层析包括吸附层析分配层析离子交换层析亲和层析等详解演示文稿
第六章 层析技术
常用术语
固定相：是由层析基质组成的，其基质包括固体
物质（如吸附剂、离子交换剂）和液体物质（如固 定在纤维素或硅胶上的溶液），这些物质能与相关 的化合物进行可逆的吸附、溶解和交换作用。
流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向 一定方向移动的液体或气体称为流动相。在柱层 析时，流动相又称洗脱液或洗涤剂。在薄层层析 时流动相又称展层剂。
几个概念
吸附剂 吸附剂的选择主要依据吸附剂本身和被吸附物
质的极性，为活性多孔固体，表面积大、颗粒均 匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。
常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基 磷灰石等。
• 羟基磷灰石（HA）[Ca10(PO4)6.(OH)2]
表面有Ca2+和PO43-两种带电基团。酸性和中性蛋 白质可与Ca2+结合，碱性蛋白质可与PO43-结合。
*气体作为流动相
*吸附在固体上的液体为固定相
按两相所处的状态分为： 液相色谱 液-固层析 液-液层析 气相色谱 气-固层析 气-液层析
（2）按层析原理分类
吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶排阻层析
（3）按操作形式不同分类：
柱层析
纸层析
薄层层析
Liquid Chromatography
突出贡献: 预测气相色谱(1952年应用);提出用细小颗粒 作填料,而两端可以加压(HPLC).
1952年：马丁，辛格对分配层析的研究和发现， 诺贝尔化学奖
1952年，马丁同詹姆斯(James)一起，把分配层析应 用在分离气体上。各种气体或蒸汽的混合物可以利用氮 或氦一类情性载气的气流通过吸收性固体的表面。混合 的气体通过后，在另一端实现分离。
洗脱体积（Ve）：
是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度 达到最大值时的流动相体积。
03第三章_层析.ppt.Convertor
第三章层析概论一、层析以基质为固定相(柱状或薄层状)，以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。
目前，这种方法已作为纯化或鉴定各种化合物的一种重要手段。
1903年俄国植物学家茨维特首先将碳酸钙细粉装入玻璃管内使其成柱形，然后把石油醚抽提的植物色素溶液倾入，让其通过碳酸钙柱，接着用石油醚洗涤发现，各种色层彼此可分开，柱上端呈黄色，较下端呈绿色，这就是早期的吸附层析碳酸钙细粉植物色素溶液石油醚洗涤二、层析类型层析方法可根据不同的标准分成若干类型：按流动相分类：液相层析和气相层析；按固定相“床”的形式分类：柱层析、薄板(层)层析、薄膜层析等等，详见表3~1。
三、层析常用术语1．固定相固定相是由层析基质组成的。
其基质包括：固体物质(如吸附剂、离子交换剂)液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的溶液)，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。
2．流动相在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。
在柱层析时，流动相又称洗脱剂或洗涤剂(即推动有效成分或杂质向一定方面移动的溶液)。
在薄层层析时，流动相又称展层剂。
3．操作容量即在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量；一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。
(mmol/g, mg/g, mmol/ml, mg/ml)其数值大，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之。
4．床体积(Vt)通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积(Vt)。
Vt是基质的外水体积(V0)和内水体积(Vi)以及自身体积(Vg)的总和，即:Vt = V0+ Vi + Vg(详见图3-1)5．外水体积(V0)外水体积指基质颗粒之间体积的总和。
6．内水体积(Vi)内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。
7．基质体积(Vg)基质体积是指基质自身所具有的体积。
层析分离技术
4.2 吸附层析
吸附层析（Adsorption Chromatography ）是以吸附剂 为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而 达到分离目的的一种层析技术。
按吸附剂和吸附物之间的作用力不同，吸附可分为三 种类型： 物理吸附：范德华力，吸附解吸速度快，选择性较差 化学吸附：生成化学键，达到平衡慢，选择性较好 交换吸附：极性分子或离子之间发生交换吸附…….
