５ ３８
（3）羟基磷灰石
化学式[Ca5(PO4)3OH]2，简称HA。HA有三种规 格，分别适用于不同条件。由于HA的吸附容量 高，稳定性好（在T<85℃，PH5.5~10.0均可使 用）。 HA的Ca2＋基团和生物表面的负电荷基团的相 互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要 的作用。HA的PO43-基团与生物分子表面的阳 电荷基团的相互反应，起着次要的作用。
硅胶是由聚硅酸脱水制得的颗粒状吸附剂
（2）氧化铝
Al2O3是由Al(OH)３脱水制得，Al2O3表面存在铝羟基Al－ ＯＨ，由于羟基的Ｈ键作用而能吸附其它物质。 Ａl2O3可分为中性、酸性、碱性三种。 中性氧化铝适用于醛、酮、酯、内酯化合物及某些苷的分离； 酸性氧化铝适用于酸性化合物，如酸性色素、某些氨基酸， 以及对酸稳定的中性物质的分离； 碱 性Ａl2O3适用于分离碱性化合物如生物碱、醇以及其它中 性和碱性物质。 一般讲，能用酸性或碱性氧化铝分离的物质 也可 用中性的氧化铝分离。
乙烯、吡啶
含氮极性化合物 带强极性基团 苯酚甲醛缩合物 苯乙烯
二乙烯苯
二乙烯苯 二乙烯苯
第3章 吸附层析
现代色谱分析包括GC、HPLC、SFC、HPTLC、CE
及联用技术。
色谱常用术语
1．固定相
固定相是由层析基质组成的。 固定相是由层析基质组成的 。 其基质包括固体物 质 ( 如吸附剂、离子交换剂)和液体物质(如固定在纤 如吸附剂、 离子交换剂) 和液体物质( 维素或硅胶上的溶液) 维素或硅胶上的溶液 ) ， 这些物质能与相关的化合物 进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。 进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。
分配系数是广义的， 包括溶解、 吸附、 ▲ 分配系数是广义的 ， 包括溶解 、 吸附 、 离 子交换、亲和力和分子体积等分离特性。 子交换、亲和力和分子体积等分离特性。 ▲ 物质能否分离取决于它们之间是否存在分配 差异，这是一切分离的必要条件， 差异 ， 这是一切分离的必要条件 ， 色谱也不能 例外。 例外。 ▲与其它分离法相比，色谱法的高效率在于独 与其它分离法相比， 特的“ 动态分离过程” 即反复多次分配， 特的 “ 动态分离过程 ” ， 即反复多次分配 ， 它大大扩大了原来分配系数的差异， 它大大扩大了原来分配系数的差异，从而实现 混合物的分离。 混合物的分离。
2．流动相
在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移 动的液体或气体称为流动相。在柱层析时， 动的液体或气体称为流动相。在柱层析时，流动相又 称洗脱剂或洗涤剂( 称洗脱剂或洗涤剂 ( 即推动有效成分或杂质向一定方 向移动的溶液) 在薄层层析时流动相又称展层剂。 向移动的溶液)。在薄层层析时流动相又称展层剂。
Horvvath(1967) 、 Huber(1967) 、 Kirkland(1969) 分 Horvvath(1967) Huber(1967) Kirkland(1969) 1967 1967 1969 高效液相色谱仪， 别研制高效液相色谱仪 别研制高效液相色谱仪，他们的主要贡献主要是技术上 的突破： 的突破： 高效填料：细颗粒、耐压； ▲ 高效填料：细颗粒、耐压；特别是键合固定相 高压泵:克服细填料带来的流速慢的缺点， ▲ 高压泵:克服细填料带来的流速慢的缺点，加快了 传质过程 仪器检测： ▲ 仪器检测：高灵敏度连续检测 高效液相色谱的重要特征是由“开放柱液相色谱 液相色谱” 高效液相色谱的重要特征是由“开放柱液相色谱” 密闭柱液相色谱 方向发展。 液相色谱” 向“密闭柱液相色谱”方向发展。 1975年 Baumen发表 发表“ 1975年，Small, Stevens 和Baumen发表“Novel Ion Exchange Chromatographic Method Using Detection” 一文，采用离子抑制柱Conductimetric Detection 一文，采用离子抑制柱离子色谱法的诞生 电导检测器检测，标志着离子色谱法的诞生。 电导检测器检测，标志着离子色谱法的诞生。
层析分离技术二吸附层析
凉干，120℃烘干12小时即可重新使用。
羟基磷灰石的再生 用0.4MpH6.8的PBS缓冲液洗柱至平衡即
可重新使用。
四、吸附层析工艺
固定床吸附 流化床吸附 膨胀床吸附 移动床吸附
1、固定床吸附
吸附柱内填充固相吸附介质，含目标产物的料液输入吸附 柱，流经吸附剂后，溶质被吸附剂吸附。
料液
液泵
吸
分析仪
适应条件：在低浓度范围之内 成立。当浓度较高时，吸附平衡常 呈非线性，上式无效。
（2）Freundlich 型吸附平衡
其经验公式为
q* kc1/n
其中，k和n为常数，n一 般在1-10之间。
Freundlich 等 温 线 可 描 述大多数抗生素、类固醇、 甾类激素等在溶液中的吸附 过程。
（3）Langmuir型吸附平衡
应停止进料吸附操作，顺次 转入杂质清洗、吸附溶质洗
脱和吸附剂再生操作。
活化： 110℃烘烤0.5~1h。活化后立即使用或短期贮存与干燥器中
要想分离物质重复性好，每次所用的硅胶活性必须一致。 活性测定习惯采用6种染料进行。
1．偶氮苯；2．对甲氧基偶氮苯；3．苏丹黄； 4．苏丹红；5．对氨基偶氮苯； 6．对羟基偶氮苯。
