土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取实验报告

土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取
实验目的：
1、从土壤中分离产抗生素的放线菌
2、放线菌的培养
3、放线菌的发酵产生活性物质
4、放线菌产生的活性物质提取。

实验原理：
放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖。

放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约80%是各种放线菌所产生的。

许多临床应用的抗生素均由土壤中分离的放线菌产生。

采用选择培养基可分离土壤中的放线菌。

产抗生素的放线菌经液体培养后，其分泌的抗生素存在于离心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌试验进行检测，从而筛选到所需的抗生素产生菌，并对其进一步培养，繁殖，发酵，最终提取我们所需的抗生素。

实验器材：
1、土壤
2、培养基：高氏一号培养基、种子培养基、发酵培养基
3、其他：重铬酸钾、培养皿、牛津杯、接种环、酒精灯，无菌涂棒、三角锥瓶、高压蒸汽灭菌锅、天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、试管、牛皮纸、线绳等。

实验步骤：
一、土壤放线菌株的采集
采集样品：选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。

先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。

将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。

样品（土壤）处理：室温风干
二、土壤中放线菌的分离、培养
1、配制淀粉培养基
淀粉琼脂培养基（高氏培养基）
可溶性淀粉2g；硝酸钾0.1g；磷酸氢二钾0.05g；氯化钠0.05g；硫酸镁0.05g；硫酸亚铁0.001g；琼脂2g；水100ml.
先把淀粉放在烧杯里，用5ml水调成糊状后，倒入95ml水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。

加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。

调整PH到7.2-7.4，分装后灭菌，备用。

2、土壤悬液梯度稀释
①将5.0g土壤加入到50ml灭菌的生理盐水中，震荡10min制备土壤悬液。

②用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml灭菌的生理盐水中10倍稀释。

③按1：:1稀释至10-3、10-4、10-5，将3块灭菌平板分别标记10-3、10-4、10-5 ，稀释过程应在无菌条件下进行。

3、将高氏一号培养基加热溶化，待冷至55-60℃时，加入3%的重铬酸钾数滴（大约100ml加0.3ml），混合均匀。

分别吸取0.1ml稀释液于灭菌平皿中，再加入10-15ml恒温于55℃的含有重铬酸钾的淀粉琼脂培养基中，轻轻旋转混合均匀。

4、平皿倒置于培养箱28℃恒温培养一周左右。

5、将平皿上的放线菌菌落跳去在淀粉琼脂平皿上四区划线进行分离纯化，28℃恒温培养一周左右，观察放线菌菌落特征。

6、将纯化好的菌落转入到斜面，4℃条件下进行保存。

三、抗菌谱的测定
1、挑取一个放线菌的菌落接种到含有250ml淀粉液体培养基的三角瓶，28℃恒温培养一周左右。

2、将2ml培养8h的大肠杆菌分别加到200ml灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基中混合均匀，每培养皿中倒入20ml，凝固后待用。

3、在上面培养皿中均匀放入4个牛津杯，每个牛津杯中加入1ml放线菌发酵培养液。

培养皿放入37℃培养箱恒温培养12h。

4、测量抑菌圈的大小。

四、发酵
1、配制种子培养基
蔗糖22.5g，黄豆粉12.5g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钠1g，硫酸钠0.1g，硫酸亚铁0.01g，碳酸钙2g，蒸馏水1000ml，PH值7.2,121℃灭菌20min。

2、配制发酵培养基
蔗糖45g，黄豆粉25g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钠1g，硫酸钠0.1g，硫酸亚铁0.01g，碳酸钙3g，蒸馏水1000ml，PH7.2。

121℃灭菌20min。

3、种子液的制备
将试管斜面菌种转管活化，28℃培养7天后，以接种取一环孢子转入装有50ml种子培养基的250ml三角摇瓶中，于28℃200r/min-1 培养4天。

4、发酵培养
以6%的接种量将种子液转接入装有50ml初始发酵培养基的250ml三角摇瓶中，于28℃200r/min-1培养4天。

5、活性检测
发酵液经4000r/ min-1 离心15min，取上清，杯碟法测定抗菌活性（同三）。

五、提取
1、发酵液经4000r/ min-1 离心15min，取上清，用乙酸乙酯以1:1的比例进行萃取。

2、活性检测
将萃取液浓缩，杯碟法测定抗菌活性（同三）。