的活性物质提取分离，如维生素B12、四环素、土霉 素等，还可用于污水处理、糖浆脱色等。
大孔吸附树脂的选择和使用
选择依据： 吸附剂及吸附物的极性
一般来说，非极性吸附剂易从极性溶剂中吸附非极性 物质；极性吸附剂易从非极性溶剂中吸附极性物质； 中等极性的吸附剂对上述两种情况都具有吸附能力。 吸附物质的大小 吸附物分子较大的，应选择大孔树脂中孔径大的。
常用吸附剂按其化学结构可分两类
有机吸附剂，如：活性炭、纤维素、大孔吸附 树脂、聚酰胺等
无机吸附剂，如：硅胶、氧化铝、硅酸镁、硅 藻土、羟基磷灰石等
常用吸附剂简介
硅胶 是一种极性吸附剂，又是一种弱酸性阳离子交换
剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子， 遇较强碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附 碱性化合物； 应用于萜类、固醇、生物碱、酸性化合物、磷脂、 脂肪、氨基酸等的吸附分离。
HA的吸附机理
HA机理的主要观点是：HA的Ca2+和生物分子表 面的负电荷基团的结合，对生物分子的分离起重 要作用；而HA的磷酸基团与生物分子表面的正 电荷基团的结合，则起次要作用。
大孔吸附树脂
特点 大孔型颗粒，其孔隙、骨架结构和极性可按需要选
第七章层析
tR′ = tR - t0 ⑥校正保留体积VR′ 扣除死体积后的保留体积称为校
正保留体积（或调整保留体积）；其定义式为：
VR′ = VR–V0
VR′与tR′之间的关系为：
VR′ = tR′ Fc
死体积V0反映了色谱柱的几何特性，它与被测物质的性
质无关。保留体积VR中扣除死体积V0后，即校正保留体积
VR′，将更合理地反映被测组分的保留特点。
第一节 层析的基本原理及分类
2．阻滞因数或比移值Rf
在色谱柱（纸、板）中，溶质的移动速度与流动相的移 动速度之比，称为阻滞因数或比移值Rf，其定义式可写为：
R f 溶 质 （ 流 浓 动 度 相 中 的 心 移 ） 动 的 速 移 度 动 速 度 在 同 溶 一 质 时 （ 间 浓 流 度 动 中 相 心 前 ） 沿 的 的 移 移 动 动 距 距 离 离 ( r ) ( R )
分离度R综合考虑了保留值的差值与峰宽两方面的因素
对柱效率的影响，可衡量色谱柱的总分离效能。
第一节 层析的基本原理及分类
根据分离度R的大小可 以判断被物质在色谱柱中
的分离情况；R值越大，两
色谱峰的距离越远，分离 效果就越好，如图7-5所示。 当R<1时，两峰有部分重叠； 当R = 1时，两峰有98%的 分离；当R = 1.5时，分离 程度可达99.7%；一般用R = 1.5作为相邻两峰完全分 离的标志。
第一节 层析的基本原理及分类
2．固定相的形状
根据固定相或层析装置形状的不同，液相层析法又分纸 层 析 法 ( Paper chromatography)、 薄 层 层 析 法 ( Thin—1ayer chromatography)和柱层析法(Column chromatography)。纸层 析和薄层层析多用于分析目的，而柱层析易于放大，适用于 大量制备分离，是主要的层析分离手段。
层析分离技术图文
利用层析分离技术，如活性炭吸附、 聚合物吸附等，可去除水中的有机污 染物，提高水质，保障饮用水安全。
05
层析分离技术的未来发展与挑战
新材料与新技术的研究与应用
新型吸附剂
研究具有高选择性、高吸附容量的新型吸附剂，以提高层析分离 的选择性和效率。
新型固定相
探索具有优异性能的新型固定相，以适应不同分离需求和条件。
层析分离技术图文
• 层析分离技术概述 • 层析分离技术的分类 • 层析分离技术的操作流程 • 层析分离技术的应用实例 • 层析分离技术的未来发展与挑战
01
层析分离技术概述
定义与原理
定义
层析分离技术是一种基于不同物质在 两相中的分配系数不同而实现分离的 物理分离方法。
原理
利用流动相和固定相的相互作用，使 混合物中的各组分在固定相和流动相 之间进行吸附、脱附、溶解、挥发等 过程，从而实现各组分的分离。
上样量控制
控制上样量，确保样品在柱子上得 到有效分离。
洗脱
洗脱液选择
根据分离需求选择合适的洗脱液，如有机溶剂、缓冲液等。
洗脱方式
采用适当的洗脱方式，如分段洗脱、梯度洗脱等。
洗脱速度控制
调节洗脱速度，确保样品得到充分分离。
检测与收集
检测方式
01
根据待分离组分的性质选择合适的检测方式，如紫外可见光谱、
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术，开发具有高分离性能的纳米尺度层析分 离材料。
提高分离效率与分辨率
优化分离条件
深入研究层析分离的原理和动力 学过程，优化分离条件，提高分 离效率和分辨率。
联用技术
将层析分离与其他分离技术联用， 实现多维分离，进一步提高分离 效果。
实验五 层析实验
第十九页，共二十七页。
4．凝胶层析(cénɡ xī)（gel chromatography）