原理：在吸附柱上，因吸附剂对6种染料吸附的能力不同，所以它们经洗脱 后的位置不同，借此即可测定吸附剂的活性级别。 具体操作是：取上述6种染料各20mg溶于l0ml苯溶剂中，加50ml石油醚稀释， 然后取20ml此溶液加到1.5cm×l0cm的硅胶柱上，再加20ml苯与石油醚(1：4) 的混合液进行冲洗，洗毕根据各种染料的位置，找出硅胶的活性级别。
注：吸附剂表面要平整，应一直浸泡在溶剂液面以下，严 防产生气泡。湿法装柱均匀，不易留有气泡
羟基磷灰石的再生 用0.4MpH6.8的PBS缓冲液洗柱至平衡即
可重新使用。
四、吸附层析工艺
固定床吸附 流化床吸附 膨胀床吸附 移动床吸附
1、固定床吸附
吸附柱内填充固相吸附介质，含目标产物的料液输入吸附 柱，流经吸附剂后，溶质被吸附剂吸附。
料液
液泵
吸
分析仪
适应条件：在低浓度范围之内 成立。当浓度较高时，吸附平衡常 呈非线性，上式无效。
（2）Freundlich 型吸附平衡
其经验公式为
q* kc1/n
其中，k和n为常数，n一 般在1-10之间。
Freundlich 等 温 线 可 描 述大多数抗生素、类固醇、 甾类激素等在溶液中的吸附 过程。
（3）Langmuir型吸附平衡
应停止进料吸附操作，顺次 转入杂质清洗、吸附溶质洗
脱和吸附剂再生操作。
活化： 110℃烘烤0.5~1h。活化后立即使用或短期贮存与干燥器中
要想分离物质重复性好，每次所用的硅胶活性必须一致。 活性测定习惯采用6种染料进行。
1．偶氮苯；2．对甲氧基偶氮苯；3．苏丹黄； 4．苏丹红；5．对氨基偶氮苯； 6．对羟基偶氮苯。
原理：在吸附柱上，因吸附剂对6种染料吸附的能力不同，所以它们经洗脱 后的位置不同，借此即可测定吸附剂的活性级别。 具体操作是：取上述6种染料各20mg溶于l0ml苯溶剂中，加50ml石油醚稀释， 然后取20ml此溶液加到1.5cm×l0cm的硅胶柱上，再加20ml苯与石油醚(1：4) 的混合液进行冲洗，洗毕根据各种染料的位置，找出硅胶的活性级别。
注：吸附剂表面要平整，应一直浸泡在溶剂液面以下，严 防产生气泡。湿法装柱均匀，不易留有气泡
常用的层析分析方法
常用的层析分析方法在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。
一、吸附层析1、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。
这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
3、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。
这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。
层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。
因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
二、离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。
离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
`三、凝胶过滤凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。
当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
四、亲和层析亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。
正如在酶与底物的反应中，特异的废物(S')才能和一定的酶(E)结合，产生复合物(E－S')一样。
在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。
而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体(类似底物)是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。
实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。
层析分离技术二吸附层析
PART 05
吸附层析的优缺点
优点
高选择性
吸附层析法可以选择性地分离和纯 化目标物质，对于特定结构和性质
的化合物具有较高的分离效果。
操作简便
吸附层析的操作相对简单，只 需选择合适的吸附剂填充到层 析柱中，然后进行洗脱即可。
适用范围广
吸附层析可以用于分离各种类 型的化合物，包括有机物、无 机物和生物大分子等。
分离效果好
吸附层析的分离效果较好，能 够实现高纯度物质的分离和纯
化。
缺点
吸附剂选择限制 吸附层析的成功与否很大程度上 取决于吸附剂的选择，有时需要 针对特定化合物进行筛选和制备。
操作压力大 在吸附层析过程中，由于需要较 高的操作压力来推动流动相通过 层析柱，可能会导致柱床的压实 和分离效果的降低。
填充介质
将吸附剂填充到柱子中，确保填充均匀、紧密， 无气泡和间隙。
柱子压力
控制柱子的压力，确保介质填充稳定，避免介质 流失或压实。
上样
01
02
03
样品的准备
将待分离的样品进行适当 处理，如溶解、稀释、离 心等，确保样品适合上样。
上样方式
选择合适的上样方式，如 直接上样、分批上样或连 续上样，确保样品与吸附 剂充分接触。
