离子交换层析配基、基架、填料
层析填料介绍
层析填料介绍
一、离子交换层析柱
1. 弱阳离子交换填料：以羧基为主，常用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
2. 强阳离子交换填料：以氨基为主，常用于有机物、生物小分子、金属离子等的分离。
3. 弱阴离子交换填料：以胺基为主，通常用于无机阴离子、有机酸、磷酸等的分离。
4. 强阴离子交换填料：以季铵盐为主，常用于离子的选择性吸附分离、蛋白质去除等。
二、凝胶层析柱
1. 大孔凝胶层析填料：具有大的孔径和大的分子量，适用于大分子的分离和纯化，如蛋白质、糖类等。
2. 中孔凝胶层析填料：孔径和分子量较小，适用于中小分子的分离和纯化，如抗体、糖体、药物等。
3. 小孔凝胶层析填料：孔径和分子量非常小，适用于小分子有机物、酶、激素等的分离和纯化。
4. 离子交换凝胶层析填料：同时具有凝胶和离子交换功能，适用于对分子量和电荷具有选择性的物质的分离和纯化。
三、亲和层析柱
1. 金属亲和层析填料：以Ni、Co、Zn等为配位离子的柱子，适用于含有带金属结构的肽、蛋白质、核酸等的分离。
2. 免疫亲和层析填料：以特异性抗体为配体的柱子，可用于分离和纯化含有特定表位的蛋白质等物质。
3. 亲和层析填料：利用配位、化学键合、反相作用等与物质之间的亲和力实现分离和纯化。
以上是常见的层析柱填料种类及其特点，选择合适的填料可提高层析分离效率和纯化效果。
离子交换填料选择
离子交换填料的选择、处理和保存(1)离子交换填料的选择离子交换填料的种类很多，离子交换层析要取得较好的效果首先要选择合适的离子交换填料。
首先是对离子交换填料电荷基团的选择，确定是选择阳离子交换填料还是选择阴离子交换填料。
这要取决于被分离的物质在其稳定的pH 下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换填料；如带负电，则选择阴离子交换填料。
例如待分离的蛋白等电点为4，稳定的pH 范围为6－9，由于这时蛋白带负电，故应选择阴离子交换填料进行分离。
强酸或强碱型离子交换填料适用的pH 范围广，常用于分离一些小分子物质或在极端pH 下的分离。
由于弱酸型或弱碱型离子交换填料不易使蛋白质失活，故一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换填料。
其次是对离子交换填料基质的选择。
前面已经介绍了，聚苯乙烯离子交换填料等疏水性较强的离子交换填料一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。
而纤维素、葡聚糖、琼脂糖等离子交换填料亲水性较强，适合于分离蛋白质等大分子物质。
一般纤维素离子交换填料价格较低，但分辨率和稳定性都较低，适于初步分离和大量制备。
葡聚糖离子交换填料的分辨率和价格适中，但受外界影响较大，体积可能随离子强度和pH 变化有较大改变，影响分辨率。
琼脂糖离子交换填料机械稳定性较好，分辨率也较高，但价格较贵。
另外离子交换填料颗粒大小也会影响分离的效果。
离子交换填料颗粒一般呈球形，颗粒的大小通常以目数(mesh)或者颗粒直径(mm)来表示，目数越大表示直径越小。
前面在介绍交换容量时提到了一些关于交换剂颗粒大小、孔隙的选择。
另外离子交换层析柱的分辨率和流速也都与所用的离子交换填料颗粒大小有关。
一般来说颗粒小，分辨率高，但平衡离子的平衡时间长，流速慢；颗粒大则相反。
所以大颗粒的离子交换填料适合于对分辨率要求不高的大规模制备性分离，而小颗粒的离子交换填料适于需要高分辨率的分析或分离。
这里特别要提到的是，离子交换纤维素目前种类很多，其中以DEAE-纤维素(二乙基氨基纤维素)和CM-纤维素(羧甲基纤维素)最常用，它们在生物大分子物质(蛋白质，酶，核酸等)的分离方面显示很大的优越性。
第五章 离子交换层析20130321
7
如果要分离纯化一种具有兼性离子特性的 生物大分子，其离子化的程度取决于它所在溶 液中的净电荷。生物分子带电荷与否，或带什 么样的电荷，主要决定于溶液的pH值。溶液的 pH值高于生物大分子的等电点时，就带负电荷， 解离成负离子；低于生物大分子的等电点时， 就带正电荷，解离成阳离子。因此，分离具有 兼性离子的生物大分子，要对溶液的pH值、生 物大分子的等电点和离子交换层析介质3种条 件同时进行考虑。 8
23
（四）介质粒度 介质粒度是指离子交换介质颗粒直径的大小， 单位是μm。常用的离子交换介质的粒度大小可 分为4类，即： 粗：颗粒直径在100—500μm左右，可用较 大规模制备。 中粗：颗粒直径在50～150μm左右，小型制 备兼分析。 中细：颗粒直径在20—80μm左右，用于分 析。 细：颗粒直径在5—30μm左右，微量分析， HPLC。 24
