实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色

（二）细菌的简单染色 4、染色 滴加染液覆盖涂菌部位即可。 染色时间：吕氏碱性美蓝 1.5min； 草酸铵结晶紫或齐氏石炭酸复红 1min 5、水洗 倒去染液，用自来水冲洗，直至图片上留下的水无色 为止。 注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻 片的一端留下，水流不宜过急、过大，以免涂片薄 膜脱落。
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一、实验目的
1、熟练掌握无菌操作技术（从试管菌种 中转接微生物到新的试管培养基中）， 体会无菌操作的重要性；
2、学习并掌握微生物的制片及简单染色 的基本技术。
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二、实验原理
1、高温对微生物具有致死效应，因此在微生 物的转接过程中，一般在酒精灯火焰旁进行， 并用火焰直接灼烧接种环（针、铲），以达 到灭菌的目的。 2、简单染色：利用单一染料对菌体进行染色 的方法。
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五、实验操作 （二）细菌的简单染色 1、涂片 在载玻片的中央滴一小滴蒸馏水，用接种环以无菌操 作从大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌斜 面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜（直 径约1cm）。 注意事项：1）载玻片要洁净无油迹； 2）滴生理盐水或取菌不宜过多； 3）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。
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三、实验仪器与用具 超净工作台、接种环、酒精灯、火柴、试管架、 显微镜、擦镜纸、双层瓶、装有蒸馏水的滴 瓶等 四、实验材料与试剂 大肠杆菌（E.coli）营养琼脂培养基 枯草芽孢杆菌（B.subtilis）营养琼脂斜面 金黄色葡萄球菌（S.aureus）营养琼脂斜面
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五、实验操作 （二）细菌的简单染色 6、干燥 用吸水纸吸取多余的水分，自然干燥或电吹风 吹干。 7、镜检 涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。
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六、实验作业 1、根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。 2、在进行细菌涂片时应注意哪些环节？ 3、进行细菌制片时为什么要进行加热固定？在 加热固定时应注意什么？ 4、进行简单染色的目的及原理是什么？进行微 生物制片时是否都需要进行染色？为什么？
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二、实验原理
发色集团：色原，赋予染料颜色特征 染料
助色集团：能够形成盐，与细菌细胞结合使着色。
碱性染料：包括美蓝（亚甲基）、结晶紫、 染料 碱性复红、沙黄（番红）及孔雀绿等 酸性染料：酸性复红、伊红和刚果红等。
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二、实验原理
微生物细胞在碱性、 中性及弱酸性溶液中通常 带负电荷，而碱性染料电离后部分带正电荷， 很容易与细胞结合使其着色； 当微生物细胞处于酸性条件下所带正电荷增加 时，可采用酸性染料着色。
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五、实验操作
（一）无菌操作技术（用接种环转接菌种） 1、手持试管 左手：拿细菌斜面培养物和营养斜面 右手：持接种环
2、拔棉塞
在火焰旁打开斜面培养物的试管棉塞，注意不能放在 桌面上，并将试管口在火焰上灼烧一下。
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（一）无菌操作技术（用接种环转接菌种）
3、取菌 使用灼烧并冷却的接种环在细菌的琼脂斜面上 轻轻刮取。 4、划线 从下到上划一直线，然后再从其底部开始向上 做蛇形划线（或“之”字形）
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（一）无菌操作技术（用接种环转接菌种）
5、塞棉塞 6、灼烧接种环 7、作标记
使用记号笔在试管口部注明菌种名称、接种日 期和接种人姓名。
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（二）细菌的简单染色 2、干燥 自然干燥 3、固定 涂面朝上，通过火焰2~3次。 固定的目的：1）使细胞质凝固变性，固定细 胞形状；2）使菌体牢固附着在载玻片上。 注意：热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫 手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。
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