引言
层析分离技术的概述
01
层析分离技术是一种基于不同物 质在固定相和流动相之间分配平 衡的差异，从而实现混合物中各 组分分离的物理化学分离方法。
02
该技术广泛应用于生物、医药、 食品、化工等领域，用于分离纯 化各类生物分子、有机化合物和 无机离子等。
吸附层析的原理和应用
吸附层析的原理是利用固体吸附剂对不同组分 吸附能力的差异，通过流动相的洗脱实现各组 分的分离。
层析(包括：吸附层析、分配层析、离子交换层析、亲和层析等)
32
几个概念：
外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积 、洗脱体积
33
对某物质在凝胶柱 内洗脱体积Ve、Vo和 Vi之间的关系可用下 式表示：
Ve＝Vo＋Kd.Vi
可改写为：
（Ve-Vo） Kd = －－－－
Vi
34
当Kd＝0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子质量大，完 全不能进入凝胶颗粒微孔内，被排阻于凝胶颗粒之外而最先 洗脱下来；
14
迁移率
迁移率（ Rf或比移值）是指：在一定条件下，在 相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流 动相本身移动的距离之比值 。常用Rf来表示
实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率 是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在 固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移 动的距离之比 值。常用Rx来表示
27
像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉 ，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在溶剂 中能自动溶胀成胶。
根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可 分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表 示，从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P后面的阿拉伯 数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）， 所以数字越大，可分离的分子量也就越大目前。
3
4、按照不同的标准层析法有不同的分类。 根据层析峰的位置及峰高或峰面积,可以定 性及定量。层析法与光学、电学或电化学 仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度 或质量，同时绘出层析图。层析仪与电子 计算机联用，可使操作及数据处理自动化 ，大大缩短分析时间。
4
5、由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好 、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂 样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。近年来 ，已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在 医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面 也得到了广泛的应用。
几个概念：
外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积 、洗脱体积
33
对某物质在凝胶柱 内洗脱体积Ve、Vo和 Vi之间的关系可用下 式表示：
Ve＝Vo＋Kd.Vi
可改写为：
（Ve-Vo） Kd = －－－－
Vi
34
当Kd＝0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子质量大，完 全不能进入凝胶颗粒微孔内，被排阻于凝胶颗粒之外而最先 洗脱下来；
14
迁移率
迁移率（ Rf或比移值）是指：在一定条件下，在 相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流 动相本身移动的距离之比值 。常用Rf来表示
实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率 是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在 固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移 动的距离之比 值。常用Rx来表示
27
像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉 ，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在溶剂 中能自动溶胀成胶。