第五章
离子交换层析
孙晋民
第一节 概述 离子交换层析 （ion exchange chromatography）, 是利用固定相偶联的离子交换基团和流动相解 离的离子化合物之间发生可逆的离子交换反应 而进行分离的方法，这种层析方式称为离子交 换层析。 离子交换层析在无机化合物、有机化合物 和生物大分子的分离中应用最早、最广泛的方 法之一。它既可用于大规模工业化生产，也可 用于销量制备或研究分析。
阴 离 子
二乙基氨基乙基
氨基乙基
AE
-O-CH2-CH2-N+H3
12
（五）交换基团的交换反应式
阳离子交换基团: 磺酸基：一R—SO3-H+ + Na+
一R—SO3- Na+ + H+
13
第四节 常用的离子交换层析介质及其特性
层析填料选择
A = Macroprep High Q B = Fractogel EMD, TMAE 650 C = SuperQ 650 D = Q HyperD E = STREAMLINE Q XL F = Q Sepharose XL
19 / GE /
MacroCap SP
－－专为较大的生物分子设计的阳离子交换填料 •特别适合PEG修饰后的蛋 白的纯化
10 / GE /
Sepharose 系列填料
－快速大分子凝胶过滤首选 • Sepharose的结构：
β-D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合所形成的线 性多聚糖。 在形成过程中由单独的多糖链先形成双螺旋，然后聚 集成胶束，胶束之间形成微孔，其大小取决于胶束的 多少，即琼脂糖的浓度。 pH为4-9之间稳定。 琼脂糖凝胶对样品的吸附 作用很小，并且机械强度 和孔穴稳定性都很好。 Sepharose: Separation Pharmacia agrose
Mono P：专为层析聚焦设计的弱阴离子交换填料
21 / GE /
Capto基架系列离子交换填料
－－新一代快流速高载量填料
+
基架 • • • • 表面延伸剂
+
O
SO
3
配基:磺酸乙烷基
改良交联琼脂糖---刚性更强、传质速度更快 线状葡聚糖表面延伸剂---载量提高 颗粒大小：平均90um,75um,40um 配基：Q、S、DEAE、Adhere、MMC、ImPres
7
2 4 5 3 6
100,000 1,000,000 10,000,000
1. Superdex™ Peptide 2. Superdex 75 3. Superdex 200 4. Sephacryl™ S-100 HR 5. Sephacryl S-200 HR 6. Sephacryl S-300 HR 7. Sephacryl S-400 HR
层析填料选择
MacroCap SP
－－专为较大的生物分子设计的阳离子交换填料
•特别适合PEG修饰后的蛋 白的纯化 •基架：交联的烯丙基葡聚 糖与氮氮亚甲基丙烯酰胺 •颗粒大小：平均50um •动态载量：4mg/ml填料
20 / GE /
Source基架离子交换填料
－－高流速、低反压、高分辨率
化学材质：聚苯乙烯/二乙烯苯 颗粒均匀，硬度大，排阻极限可达107
50周年
－快速group separation首选 1959-2009
Sephadex 是由葡聚糖 交联环氧氯丙烷形成 的多孔结构
Sephadex: 羟基基团， 呈弱酸性
Sephadex : Separation Pharmacia Dextran
7/ GE /
Sephadex 系列填料
－快速group separation首选
15 / GE /
离子交换（IEX）－最受欢迎的层析方法
原理：根据生物分子的表面电荷性质进行分离纯化， 可以应用在层析的各个阶段。
重点：在于选择合适的分辨率。
16 / GE /
离子交换填料的分类
基本形式：
R（带电配基）
基架类型： – Sepharose 基架 – Source 基架 – Capto 基袈 – Sephadex基架 – 纤维素基架
• Sep。harose 6FF：分离范围10KD-4MD Sepharose 4FF：分离范围60KD-20MD 适用于巨大分子如多糖疫苗、病毒、乙肝表面抗原、 DNA质粒纯化。
12 / GE /
Superose系列填料
－分离范围最宽广的高分辨率凝胶过滤填料
•Superose 6分离范围：5k-5000K •Superose 12分离范围：1K-300K
离子交换层析法
离
子
+ OH-
交 换 R-N+（CH3）2 OH- + H2O == R-N+（CH3）2
剂