利用凝胶对分子量不同的物质阻滞作用不同进行分离，亦称分子筛层析。是选 用孔径大小一定的凝胶，将混合液中的小分子物质“筛”开来的一种(yī zhǒnɡ) 分离方法。 具有所需设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好，特别是不改 变样品的生物活性等优点，广泛地用于生物分子的分离纯化以及蛋白质相对 分子质量的测定、脱盐和浓缩等。
第十四页，共二十七页。
离子交换(lí zǐ jiāo huàn)层析分离混合氨基酸
氨基酸是两性(liǎngxìng)电解质，每一种氨基酸都有它特定的
等电点，各种氨基酸在pH小于其等电点的溶液中以
阳离子的形式存在，可以与阳离子交换剂进行交 换，再慢慢增大洗脱液的pH，氨基酸将依照其等电
点由小到大的顺序逐渐洗脱，此时分部收集各洗脱 组分，即可将各种氨基酸一一分离。
第三页，共二十七页。
几种(jǐ zhǒnɡ)常用的层析方法
1．吸附(xīfù)层析（adsorption chromatography）：
利用吸附剂表面对不同物质吸附性能力的差异进行分离。
当各组分随流动相通过由吸附剂组成的固定相时，由于吸附剂对待分离混合物 中各组分的吸附力不同，导致各组分随流动相移动的速度不同，最终使得混合 物中的各组分得以分离。吸附层析的效果如何取决于待分离物质被吸附剂（固 定相）吸附结合的能力，以及其在流动相中溶解度的差异。
第十五页，共二十七页。
本实验以天冬氨酸（Asp）和精氨酸（Arg）混合物为例，利用磺 酸型阳离子交换树脂(shùzhī)（国产732树脂(shùzhī)）将二者分别从混 合物中分离。
层析法-理论ppt课件
方法：
(1) oligo(dT)-纤维素层 析柱法
(2) oligo(dT)-纤维素液 相结合离心法
(3)磁珠分离法
oligo(dT)-纤维素层析柱法
磁 珠 分 离 法
配体与载体结合
(固相化)
亲和层析
装柱
的基本过程
(亲和层析柱)
解吸附 洗柱
亲和吸附
(生物高分子与配体专一结合)
配体与载体的联接方法
固定相——滤纸上的吸附水 流动相——溶剂(乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶
的溶剂)
分离示意图
层 析 纸
层析缸
溶剂前沿
y x2
x1 起始线
(原点)
展开剂
Rf > 0.02 ，A 、B可分离. 与标样比较可定性鉴定
. 如果两种氨基酸的迁移速率相近，
或者氨基酸的Rf值相同，如何来分
离？
氨基酸的Rf值
展开剂 正丁醇+吡啶+水
名称
分离原理
固定相只能与一种待分离
亲和层析法 组份专一结合，以此和无 亲和力的其它组份分离
层析法的分类
• 按操作形式不同分类
名称
操作形式
柱层析法 固定相装于柱内，使样品沿着 一个方向前移而达分离
纸层析法 用滤纸作液体的载体，点样后 用流动相展开，使各组份分离
将适当的高分子有机吸附剂制成 薄膜层析法 薄膜，以类似纸层析方法进行物
加入样品 层析后
实验：胡萝卜的 柱层析分离法
柱层析示意图
薄层吸附层析
( Thin layer absorption chromatography)
薄层吸附层析是将吸附剂 均匀地在玻璃板上铺成薄层， 再把样品点在薄层板上，点样 的位置靠近板的一端。然后将 板的这端浸入适当的溶剂(流 动相)中，使溶剂在薄层板上 扩散，并在此过程中通过吸附 →解吸→再吸附→再解吸的反 复进行，而将样品各个组分分 离出来。
层析技术的分类
层析的分类：
1. 按两相所处物理状态分类
气相层析：气液层析（固定相为液体）和气固层析（固定相为固体），流动相为气体。
液相层析：液液层析（固定相为液体）和液固层析（固定相为固体），流动相为液体。
2. 按层析方式分类
柱层析：固定相装于柱内，使样品沿着一个方向移动而分离。
薄层层析：将适当粘度的固定相均匀铺在薄板上，点样后，用流动相展开。
纸层析：用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开。
3. 根据层析原理分类：常用分类法
（1）吸附层析：固定相是固体吸附剂，通过对不同溶质吸附力强弱不同进行分离。
（2）分配层析：利用两相中的分配系数不同。
分配系数：当一种溶质在两种给定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数，即分配系数（Kd）
Kd＝Ca / Cb
Ca和Cb分别代表某一物质在互不相溶的两相，A相（动相）和B相（静相）中的浓度。
（3）离子交换层析：固定相是离子交换剂，各组分与其亲和力不同
（4）凝胶层析：固定相是多孔凝胶，根据流动相中溶质的分子量大小差异进行分离（5）亲和层析：利用固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，与溶质分子发生可逆的特异性结合进行分离
（6）金属螯合层析
（7）疏水层析
（8）反相层析。
9种层析分离纯化方法详解
9种层析分离纯化方法详解层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。
所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。