根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可 分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表 示，从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P后面的阿拉伯 数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）， 所以数字越大，可分离的分子量也就越大目前。
3
4、按照不同的标准层析法有不同的分类。 根据层析峰的位置及峰高或峰面积,可以定 性及定量。层析法与光学、电学或电化学 仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度 或质量，同时绘出层析图。层析仪与电子 计算机联用，可使操作及数据处理自动化 ，大大缩短分析时间。
4
5、由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好 、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂 样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。近年来 ，已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在 医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面 也得到了广泛的应用。
第三章 吸附层析
吸附：在低盐浓度下进行。 洗脱：在高盐浓度中进行（缓冲液） 主要分离因素：HA的Ca 2+对溶质表面的负电荷基 团的作用； 次要分离因素：HA的磷酸基团对溶质表面的正电荷 基团的作用；
吸附层析
硅胶
含水量越高，吸附力越小。 活化：110°C烘箱，1hr。
吸附层析
洗脱剂的选择
选择洗脱剂顺序：极性小到极性大； 浓度低到高。 生物大分子一般以中性盐溶液洗脱； 洗脱剂强弱决定于：极性、离子强度。
吸附层析
本章小结
吸附层析原理：通过吸附剂表面与被分离物质之间 的范德华力和静电引力的大小不同，来达到分离 的目的。 结合力的大小由被分离物质的性质、吸附剂的性质 决定。
吸附层析
吸附原则： 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质； 非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。
吸附层析
羟基磷灰石（HA) 羟基磷灰石（HA)
吸附层析
迁移率（Rf)：一组分在相同时间内，在固定相与流 动相的移动距离之比。
吸附层析
1.2 基本原理
通过吸附剂表面与被分离物质之间的范德华力和静 电引力的大小不同，来达到分离的目的。
吸附层析
1.3 吸附剂
1) 应具备的性能： 表面积大； 颗粒均匀； 选择性好； 稳定性强； 成本低。
吸附层析
2) 吸附原则： 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质； 3)预处理： 过筛－－－酸、碱浸泡－－－沸水煮－－－清水洗 －－－有机溶剂处理（无杂质）
吸附层析
活性碳
1) 制备：动物碳、植物碳、矿物碳 2) 特性：水中吸附力最强；
酸性环境中吸附力强，pH>6.8时，吸附力差。
吸附层析
1.4 洗脱剂
要求：纯度高、稳定性好、洗脱力强、粘度 小、易与被分离物分开。
吸附层析
硅胶
含水量越高，吸附力越小。 活化：110°C烘箱，1hr。
吸附层析
洗脱剂的选择
选择洗脱剂顺序：极性小到极性大； 浓度低到高。 生物大分子一般以中性盐溶液洗脱； 洗脱剂强弱决定于：极性、离子强度。
吸附层析
本章小结
吸附层析原理：通过吸附剂表面与被分离物质之间 的范德华力和静电引力的大小不同，来达到分离 的目的。 结合力的大小由被分离物质的性质、吸附剂的性质 决定。
吸附层析
吸附原则： 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质； 非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。
吸附层析
羟基磷灰石（HA) 羟基磷灰石（HA)
吸附层析
迁移率（Rf)：一组分在相同时间内，在固定相与流 动相的移动距离之比。
吸附层析
1.2 基本原理
通过吸附剂表面与被分离物质之间的范德华力和静 电引力的大小不同，来达到分离的目的。
吸附层析
1.3 吸附剂
1) 应具备的性能： 表面积大； 颗粒均匀； 选择性好； 稳定性强； 成本低。
吸附层析
2) 吸附原则： 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质； 3)预处理： 过筛－－－酸、碱浸泡－－－沸水煮－－－清水洗 －－－有机溶剂处理（无杂质）
吸附层析
活性碳
1) 制备：动物碳、植物碳、矿物碳 2) 特性：水中吸附力最强；
酸性环境中吸附力强，pH>6.8时，吸附力差。
吸附层析
1.4 洗脱剂
要求：纯度高、稳定性好、洗脱力强、粘度 小、易与被分离物分开。
吸附层析法柱层析法
检测器
五、高效液相层析
• 正相层析法：固定相极性大于流动相极性 • 正相层析由于极性化合物更容易被极性固定相所保留 • 正相层析流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。 • 正相层析法一般可用于分离纯化极性大的分子，如磷脂、
甾体化合物、脂溶性维生素、前列腺素等
五、高效液相层析