H·OH-
2．亲水性离子交换剂
磷酸纤维素 CM-纤维素 DEAE-纤维素 CM-交联葡聚糖 DEAE-交联葡聚糖 CM-Sepharose CL-6B
二、离子交换剂性质
颜色与形状 交联度 吸水量或膨胀度 交换容量 稳定性 比重
CA 、CB ＝梯度混合器A瓶、 B瓶的浓度； A1 、B1 ＝A瓶、B瓶的横切面积； V2＝流经层析柱的体积，V1＝梯度洗脱液的总体积。
线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清 白蛋白的图谱
第五节 离子交换拄层析应用
一、去离子水的制备 二、制备、纯化生命物质 二、测定蛋白质的等电点
一价离子：Li+＜Na+＜K+＜Rb+＜Cs+ 二价离子：Mg2+＜Ca2+＜Sr2+＜Ba2+ 一价阴离子：F-＜Cl-＜Br-＜I不同价阳离子：Na+＜Ca2+＜Al3+＜Ti4+
磺酸基树脂和季胺基树脂 对各种离子的相对选择系数
阳离子树脂
反离子 相对选择系数
H+
1.0
Na+
1.5
NH4+
1.95
2、缓冲液离子组成的选择
①缓冲液离子的pK值要接近所用的pH， ②采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，
如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐 ③采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，
如：Tris ④缓冲液离子不影响被分离物的活性、测定、
溶解度。
3、缓冲液离子强度的选择
①起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换 剂结合，一般小于0.1mol/L。
层析柱填料的分类
层析柱填料的分类层析柱填料是一种常用的分离技术，在多个领域都有广泛的应用。
根据其物理性质和化学性质的不同，层析柱填料可以分为不同的分类。
本文将对层析柱填料的分类进行详细介绍。
一、根据物理性质分类1. 吸附填料：吸附填料是层析柱中最常用的一种填料。
其主要特点是表面具有较强的吸附能力，可以与待分离物质发生物理吸附作用。
常见的吸附填料有硅胶、活性炭、分子筛等。
吸附填料在生物制药、食品加工、环境监测等领域有广泛应用。
2. 离子交换填料：离子交换填料是一种带电的固体颗粒，其表面带有正或负电荷。
离子交换填料可以与待分离物质中的离子发生离子交换作用，实现分离纯化的目的。
常见的离子交换填料有阳离子交换树脂、阴离子交换树脂等。
离子交换填料在水处理、生物制药、化工等领域有广泛应用。
3. 柱色谱填料：柱色谱填料是一种高效分离的填料，其主要特点是具有较大的表面积和较好的分离效果。
常见的柱色谱填料有C18、C8、氨基、硅胶等。
柱色谱填料在药物分析、环境监测、食品检测等领域有广泛应用。
二、根据化学性质分类1. 亲水性填料：亲水性填料是一种具有亲水性表面的填料，其主要特点是对亲水性物质具有较好的吸附和分离效果。
常见的亲水性填料有硅胶、糖凝胶、羟基磷灰石等。
亲水性填料在生物制药、食品加工等领域有广泛应用。
2. 疏水性填料：疏水性填料是一种具有疏水性表面的填料，其主要特点是对疏水性物质具有较好的吸附和分离效果。
常见的疏水性填料有疏水性聚合物、疏水性硅胶等。
疏水性填料在有机合成、食品加工等领域有广泛应用。
3. 离子互化填料：离子互化填料是一种可以与待分离物质发生离子交换作用的填料，其主要特点是对离子性物质具有较好的吸附和分离效果。
常见的离子互化填料有阳离子交换树脂、阴离子交换树脂等。
离子互化填料在环境监测、药物分析等领域有广泛应用。
三、根据粒径分类1. 大孔径填料：大孔径填料是一种具有较大孔径的填料，其主要特点是具有较大的表面积和较好的传质效果。
离子交换层析柱和填料选择指南
1 参考文献: CRC化学与物理手册第83版，2002-2003年。
反离子 CCCCCCCCllllllll--------或或HHCCOOOO SCCOll--或42- CH3COO CCCCClllll-----
pKa (25 °C)1 4.75 5.33 6.04 6.48 6.65 9.10 7.76 8.07 8.52 8.52 8.88 8.88 9.50 9.73 10.55 11.12
表面净电荷
V
V
V
V
+
阳离子
0
pH
阴离子
–
Abs
Abs
Abs
Abs
V
V
V
2
图2. pH对选择性的影响（洗脱模式）。
V
4
样品制备