当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。
与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。
反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。
按层析原理可将层析分为以下9种：1、亲和层析利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。
将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。
改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。
亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。
具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。
亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。
亲和层析纯化的分离原理特点：亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点，在重组蛋白的分离中多作为第一步的粗纯，实现对绝大部分杂质蛋白的去除。
2、离子交换层析采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。
主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。
不同蛋白质的等电点（pI，isoelectric point）特性，使在不同pH缓冲液条件下所带正/负净电荷不同，选择不同的离子交换柱实现分离。
第三章-吸附层析
吸附层析的概念
吸附层析（absorption chromatography）又 称色层法或色谱法；是根据各种被分离组分在固 定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的一 类分离纯化方法。
教学目的
掌握基本原理和操作方法 吸附柱层析 薄层层析 聚酰胺薄层层析
层析方法的类型
第一节 吸附柱层析
吸附柱层析的概念
第三章 吸附层析
层析又称为色谱或色层，是俄国植物学家茨维 特在分离植物色素时发现并最先应用的一种分离 纯化方法。其总的原理是根据各种被分离组分在 固定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的。
层析法根据层析类型分，可分为柱层析、纸层析和 薄层层析；根据具体分离原理分，可分为吸附层析、分 配层析、疏水层析、离子交换层析、亲和层析、凝胶过 滤层析等具体层析方法
②将收集的每管溶液进行浓缩和活性测定。以管号或洗脱体积 为横坐标，每管样品的浓度或活度为纵坐标，若层析峰无重叠， 则各成分能完全分离（图3-7）
③为了获得满意分离效果，洗脱速度恰当控制（若太快，洗脱 物在两相中平衡不完全；太慢，则洗脱物会扩散；结果都会导 致分离度下降）
④分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定及保存
第三节 聚酰胺薄膜层析
一、聚酰胺薄膜层析的概念
聚酰胺薄膜层析是1966年之后发展起来的一种层析方 法。特别应指出的是，用此法分析氨基酸衍生物DNP-氨基 酸、PTH-氨基酸、DNS-氨基酸以及DABTH-氨基酸1）时， 具有灵敏度高、分辨力强、展层迅速和操作简便等优点， 它超过了这类化合物过去使用的纸层析、纸电泳和薄层层 析(茚三酮法)等方法
➢HA为干粉时，需事先浸泡膨胀达到2~3ml/g后，按1∶6加 入缓冲液悬浮，除去细小的颗粒
➢HA悬浮液需用旋涡振荡器混合，因为其他搅拌器如磁棒、 玻棒等易破坏其晶体结构
层析(包括：吸附层析、分配层析、离子交换层析、亲和层析等)
例如：我们利用物质在溶解度、吸附能
力、立体化学特性及分子的大小、带电
情况及离子交换、亲和力的大小及特异
的生物学反应等方面的差异，使其在流
动相与固定相之间的分配系数（或称分 配常数）不同，达到彼此分离的目的。
一、凝胶的种类和性质
葡聚糖凝胶（dextran） 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide） 琼脂糖凝胶（agarose） Sephacryl Superdex 聚苯乙烯凝胶
生命科学学院：陈晓明 Copyright(C) 2009
1.葡聚糖凝胶
G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度， 也代表持水量（吸水率）乘以10（单位是mL/g干胶）, 如G-25表示1g干胶持水2.5mL，吸水率是2.5mL/g干胶； G-100表示 1g干胶持水10mL，依次类推。 X数字越小， 交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化 产品。X数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分 离高分子生化产品。