• 反相层析法：流动相极性大于固定相极性 • 反相层析流出顺序极性大的先流出，极性小的后流出，
分离的目的。
收集不同的组分
二、离子交换层析法测定氨基酸
测定洗脱液吸光度即可绘得洗脱曲线 此计算出该蛋白质中各种氨基酸的含量 从洗脱峰的位置来判断属于哪一种氨基酸 氨基酸分析仪就是根据这个原理设计制造的自 动化分析仪
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氨基酸 混合样
品
阳离子 交换树
脂
阳性离子交换树脂分离氨基酸
洗脱
控制洗脱液的流量
固定相固定相碳酸钙碳酸钙流动相流动相石油醚石油醚michaeltswett1872michaeltswett187219191919columnchromatographycolumnchromatography这是利用色谱法探究生命的启蒙和开端这是利用色谱法探究生命的启蒙和开端之之后后2020多年无人关注这一伟大发明多年无人关注这一伟大发明19311931年德国库恩重复茨维特实验并分离年德国库恩重复茨维特实验并分离6060多种色素多种色素19381938年从年从vbvb中分离中分离b6b6出色的研究获得出色的研究获得19381938年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖19411941年英国生物化学家马丁发展了色谱技术发现了液年英国生物化学家马丁发展了色谱技术发现了液液液即分配色谱法即分配色谱法预测并实现气相色谱技术预测并实现气相色谱技术19521952年将色谱技术原理应用到分离年将色谱技术原理应用到分离气体上混合气体通过后在另一端出现时得以分离气体上混合气体通过后在另一端出现时得以分离2020世纪世纪6060年代普通色年代普通色谱法已经不能满足人们对谱法已经不能满足人们对生物成分分析测试的要求生物成分分析测试的要求高效液相色谱高效液相色谱highhighperformanceliquidperformanceliquidchromatographychromatography即即hplchplc特别适用于高沸点特别适用于高沸点不能气化或热稳定性不能气化或热稳定性差的有机物分离分析差的有机物分离分析生物化学与分子生物生物化学与分子生物学中的应用日益广泛
吸附层析法
Lewapol G7318
苯乙烯
二乙烯苯 二乙烯苯 二乙烯苯 二乙烯苯 二乙烯苯 二乙烯苯
极性 非极性 非极性 非极性 强极性 极性 强极性 极性 非极性
孔径 比表面m2/g 600-700 400-500 590 370 80 90 128 42
吸附树脂在中药提取分离中的发展和应用
中药提取液－通过吸附树脂－吸附上有效成分的树脂 －洗脱－洗脱液－回收溶液－药液－干燥－半成品
强极性的组分容易被吸附剂所吸附， 应选用极性较强的流动相才能把它从吸 附剂上洗脱下来，使之沿着层析柱前进；
弱极性的组分则应选用弱极性的流 动相洗脱。
以聚酰胺为吸附剂时,一般用水作流动相。
以吸附树脂为吸附剂时，由于分子间吸附 力较弱，可用低级醇、酮或其水溶液洗脱。
原则：
弱酸性物质在酸性下吸附，碱性下洗脱；弱碱 性物质在碱性下吸附，酸性下洗脱。
吸附等温线：在一定温度下，某种组分在
吸附剂表面达平衡状态时在两相中浓度的相对 关系曲线。
吸附等温线的斜率KD表示分配系数，Cs表 示溶质在固定相中的浓度，Cm表示溶质在流动 相中的浓度达到平衡时在固定相中的浓度
线形的吸附等温线 非线形的吸附等温线
2．吸附剂的选择
高选择性以实现很好分离； 高容量以减少吸附剂的使用量； 对于快速吸剂具有很好的动力学和传递特性； 具有化学和热稳定性，在流动相中不溶解以保持吸附剂特性； 具有一定的机械强度和惰性，防止破碎和腐蚀； 易于充填或铺层； 不会与欲分离试样和流动剂发生化学反应； 抗污染性强； 价格便宜。
iii)忌用柠檬酸缓冲液和PH<5.5的缓冲液。当用过 的HA层析柱再生时，要先挖去顶部的一层HA，然 后用一倍床体积1mol/LNaCl溶液洗涤，接着用4倍 床体积的平衡液洗涤平衡，如此处理后即可使用。
第三章-吸附层析
吸附层析的概念
吸附层析（absorption chromatography）又 称色层法或色谱法；是根据各种被分离组分在固 定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的一 类分离纯化方法。
教学目的
掌握基本原理和操作方法 吸附柱层析 薄层层析 聚酰胺薄层层析
层析方法的类型
第一节 吸附柱层析
吸附柱层析的概念
第三章 吸附层析
层析又称为色谱或色层，是俄国植物学家茨维 特在分离植物色素时发现并最先应用的一种分离 纯化方法。其总的原理是根据各种被分离组分在 固定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的。
层析法根据层析类型分，可分为柱层析、纸层析和 薄层层析；根据具体分离原理分，可分为吸附层析、分 配层析、疏水层析、离子交换层析、亲和层析、凝胶过 滤层析等具体层析方法
②将收集的每管溶液进行浓缩和活性测定。以管号或洗脱体积 为横坐标，每管样品的浓度或活度为纵坐标，若层析峰无重叠， 则各成分能完全分离（图3-7）
③为了获得满意分离效果，洗脱速度恰当控制（若太快，洗脱 物在两相中平衡不完全；太慢，则洗脱物会扩散；结果都会导 致分离度下降）
④分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定及保存
第三节 聚酰胺薄膜层析
一、聚酰胺薄膜层析的概念