为了获得最佳的分离并避免层析柱性能的退化，正确 的样品制备是必要的。样本必须是澄清的，无颗粒物 质。 为了去除颗粒物质，过滤（过滤器孔径见缓冲液配制） 或离心（10000 g，15分钟）样品。脱盐样品使用 HiTrap™ Desalting 5 ml（体积达到1.5 ml）或HiPrep™ 26/10 Desalting（体积达到15 ml）转换为所选择的其 实缓冲液。在高盐浓度下不含主要污染的非常小体积 的样品可以用起始缓冲液稀释，以降低盐浓度到不干 扰填料的水平结合。
清洗程序，方案1
用4 CV达到70%的乙醇或30%的异丙醇洗涤。 用至少2 CV的蒸馏水冲洗，直到紫外基线和洗 脱pH稳定。 立即用3 CV的起始缓冲液洗涤（流速与步骤2相 同）。
清洗程序，方案2
用2 CV含有去垢剂的碱或酸溶液洗涤（例如含有 0.1–0.5%非离子型去垢剂的0.1 M乙酸）。 用5 CV 70%乙醇冲洗以去除残留的去垢剂。 用至少2 CV的蒸馏水冲洗（流速与步骤1相同）， 直到紫外基线和洗脱pH稳定。 用3 CV的起始缓冲液洗涤（流速与步骤1相同）。
离子交换层析配基、基架、填料
离子交换层析配基、基架、填料
离子交换层析技术是一种高效的分离纯化技术，在工业化生产、科研领域和医药制造中广泛应用。
离子交换层析的核心是离子交换基质，其中的配基、基架、填料是其重要组成部分。
配基是离子交换基质的主要功能部分，它能吸附目标离子，并释放出相同电荷的离子。
常见的配基有阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、配体亲和树脂等。
这些配基的选择要根据目标离子的性质进行，如分子大小、电荷、亲和力等。
基架是离子交换基质的骨架部分，它决定了基质的物理和化学性质。
常见的基架有聚苯乙烯、聚丙烯、聚酰胺等。
基架的选择要考虑到其耐化学腐蚀性、耐高压性和耐温度性等。
填料是离子交换基质中的孔隙部分，其物理和化学性质直接影响了离子交换的效率和选择性。
常见的填料有硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等。
填料的选择要根据其孔径大小、表面极性、化学活性等因素进行。
离子交换层析技术的发展，离不开配基、基架、填料等关键技术的不断创新和进步。
随着新型配基、基架、填料的不断出现，离子交换层析技术将会有更广泛的应用空间和更高的效率。
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离子交换层析填料
离子交换层析填料
离子交换层析填料是水处理工程中一种常用的改性添加剂，它可以使水和离子相互交换，从而实现水质的降解改善。
离子交换层析填料的主要作用是去除水中的有害离子，通过它的作用，便能由水产生质量较高的饮用水和清洁水。
离子交换层析填料主要由吸附剂和助剂组成：吸附剂一般是熟碳、活性炭、氧化铝、石灰岩、矿物沥青等；助剂主要有曝气、添加剂、定量压力脱气剂等。
①熟碳：具有良好的向水中的有害离子吸附作用，有利于解决水质污染问题。
②活性炭：具有良好的物理吸附作用，特别适用于染料、有机污染物、重金属等污染物的去除。
③氧化铝：适用于去除水中溶解态的铝离子，可以有效降低水质中的铝含量。
④石灰岩：能有效缓解水中的酸性，保护水中有益离子，也可以用于去除水中镉等重金属元素。
⑤矿物沥青：适用于污染物的去除，主要是具有吸附和离子交换作用。
离子交换层析填料的具体选择要根据水质污染的种类和体积聚集性，选择最适当的吸附剂以及助剂以实现水质的改善。
此外，应尽量采用多种吸附剂和助剂的结合，这样可以增强去除有害离子的效果，保证水的质量。
Media的前世今生
Media的前世今生层析技术分为“凝胶过滤、离子交换、疏水层析、亲和层析、反相层析”五大类，层析过程中起到分离作用的是层析填料，又称media。
面对哥家上千种填料，小伙伴们的十万个为什么铺面而来：“请问sephadex与sepharose的区别是什么？”“我想纯化单抗，应该选择哪种填料？”……本期客户园地，咱们就来说说填料的前世今生。
【填料的组成】填料由基架和配基两部分组成（凝胶过滤填料）：不同的基架，其构建原料、颗粒大小、孔隙大小、颗粒与孔隙大小分布不同；不同的配基，其表面修饰、配基配型、配基密度、相互作用模式不同。
合适的基架+合适的配基=完美填料！【填料的含义】从1959年sephadex系列填料上市以来，哥家的填料走过了半个多世纪的研究开发历程。
更高分辨率、更快速、更多载量，一直是哥努力的方向。
哥家过去、现在、未来都将为人类生命科学研究事业贡献更多更好的填料！可别小看每个系列的名字，每个字母都是有其特殊含义的，例如：交换填料Capto adhere就是由A ggregates/dimers+D NA, viruses, leached ProteinA+H CP+ E ndotoxins+Re moval of得来的哦！其用途一目了然！另有一大波常见缩写词解释来袭：XL：高载量。