三、分类
1、按两相所处状态分类 流动相 液体 液体 液-液层析 法 固体 液-固层析 法 气体 气-液层析 法 气-固层析 法
固定 相
生命科学学院：陈晓明 Copyright(C) 2009
2、按层析原理分类
名称 吸附层析法 分配层析法 离子交换层析法 分离原理 组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附 剂，各能力不同 各组份在流动相和静止液相（固相）中的 分配系数不同 固定相是离子交换剂，各组份与离子交换 剂亲和力不同 固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不 同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同
实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率 是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在 固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移 动的距离之比 值。常用Rx来表示
四种层析方法
四种层析方法层析方法是一种将混合物中的化合物分离出来的方法。
这种技术通过利用化合物在固定相和移动相之间的不同亲和性来实现分离。
层析方法因其简单性和广泛的适用性而成为化学、生物化学和制药学中最基本的分离技术之一。
本文将介绍四种常见的层析方法，包括薄层层析法、气相层析法、离子交换层析法和凝胶层析法。
这些方法将被讨论其原理、应用、实施步骤和优缺点。
一、薄层层析法薄层层析法（TLC）是一种快速、低成本的液相分离技术。
该技术将被分析物和固定相通过一个毛细管作为裂隙分裂（slit split），使用一层非极性或极性的固定相作为分离基质，包括硅胶、氧化铝和氢氧化铝。
被分离的化合物随着移动液相在固定相上移动，不同化合物基于其不同亲和性分配到不同位置上。
该方法的实施步骤包括样品的准备、涂抹和显色步骤。
样品通常被溶解在一个合适的溶剂中，并用玻璃毛细管将其施加到固定相上。
一旦样品施加到固定相上，被分离的化合物将随着移动液相在固定相上移动。
显色可以通过利用化学试剂或紫外线进行检测。
TLC 广泛应用于化学、生物化学和制药学中，用于分析中等大小的有机和无机化合物，如氨基酸、脂肪酸、天然产物和药物。
优点：TLC是一种快速、低成本的分离技术，对于中等大小的化合物具有很好的分离效果。
TLC可以用于大规模样品纯化，并且可以被用于对化合物混合物进行初步分析的快速筛选。
缺点：TLC存在分离效率低和灵敏度低的问题，并且与其他层析技术相比，其分辨率相对较低。
TLC在数据分析方面存在可重复性差的问题。
二、气相层析法气相层析法（GC）是一种对挥发性和半挥发性化合物进行分离的技术。
此方法使用长列的液体或固定相，将待分离的化合物从液态或气态的样品中吸附并分离出来。
通过加热样品，在固定相中获得了一个气态分离的组分，可以将化合物通过检测器进行检测。
该方法通常使用非极性液态或固态固定相，如聚硅氧烷或聚乙二醇。
GC也可以选择更具有极性的固定相，从而实现对更极性化合物的分离。
各类层析色谱分析技术完全讲解 ppt课件
层析介质的性能
❖ 层析介质的形状：球形，不定形 ❖ 技术指标
粒度大小：粒度小，分离效果好，但流速慢 均匀度：均匀，流速快，峰值集中 机械强度：强度高，流速快，保留值小，柱效高 理化性质：稳定，非特异性吸附少，亲水性好，耐酸碱和有机溶剂 吸附容量：单位质量或体积的层析介质吸附流动相中溶质的质量。
❖ 纸上层析是用滤纸作为支持剂（载体）的一种色层 分析法，这种方法的基本原理一般认为主要是利用混和 物中各组分在流动相和固定相间的分配比的不同而使之 分离。
❖ 纸上层析可用于化学性质相近的混和物的分离，特 别适宜于微量物质的分离和鉴别。而且使用的仪器简单， 操作比较容易，重现性好。
三、层析前蛋白质处理
层析技术是一种分离技术，是混合物 最有效的分离、分析方法。
经典色谱（offline)
Tswett把植物绿叶的色素混合液加在一根装有干燥固体碳 酸钙颗粒（称固定相）的玻璃长管（称为填充色谱柱）上 端;
洗脱剂（亦称流动相）石油醚自上而下流过；
在石油醚不断冲洗下，原来在柱子上端的色素混合液向下 移动。由于色素中各组分的性质的差异，最后分离成不同 颜色的清晰色带；
检测器
固定相
❖ 固定相是不溶于溶剂和水的固定化颗粒，又 称为层析介质、层析填料、填充剂等。
❖ 包括：
无机材料：硅胶，氧化铝 有机材料：聚苯乙烯等 多糖类材料：葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺
层析介质与生物大分子的关系
❖ 大孔径的，亲水性好的球形材料。 ❖ 多糖类凝胶层析介质最常用
Sephadex Sepharose Bio-Gel
2、等电点沉淀