聚酰胺薄膜层析是1966年之后发展起来的一种层析方 法。特别应指出的是，用此法分析氨基酸衍生物DNP-氨基 酸、PTH-氨基酸、DNS-氨基酸以及DABTH-氨基酸1）时， 具有灵敏度高、分辨力强、展层迅速和操作简便等优点， 它超过了这类化合物过去使用的纸层析、纸电泳和薄层层 析(茚三酮法)等方法
➢HA为干粉时，需事先浸泡膨胀达到2~3ml/g后，按1∶6加 入缓冲液悬浮，除去细小的颗粒
➢HA悬浮液需用旋涡振荡器混合，因为其他搅拌器如磁棒、 玻棒等易破坏其晶体结构
吸附层析
吸附剂的分类
常用的吸附剂有：极性吸附剂和非极性吸附剂两 种 。 极性吸附剂：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造 沸石等。 非极性吸附剂：主要是活性炭。
1.1几种极性吸附剂的简要介绍
(1)硅胶 硅胶是应用最广泛的一种极性吸附剂，具有多孔性网状 结构，它的主要优点是化学惰性，具有较大的吸附量，容 易制备不同类型，孔径，表面积的多孔性硅胶。 硅胶的吸附能力与吸附物的性质有关，硅胶能吸附非极 性化合物，也能吸附极性化合物，对极性化合物的 吸附能 力更大。硅胶的吸附能力与其本身的含水量密切相关，硅 胶吸附活性随含水量的增加而降低，当含水量小于1%时， 活性最高，而当含水量大于20%时，硅胶的吸附活性最低。 硅胶表面上带有大量的羟基，有很强的亲水性，能吸附 多量水分，因此硅胶一般于105～110摄氏度活化1～2小时后 使用，活化后的硅胶应马上使用。
4、应用
4.1纯化生命物质
使用吸附剂的柱层析或分批吸附法(见实例1)可纯
化生命物质。
如用羟基磷灰石吸附剂能把酸性、中性和碱性蛋 白质分开，也能把不同结构的核酸分开(见图3-8)。 用该吸附剂分离含不同磷酸基团的蛋白质和脂类 等化合物也是有效的。
4.2 分离蛋白质的亚基
一般蛋白质经SDS(十二烷基硫酸钠)或Triton X100(聚氧乙基十六烷基酚醚)等去污剂处理后，会产生 分子质量不同的蛋白质亚基。
(按体积或时间分管收集)。 随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定 。
3.3绘制出洗脱曲线，以每管溶液中样品的浓
度或活性为纵坐标)。 理想的洗脱曲线如图3-7所示。 图中的A峰和B峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明 样品液中的组分已完全分开。 层析峰的面积(EFG)、峰高(BE)和半峰高的宽度(HI)等参 数是定性、定量洗脱物的依据。
吸附层析
吸附层析离物与吸附剂 之间吸附力不同而达到分离目的的一种层 析技术。
吸附剂的选择
• 羟基磷灰石 HA----[Ca5(PO4)3OH]2 Ca基团起主要作用, PO4起次要作用 • 硅胶 -Si-OH基团起主要作用,含水量影响其结合 力
流动相的选择
• 极性溶液:水、稀酸、稀碱、缓冲液、乙醇、 甲醇 • 非极性溶液：丙酮、苯、氯仿、正丁醇 • 柱层析:洗脱剂 • 薄层层析:展层剂
柱层析操作
⑴ 装柱 ⑵ 平衡 ⑶ 加样 ⑷ 洗脱 :可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度 洗脱三种。 ⑸ 收集、鉴定及保存 ⑹ 基质（吸附剂）的再生
薄层层析操作
⑴ 薄层的制备 ⑵ 活化 ⑶ 点样 ⑷ 展层 :注意展层剂的极性 ⑸ 展层图谱的分析:计算迁移率等
应用实例
吸附剂的选择
• 羟基磷灰石 HA----[Ca5(PO4)3OH]2 Ca基团起主要作用, PO4起次要作用 • 硅胶 -Si-OH基团起主要作用,含水量影响其结合 力
流动相的选择
• 极性溶液:水、稀酸、稀碱、缓冲液、乙醇、 甲醇 • 非极性溶液：丙酮、苯、氯仿、正丁醇 • 柱层析:洗脱剂 • 薄层层析:展层剂
柱层析操作
⑴ 装柱 ⑵ 平衡 ⑶ 加样 ⑷ 洗脱 :可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度 洗脱三种。 ⑸ 收集、鉴定及保存 ⑹ 基质（吸附剂）的再生
薄层层析操作
⑴ 薄层的制备 ⑵ 活化 ⑶ 点样 ⑷ 展层 :注意展层剂的极性 ⑸ 展层图谱的分析:计算迁移率等
应用实例
层析分离的基本原理
层析分离的基本原理层析分离的基本原理1. 层析分离的定义层析分离（Chromatographic Separation）是一种常用的物质分离技术，通过样品在固定或液相介质中的运动速度差异，使不同组分在给定条件下相互分离。
层析分离技术广泛应用于化学、生物、制药等多个领域。
2. 层析分离的主要原理层析分离的主要原理是基于分子在吸附剂上的相互作用，其中吸附质与固定相通过物理吸附或化学吸附相互作用，从而分离出不同成分。
3. 层析分离的基本步骤层析分离通常包括以下几个基本步骤：•样品加载：将待分离的样品溶液加载到固定相或液相上。
•洗涤：通过洗涤剂，去除样品中的杂质，使得目标物质更加纯净。
•洗脱：通过改变流动相组成或条件，使目标物质从吸附剂上脱附，实现分离。
•采集分离产物：脱附的目标物质被采集以获取纯净的样品。
4. 层析分离的分类根据分离介质的性质和相之间的联系，层析分离可分为多种类型，常见的包括：•吸附层析：通过目标物质与吸附剂的物理或化学吸附进行分离。
•离子交换层析：基于离子交换树脂对样品中的离子进行选择性吸附和释放。
•凝胶层析：利用凝胶材料对分子的尺寸选择性吸附和分离。
•气相层析：利用固定相和流动相的相互作用分离气体中的成分。