Pg：Prep grade，制备级。
HR：High Resolution，高分辨率。
LS：Low Sub，低取代，配基密度低。
HS：High Sub，高取代，配基密度高。
HP：High Performance，高性能，填料平均颗粒大小约34 μm，颗粒细能带来高分辨率的分离纯化。
FF：Fast Flow,快流速，填料平均颗粒大小约90 μm，较HP颗粒粗，具有良好的分辨率及轻松实现规模扩大的分离纯化。
【明星填料】sephadex系列填料是哥家开发的第一款填料，这位已近花甲之年的老前辈依然活跃在层析的舞台上。
Sephadex是经典的葡聚糖和环氧氯丙烷(epicnlorohydrin)偶联填料，拥有极高的选择性，有多种分离范围和颗粒大小供选择：粗颗粒(Coarse)流速较快，细颗粒(Fine)流速较慢，分辨率较高。
离子交换层析
上样及洗脱的一般规律：
在高盐浓度条件下，蛋白质与固定相疏水缔合；浓度降低时，疏水作用减弱，逐步被洗脱下来。一般用pH 6-8的盐水溶液[如（NH4）2SO4]。盐的浓度影响蛋白质的疏水性，从而影响蛋白质的保留值。
盐：Na2SO4，KH2PO4，NaHPO4，(NH4)2SO4，NH4OAc，KOAc，NaOAc，NaCl
多缓冲剂：
多缓冲剂是两性电解质缓冲剂，由相对分子质量大小不一的各种多羧基多氨基化合物组成，存在各自的等电点。常用的多缓冲剂有Pharmacia公司生产的Polybuffer 96、Polybuffer 74和Pharmalyte等，缓冲pH范围分别为pH 9-6，pH 7-4和pH 10.5-8。在相应的缓冲pH范围内，各种多缓冲剂具有均衡的缓冲容量，在层析聚焦操作中提供平滑的pH梯度。
（3)疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。
羟基磷灰石层析
羟基磷灰石（hydroxyapatite, HAP):是一种磷酸钙晶体，基本分子结构为
一般认为，HAP的吸附主要基于钙高子和磷酸根离子的静电引力，即在HAP晶体表面存在两种不同的吸附晶面，各存在吸附点c点和P点，前者起阴离于交换作用，后者起阳离于交换作用．因此，在中性pH环境下酸性蛋白质(pI<7)主要吸附于c点，碱性蛋白质(PI>7)主要吸附于P点．利用磷酸盐缓冲液(K2HP04+KH2PO4）为流动相洗脱展开时，磷酸根离子在c点竞争性吸附，交换出酸性蛋白质，而K+在P点竞争性吸附，交换出碱性蛋白质。所以HAP层
POROS介质的大比表面积和溶质吸附容量。同时，扩散孔道长度小于lm，溶质扩散所需时间极短，大大降低了利用传统介质进行层析分离的扩散传质阻力。
阳离子层析填料的原理
阳离子层析填料的原理阳离子层析（Cation-exchange chromatography）是一种常用的层析技术，主要用于分离和纯化带有正电荷的化合物。
它基于阳离子交换剂的特性，通过化合物与交换剂之间的离子交换作用来实现分离。
阳离子交换层析填料是用于阳离子层析柱中的固体材料。
常见的填料材料包括聚合物和硅胶基底。
填料表面上固定有具有高度离子交换活性的功能基团，例如硫酸基团（Sulphonic acid）、羧酸基团（Carboxylic acid）等。
这些功能基团通过共价键或离子键与填料材料结合牢固。
阳离子交换剂对化合物的吸附和洗脱起着关键作用。
阳离子交换层析的工作原理是通过吸附、洗脱和再生三个步骤来分离目标化合物。
首先，待分离的混合物将注入到阳离子层析柱中。
混合物中带有正电荷的化合物与填料中的功能基团发生静电相互作用，发生吸附。
吸附的强度通常与化合物的电荷密度、大小以及功能基团的亲和性相关。
然后，通过洗脱溶液，选择性地将化合物从层析柱上洗脱下来，完成分离。
洗脱溶液中一般包含了一系列具有不同浓度和pH值的盐溶液。
通过优化洗脱条件，可以实现化合物的选择性洗脱，即目标化合物首先与其它成分分离开来。
最后，经洗脱得到的目标化合物可以通过一系列工艺步骤将其纯化。
而阳离子交换层析柱可以继续用于下一轮的分离工作。
在此过程中，还需要考虑到填料材料的化学、物理性质对分离效果的影响。
例如，填料材料的孔隙度、表面积等参数，将影响到分子在填料内部的扩散速度和输运效率。
阳离子层析可应用于多种生物或化学物质的分离和纯化，如蛋白质、肽、酶、核酸、药物和天然产物。
阳离子层析对于带有正电荷的化合物具有高选择性和分离效率，并且对于分离规模的调控和操作也比较方便。
此外，阳离子层析还可以与其它层析技术如离子交换层析、亲和层析等结合使用，以实现更高效的分离和纯化效果。