❖ 在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白 质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉 淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子 散开，溶入水中。
3-13-常见分离纯化技术原理
常见分离纯化技术原理---介绍离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、分配层析和电泳原理1、离子交换层析法⏹原理:根据离子间作用力的不同而将物质分离的方法⏹离子交换剂可解离出阴离子或阳离子，当待分离的溶液中含有阳离子时可以与阳离子交换剂的阳离子交换吸附在离子交换介质上，带电量不同的物质与离子交换剂的结合力不同，解离的条件不同，可通过改变条件，促使其解离和分部收集待分离物。
Sampleapplication and wash Elution Equilibration Regeneration-------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++anion exchanger bead ----------离子交换层析步骤和发生的变化2、凝胶过滤层析技术●概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。
●原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外,在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。
⏹凝胶过滤法测定相对分子量◆蛋白质分子通过凝胶的洗脱体积取决于它的斯脱克半径；◆如果未知蛋白与理想的非水化球体有相同的洗脱体积，则认为这种蛋白质具有与球体相同的的斯脱克半径；◆因此，实验中只要测得标准蛋白的洗脱体积，再测得未知蛋白的洗脱体积就可以得到它的相对分子量。
3、疏水作用层析⏹非极性氨基酸残基组成的疏水区域可使蛋白质结合非极性分子，利用这种相互作用蛋白质可被吸附在基质上。
⏹在不带电荷的载体上偶联疏水基团而形成疏水吸附剂⏹利用载体和样品疏水基团间的相互作用使它们吸附在一起，然后改变层析条件，减弱疏水作用，使吸附的蛋白质从吸附剂上解吸下来。
《亲和层析》课件
流动相可以是缓冲液、有机溶剂等
亲和层析可以分离纯化生物大分子，如蛋 白质、核酸、多糖等
亲和层析的应用广泛，如蛋白质纯化、药 物筛选、生物检测等
03
亲和层析的实验流 程
亲和层析的实验准备
材料准备：亲和 层析柱、缓冲液、 样品、洗脱液等
设备准备：层析 仪、离心机、紫 外分光光度计等
亲和层析的应用领域
生物制药：分离 纯化蛋白质、多 肽等生物大分子
食品工业：分离 纯化食品添加剂、 天然色素等
环境监测：分离 纯化重金属离子、 有机污染物等
化学分析：分离 纯化有机化合物、 无机化合物等
亲和层析的基本原理
亲和层析是一种分离纯化生物大分子的方 法
原理：利用生物大分子与固定相之间的亲 和力进行分离
06
亲和层析的发展趋 势和展望
亲和层析技术的未来发展方向
提高分离效率：通过改进亲和层 析技术，提高分离效率，降低成 本
智能化发展：结合人工智能技术， 实现亲和层析的自动化、智能化
添加标题
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扩大应用领域：将亲和层析技术 应用于更多领域，如生物制药、 食品加工等
环保化发展：采用环保材料和工 艺，降低对环境的影响，实现可 持续发展
亲和层析在生物医药领域的应用
蛋白质纯化： 分离、纯化蛋 白质，提高纯
度
药物筛选：筛 选药物，提高 药物研发效率
疫苗生产：分 离、纯化疫苗， 提高疫苗质量
诊断试剂：制 备诊断试剂， 提高诊断准确
性
亲和层析在环境监测领域的应用
土壤监测：检测土壤中的污 染物，如农药残留、重金属 等
大气监测：检测大气中的污 染物，如二氧化硫、氮氧化
层析包括吸附层析分配层析离子交换层析亲和层析等讲课文档
质也可利用吸附柱层析分离。
第三页，共117页。
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2、层析法是目前广泛应用的一种分离技术，是分离 各种生物大分子的主要手段之一，是利用不同物
质理化性质的差异而建立起来的技术。
3、40年代：两位英国科学家Martin和Synge发明 了分配色谱（层析），他们首先提出了色谱塔板理论， 获得了1952年的诺贝尔化学奖。由此，层析技术成为
凝胶和生物胶P，强酸强碱能引起结构破坏。最好使 用条件控制在pH 4～9之间，温度0～40℃。
第三十页，共117页。
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• 对样品的吸附作用很小
• 琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好，