5. 层析分离的应用领域层析分离技术在众多领域中得到广泛应用，主要包括以下几个方面：•制药领域：用于药物的提取纯化、药效物质的分离等。
•化学领域：用于化学品的生产、分离和纯化。
•生物学领域：用于蛋白质、细胞等生物分子的分离和纯化。
•环境分析：用于环境样品中有害物质的分析和监测。
•食品安全：用于检验和分离食品中的添加物、残留物等。
6. 层析分离的优势和不足层析分离具有以下优势：•高效：能在短时间内分离和纯化目标物质。
•选择性强：能针对具体的目标物质进行选择性吸附和分离。
•可逆性：可通过调整条件实现目标物质的洗脱和重复利用。
然而，层析分离也存在一些不足之处：•对分子大小敏感：无法对相似大小的分子进行有效分离。
7.吸附层析
由酰胺聚合而成的高分子物质，常用的是 酰胺聚合而成的高分子物质， 聚合而成的高分子物质 聚己内酰胺。 聚己内酰胺。 分子内存在的酰胺基 可与酚、 酰胺基， 分子内存在的酰胺基，可与酚、酸、硝基 化合物、醌类等形成氢键 氢键， 化合物、醌类等形成氢键，从而产生吸附 作用。 作用。 可分离极性和非极件物质，尤其是对黄酮、 可分离极性和非极件物质，尤其是对黄酮、 酚类、醌类等物质的分离，远比其他方法 酚类、醌类等物质的分离， 优越。 优越。
用于分离水溶性物质。 用于分离水溶性物质。 水溶性物质 水溶液中的吸附力最强 中的吸附力最强， 在水溶液中的吸附力最强，在有机溶剂中 吸附力较弱。 吸附力较弱。 极性基团多的化合物的吸附力大于对 ①对极性基团多的化合物的吸附力大于对 极性基团少的化合物的吸附力。 极性基团少的化合物的吸附力。 芳香族化合物的吸附力大于对 化合物的吸附力大于对脂肪族 ②对芳香族化合物的吸附力大于对脂肪族 化合物的吸附力。 化合物的吸附力。 相对分子质量大的化合物的吸附力大 ③对相对分子质量大的化合物的吸附力大 于对相对分子质量小的化合物的吸附力。 于对相对分子质量小的化合物的吸附力。
装柱
①氧化铝 将溶剂倒入柱内， 将溶剂倒入柱内，同时将氧化铝慢慢地加 保持边沉降边添加，直至加完。 入，保持边沉降边添加，直至加完。加入 速度不宜太快，否则将带入气泡。 速度不宜太快，否则将带入气泡。氧化铝 的用量一般是样品量的20一50倍 的用量一般是样品量的20一50倍。 ②硅胶 采用湿法装柱， 采用湿法装柱，即将硅胶混悬于装柱溶剂 不断搅拌待气泡除去后， 中，不断搅拌待气泡除去后，连同溶剂一 次倾人色谱柱中。 次倾人色谱柱中。样品与吸附剂的比例可 30一 60。 为1：30一1：60。
常用的吸附剂： 常用的吸附剂： 氧化铝 硅胶 聚酰胺 活性炭 硅藻土 纤维素
常用的层析分析方法
常用的层析分析方法在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。
一、吸附层析1、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。
这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
3、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。
这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。
层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。
因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
二、离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。
离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
`三、凝胶过滤凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。
当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
四、亲和层析亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。
正如在酶与底物的反应中，特异的废物(S ‘)才能和一定的酶(E)结合，产生复合物(E－S‘)一样。
在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。
而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体(类似底物)是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。
实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。
吸附层析法
吸附层析法是一种分离和浓缩有机物的方法，常用于分析和浓பைடு நூலகம்有机溶剂中的有机物。该方法的基本原理是，有机物在固定相（吸附剂）的表面上吸附，而溶剂则穿过固定相流出。
吸附层析法的步骤如下：
1.准备吸附剂：选择适当的吸附剂，将其装入容器中。
2.溶解样品：将样品溶解在溶剂中，得到溶液。
3.进行吸附：将溶液流入容器中，让有机物在吸附剂的表面上吸附。
4.流出溶剂：将吸附剂上的溶剂流出，留下吸附的有机物。
5.解吸：使用适当的溶剂将吸附的有机物解吸出来。
吸附层析法具有分离效率高、适用于各种有机物、操作简单等优点，广泛应用于有机合成、分析化学、药物分析等领域。