总之，阳离子层析填料作为阳离子交换层析的重要组成部分，通过其高度离子交换活性的功能基团，与待分离化合物发生静电相互作用，实现了化合物的选择性吸附和洗脱。
生物分离工程-离子交换层析(色谱)-精选文档
灌注层析(Perfusion chromatography)
灌注层析(Perfusion chromatography)是美国PerSeptive Biosystems公司于1989年开发的层析分离技术，Perfusion chromatography是该公司的注册商标．灌注层析的关键是 其以POROS命名的固定相粒子的特殊结构；POROS的基 质是聚苯乙烯—二乙烯苯，含有两种大小不同的孔道。 大孔直径为0.6 ~ 0.8m，流体以对流形式通过，称为穿透 孔(throughpore); 小孔直径与一般介质一样，直径500 ~ o 1000 A， 流体以扩散的形式通过，称为扩散孔(diffusive pore)．如图所示，穿透孔之间以扩散孔相连，保证了
洗脱能力增强
1、影响疏水性吸附的因素
蛋白质的疏水性与其荷电性质相比复杂得多，不易 定量掌握。除疏水性吸附剂的性质(疏水性配基的结构和 修饰密度)外，流动相的组成以及操作温度对蛋白质疏水 性吸附的强弱均产生重要影响。
(1)离子强度及种类
蛋白质的疏水性吸附作用随离子强度提高而增大。离 子的种类亦影响蛋白质的疏水性吸附。疏水性吸附与盐 析沉淀一样，在高价阴离子的存在下作用力较高。因此 HIC分离过程中主要利用硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等盐溶 液为流动相，在略低于盐析点的盐浓度下进料，然后逐 渐降低流动相离子强度进行洗脱分离。
离子交换(IEC)的应用及特点
GFC — 主要用于产物的初步纯化和中后期脱盐 IEC — 是蛋白质、肽和核酸等生物产物的主要纯化 手段 IEC分离的特点：
（1）料液处理量大，具有浓缩作用，可在较高流速下操作； （2）应用范围广泛，优化操作条件可大幅度提高分离的 选择性，所需柱长较短； （3）产品回收率高； （4）商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格也远低 于亲合吸附剂。
离子交换层析的基本操作
离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本装置及操作步骤与前面介绍的柱层析类似，这里就不再重复了。
下面主要介绍离子交换层析操作中应注意的一些具体问题。
(1)层析柱离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。
直径和柱长比一般为1:10到1:50之间，层析柱安装要垂直。
装柱时要均匀平整，不能有气泡。
(2)平衡缓冲液离子交换层析的基本反应过程就是离子交换填料平衡离子与待分离物质、缓冲液中离子间的交换，所以在离子交换层析中平衡缓冲液和洗脱缓冲液的离子强度和pH 的选择对于分离效果有很大的影响。
平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。
平衡缓冲液的离子强度和pH 的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。
其次是要使各个待分离物质与离子交换填料有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换填料的结合有较大的差别。
一般是使待分离样品与离子交换填料有较稳定的结合。
而尽量使杂质不与离子交换填料结合或结合不稳定。
在一些情况下(如污水处理)可以使杂质与离子交换填料有牢固的结合，而样品与离子交换填料结合不稳定，也可以达到分离的目的。
另外注意平衡缓冲液中不能有与离子交换填料结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。
选择合适的平衡缓冲液，直接就可以去除大量的杂质。
并使得后面的洗脱有很好的效果。
如果平衡缓冲液选择不合适，可能会对后面的洗脱带来困难，无法得到好的分离效果。
(3)上样离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH 值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的1－5％为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。