• 在高盐浓度下，柱床体积一般不会发生明显变化，使用琼脂糖 凝胶时洗脱速度可以比较快
• 排阻极限很大，分离范围很广，适合于分离大分子物质， 但分辨率较低
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层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物 质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可 以流动的物质，当待分离的混合物通过固定相时，由于各 组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比） 不同，与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时 受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相 相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出 液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份 分离的目的。
操作容量：在特定条件下，某种成分与基质反应达到 平衡时，存在于基质上的饱和容量。每克（或毫升） 基质结合某种成分的毫摩尔数（或毫克数）。
数值大，结合力强。
膨胀度（Vβ)： 在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所
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示文稿
优选层析包括吸附层析分配层 析离子交换层析亲和层析等
2、层析法是目前广泛应用的一种分离技术， 是分离各种生物大分子的主要手段之一，是 利用不同物质理化性质的差异而建立起来的 技术。
3、40年代：两位英国科学家Martin和 Synge发明了分配色谱（层析），他们首先 提出了色谱塔板理论，获得了1952年的诺 贝尔化学奖。由此，层析技术成为分离生化 物质的关键技术。
6、在层析法实验技术有凝胶层析法、离子交换层析 法、高效液相层析法、亲和层析法、聚焦层析法等
二、原理及概念
层析技术是一类物理分 离方法,根据待分离混合 物中各组分物理化学性 质的差别,使各组分以不 同程度分布在固定相和 流动相两相中,由于各组 分随流动相前进的速度 不同,从而得到有效分离。
例如：我们利用物质在溶解度、吸附能 力、立体化学特性及分子的大小、带电 情况及离子交换、亲和力的大小及特异 的生物学反应等方面的差异，使其在流 动相与固定相之间的分配系数（或称分 配常数）不同，达到彼此分离的目的。
分配系数与迁移率的关系
❖ K值大，就表明该组分与固定相结合力大，迁移率小； 反之则结合力小，迁移率大
❖ K增加，Rf减少；反之，会减少，Rf增加
❖ 不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数 或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能 否分 离的先决条件。其差异越大，分离效果越理想。
操作容量：在特定条件下，某种成分与基质反应达 到平衡时，存在于基质上的饱和容量。每克（或毫 升）基质结合某种成分的毫摩尔数（或毫克数）。 数值大，结合力强。
亲和层析法
分离原理
组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附 剂，各能力不同 各组份在流动相和静止液相（固相）中的 分配系数不同 固定相是离子交换剂，各组份与离子交换 剂亲和力不同 固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不 同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同
固定相只能与一种待分离组份专一结合， 以此和无亲和力的其它组份分离
层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体 物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相， 即可以流动的物质，当待分离的混合物通过固定相时， 由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用 （吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配 （含量对比）不同，与固定相相互作用力越弱的组份， 随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。 反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越 慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份， 从而达到将各组份分离的目的。