吸附层析法的步骤如下：
1.准备吸附剂：选择适当的吸附剂，将其装入容器中。
2.溶解样品：将样品溶解在溶剂中，得到溶液。
3.进行吸附：将溶液流入容器中，让有机物在吸附剂的表面上吸附。
4.流出溶剂：将吸附剂上的溶剂流出，留下吸附的有机物。
5.解吸：使用适当的溶剂将吸附的有机物解吸出来。
吸附层析法具有分离效率高、适用于各种有机物、操作简单等优点，广泛应用于有机合成、分析化学、药物分析等领域。
层析柱和吸附柱
层析柱和吸附柱
层析柱（Column Chromatography）
层析柱是一种在化学实验室中常用的分离和纯化化合物的技术。
它利用化合物在固定相（例如硅胶或石英）和流动相（例如溶剂）之间的不同相互作用来进行分离。
在层析柱中，化合物混合物通过柱子底部注入，然后使用流动相逐渐通过柱子。
不同化合物由于相互作用类型和强度的不同，以不同速率通过柱子，从而实现了分离。
吸附柱（Adsorption Chromatography）
吸附柱是一种基于物质在固定相表面吸附和解吸的技术。
固定相通常是多孔的固体（例如硅胶或活性炭），它的表面具有许多吸附位置。
混合物样品通过柱子经过固定相，样品中的物质会在固定相的表面上吸附下来，从而实现了分离。
分离程度主要取决于样品中化合物和固定相之间的吸附力。
层析柱和吸附柱都是常用的分离技术，它们常用于分离和纯化化合物，例如有机合成产物或天然产物。
它们在化学研究、药物开发和分析实验室中广泛应用。
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具有硅氧交联结构，表面有许多硅醇基， 它能与极性化合物或不饱和化合物形成氢 键或发生其他形式的相互作用。 活性与含水量有关。水能与硅胶表面羟基 结合成水合硅醇基而使其失去活性。将硅 胶在105~110℃加热30min，则硅胶吸附力 增强，这一过程称为“活化”。 分离效率与其粒度、孔径及表面积有关 。 会与样品发生副反应，但分离效率差，对 杂质的吸附能力弱。 硅胶G、硅胶CMC、硅胶HF254、硅胶 GF254
根据要分离组分的性质（包括极性、酸 碱性）选择合适的固定相和流动相 吸附操作：选择合适的操作条件（温度、 pH值、流速），进行装柱、平衡、上样 洗脱：采用有机溶剂洗涤，逐步增加溶 剂的极性，最大限度地回收目标产物 吸附剂的再生
吸附剂的选择
①表面积大 ②在展开剂中不溶，对样品成分不起破坏或 分解作用 ③具有可逆的吸附性 ④白色的固体，便于观察
常用的吸附剂： 氧化铝 硅胶 聚酰胺 活性炭 硅藻土 纤维素
由氢氧化铝于400-500℃灼烧而成的，有 碱性（pH9-10）、中性（pH7.5）和酸性 （pH4-5）三种。 吸附机制是由于氧化铝表面存在铝醇基 （Al-OH），由于羟基的氢键作用而能吸 附其他物质。 活性和含水量密切相关。加热，除去水分 可使氧化铝的吸附能力增强，称为活化； 反之称为去活化或脱活性。 注意：有些化合物在氧化铝上会发生一些 如异构化、氧化、皂化、水合以及脱水形 成双键等副反应，不能采用氧化铝作吸附 剂。（黄酮、三萜） 氧化铝G、氧化铝H、氧化HF254。
由酰胺聚合而成的高分子物质，常用的是 聚己内酰胺。 分子内存在的酰胺基，可与酚、酸、硝基 化合物、醌类等形成氢键，从而产生吸附 作用。 可分离极性和非极件物质，尤其是对黄酮、 酚类、醌类等物质的分离，远比其他方法 优越。
活性炭一般分为三类： ①粉末状活性炭：比表面积最大，吸附力最 强，流速极慢。 ②颗粒状活性炭：比表面积小，吸附力弱， 但流速易于控制。 ③锦纶—活性炭：以锦纶为黏合剂，将粉末 状活性炭制成颗粒，比表面积介于前两者 之间，但其吸附力最弱。 强吸附剂，对气体的吸附力很大，150℃加 热4~5h除气体。
③活性炭 活性炭以蒸馏水浸泡1h左右，不断搅拌除 去气泡，然后倒入柱中，让其自然沉降。 ④聚酰胺 取聚酰胺粉以90％~95％乙醇浸泡，再根据 实验，用水或有机溶剂装柱。
加样
将样品溶于色谱开始使用的有机溶剂中， 轻轻注入已准备好的色谱柱上。 将样品溶于易溶的、易挥发的有机溶剂中， 以少量的吸附剂拌匀，然后将有机溶剂挥 发，再按上述方法装柱。
装柱
①氧化铝 将溶剂倒入柱内，同时将氧化铝慢慢地加 入，保持边沉降边添加，直至加完。加入 速度不宜太快，否则将带入气泡。氧化铝 的用量一般是样品量的20一50倍。 ②硅胶 采用湿法装柱，即将硅胶混悬于装柱溶剂 中，不断搅拌待气泡除去后，连同溶剂一 次倾人色谱柱中。样品与吸附剂的比例可 为1：30一1：60。
展开剂的选择
展开剂的选择应同时考虑被测物质的性质、 吸附剂的活性及展开剂的极性三个因素。 分离极性强的组分，选用活性低的吸附剂， 极性强的展开剂；分离极性弱的组分，选 用活性高的吸附剂，极性弱的展开利；中 等极性组分，采用中间条件分离。 展开剂选择的原则： ①对被分离组分应具有一定的解吸附能力 ②对被分离物质具有一定的溶解能力
用于分离水溶性物质。 在水溶液中的吸附力最强，在有机溶剂中 吸附力较弱。 ①对极性基团多的化合物的吸附力大于对 极性基团少的化合物的吸附力。 ②对芳香族化合物的吸附力大于对脂肪族化 合物的吸附力。 ③对相对分子质量大的化合物的吸附力大于 对相对分子质量小的化合物的吸附力。
一般吸附色谱的操作程序
吸附剂的再生
①氧化铝：用甲醇、稀醋酸、氢氧化钠及水 洗涤，再高温活化。 ②硅胶：用乙醇或甲醇洗涤，再高温活化。 ③聚酰胺：依次用2倍体积的5％NaOH溶液， 1倍体积的蒸馏水，2倍体积的10％醋酸洗 涤，最后用蒸馏水洗至中性备用。
Hale Waihona Puke