(4)洗脱缓冲液在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH 两种方式。
改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换填料结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH 的洗脱，对于阳离子交换填料一般是pH 从低到高洗脱，阴离子交换填料一般是pH 从高到低。
离子交换层析法
离子交换层析法一、原理离子交换层析法是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据的原理是物质的酸碱性、极性，也就是所带阴阳离子的不同。
由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。
阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。
结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。
反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
二、方法与步骤：1.实验试剂与仪器：可溶性蛋白质溶液、TB缓冲液、NaCl溶液、乙醇、去离子水，层析柱、移液器、尼龙纱布、离子交换剂......2.实验步骤（1）装柱：取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子;用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水;取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，用去离子水冲洗填料5个柱体积;（2）柱的平衡与上样：用0.02M TB bufferA缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6;对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合;（3）洗杂蛋白：用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;用含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;分别用含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL 的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；（4）解离目的蛋白（洗脱）：分别用含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;（5）柱的清洗与保存：用含1000mMNaCL的TB bufferA缓冲液(PH7.6)以冲洗层析柱，共冲洗30ml;用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml;用过滤去离子水冲洗50ml;用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。
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离子交换层析配基、基架、填料
离子交换层析是一种常见的分离和纯化方法，广泛应用于生物、化学、环境等领域。
离子交换层析的基本原理是利用离子交换材料与待分离物质之间的化学亲和性差异，通过物质在离子交换材料中的分配来实现分离纯化。
离子交换层析的关键组成部分包括配基、基架和填料。
配基是指离子交换材料上的活性基团，其化学性质决定了材料的亲和性。
常见的配基包括阴离子交换基、阳离子交换基、强酸交换基和弱酸交换基等。
基架是指离子交换材料的骨架结构，常用的基架材料包括聚苯乙烯、聚乙烯、硅胶等。
填料是指用于填充离子交换柱的材料，常见的填料材料包括硅胶、聚合物、玻璃等。
离子交换层析的选择和优化要考虑到多个因素，如待分离物质的性质、离子交换材料的性能、离子交换柱的尺寸、流速等。
通过合理选择配基、基架和填料，并调整操作条件，可以实现高效、经济的分离纯化过程。
总之，离子交换层析是一种重要的分离纯化技术，配基、基架和填料是其关键组成部分。
选择合适的离子交换材料和填料，并合理调整操作条件，可以实现高效、经济的分离纯化过程。
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