凝胶层析
（gel chromatography）
凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography） 分子筛层析（molecular sieve chromatography） 凝胶过滤（gel filtration） 凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）
分配系数（distribution coefficient）
分配系数是指在一定的条件下（如温度、压力）， 某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比 值，分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据， 常用K来表示
K cs cm
Cs: 溶质在固定相中的浓度，Cm:溶质在流动相中的浓度
❖ K值大表示其溶质在固定相中浓度大， 在洗脱过程中溶质出现较晚
4、按照不同的标准层析法有不同的分类。 根据层析峰的位置及峰高或峰面积,可以定 性及定量。层析法与光学、电学或电化学 仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度 或质量，同时绘出层析图。层析仪与电子 计算机联用，可使操作及数据处理自动化， 大大缩短分析时间。
5、由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、 速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样 品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。近年来， 已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在医 药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面也 得到了广泛的应用。
❖ K值小表示某溶质在流动相中浓度 大，故在洗脱液中出现较早
❖ 有相似的K值，则表明两组分层析峰 会发生重叠，分离效果差
分配系数主要与下列因素有关： ①被分离物质本身的性质 ②固定相和流动相的性质 ③层析柱的温度。
不同的层析机理，其K值函义不同:
❖ 吸附层析中K值表示吸附平衡常数 ❖ 分配层析中K值表示分配系数 ❖ 离子交换层析中K表示交换常数 ❖ 亲和层析中K表示亲和常数。
膨胀度（Vβ)： 在一定溶液中，单位重量的基质充 分溶胀后所占有的体积；即每克溶胀基质所具有的 床体积。
床体积（Vt)
三、分类
1、按两相所处状态分类
流动相
液体
气体
固定 相
液体 液-液层析 法
固体 液-固层析 法
气-液层析 法
气-固层析 法
2、按层析原理分类
名称 吸附层析法 分配层析法 离子交换层析法 凝胶层析法
基本概念
固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物 质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液 体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基 质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换 等作用。
流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质 朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。 柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。
3、按操作形式不同分类柱层来自法名称薄层层析法
纸层析法 薄膜层析法
操作形式
固定相装于柱内，使样品沿着一个 方向前移而达分离
将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄 板上，点样后用流动相展开，使各 组份分离
用滤纸作液体的载体，点样后用流 动相展开，使各组份分离
将适当的高分子有机吸附剂制成薄 膜，以类似纸层析方法进行物质的 分离
迁移率
迁移率（ Rf或比移值）是指：在一定条件下， 在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与 流动相本身移动的距离之比值 。常用Rf来表示
实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率 是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在 固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移 动的距离之比 值。常用Rx来表示