最新酶分子定向进化
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• 不同点： DNA家族重排技术从基因家族的若干同 源基因出发进行DNA序列的重新排布，而后者则 从采用易错PCR等技术所获得的两个以上的正突 变基因出发进行DNA序列的重新排布。
第三节 酶突变基因的定向选择
• 突变基因的定Biblioteka Baidu选择基本过程
突变基因
基因载体
基因重组 突变基因文库
筛选
目的基因
一 酶突变基因文库的构建
基因重组
在体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载 体连接在一起形成重组DNA的技术过程。
酶分子定向进化
• 简称酶定向进化，是模拟自然进化过程 （随机突变和自然选择），在体外进行酶 基因的人工随机突变，建立突变基因文库， 在人工控制条件的特殊环境下，定向选择 得到具有优良催化特征的酶的突变体的技 术过程。
酶定向进化的基本过程
• 随机突变、构建突变基因文库、定向选择 • 酶定向进化的基本过程：
• （一）构建基因文库的质量要求 • 1 文库的包容性:指构建的文库必须尽可能地
包含基因的任何一种可能的突变信息。 • 2 文库的完整性：指文库中包含的DNA片
断必须尽可能完整地反应基因的结构和功 能信息，以便通过筛选得到的突变基因能 够通过表达获得完整的具有催化功能的进 化酶。
（二）构建突变基因文库的主要过程
• 在PCR技术的基础上，通过改变反应条件， 增加碱基配对错误的出现频率，就成为易 错PCR技术。
• 可以通过提高镁离子浓度、添加一定浓度 的锰离子、改变4种底物（dAMP、dTMP、 dCMP、dGMP）的浓度比等反应条件，使 DNA聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基 配对错误的出现频率，而引起基因突变。
酶基因
随机突变
反复进行
负突变基因
构建突变基因文库
筛选
正突变基因
进化酶
• 随机突变的策略 易错PCR技术(error-prone PCR) DNA改组(DNA shuflling):由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术 随机引发重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了 一种有效的新方法 交错延伸技术(StEP):由Zhao 等 提出, 是一种 简化的DNA shuffling 技术 基因家族重排技术
DNA重排技术的基本过程
两条以上正突变基因
酶切
DNA随机片断
无引物PCR
突变基因
基因重组
构建突变基因文库
酶切 （反复进行）
负突变基因
筛选
正突变基因 进化酶
• DNA重排技术将两条或多条正突变基因通过脱氧 核糖核算酶Ⅰ（DNase Ⅰ)等酶的作用，随机切割 成若干DNA片断，然后将这些随机片断在不加引 物的条件下经过多次PCR循环，使这些DNA随机 片断互为模板和引物进行扩增、延伸，再加入适 宜的引物进行PCR反应，获得全长基因。
特点
• 正突变的概率低，突变基因文库较大，文 库筛选的工作量大，一般适用于较小基因 的定向进化。
二 DNA重排技术
• 概念：又称为DNA改组技术，是从正突变 基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切 割成随机片断，经过不加引物的多次PCR循 环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基 因突变的技术过程。
• 2）随机引物体外重组技术
• 采用单链DNA为模板，配合若干条随机序 列的引物进行PCR反应，产生若干个与模板 不同部分的序列互补DNA小片断，然后除 去模板，这些DNA小片断互为模板和引物 进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获 得全长突变基因。
三基因家族重排技术
• 概念
• 又称为基因家族改组技术，是从基因家族 的若干同源基因出发，用酶(DNase Ⅰ)切割 成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环， 使DNA的碱基序列发生重新排布而引起基 因突变的技术过程。
基因家族重排技术的基本过程
基因家族若干同源基因
酶切
DNA随机片断
无引物PCR 突变基因
基因重组 突变基因文库
酶切 反复进行
负突变基因
筛选
正突变基因
进化酶
DNA家族重排技术与DNA重排技术的异同点
• 相同点：DNA家族重排技术与DNA重排技术的过 程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物 PCR等步骤以获得突变基因，然后经过构建突变 基因文库、采用高通量筛选技术筛选获得正突变 基因。
酶分子定向进化
• 天然酶的应用及局限性 酶的定向进化的思想 酶的定向进化的策略和方法 酶的定向进化技术的展望
分子定向进化
• 分子定向进化是在分子水平上进行定向进 化的过程。
• 分子定向进化首先要通过从细胞内提取或 者通过PCR等方法获得目标分子的基因，在 体外采用易错PCR 、ＤＮＡ重排、基因家 族重排等技术进行人工突变，然后进行定 向选择而获得所需突变体。
•
酶定向进化的特点
1 适应面广 2 目的性强 3 效果显著
第二节 酶基因的随机突变
• 体外随机突变的方法：PCR技术、DNA重 排技术、基因家族重排技术
• 基因随机突变方法的特点P207表8－1 • 随机突变方法可以联合使用，交叉进行，
通过多次试验，反复筛选，以完成对酶的 定向进化。
一 易错PCR技术
• 这些全长基因由于是在不加引物的条件下由DNA 随机片断互为模板和引物扩增而成的，其碱基序 列经过重新排布而形成众多的突变基因。
• 1）交错延伸PCR技术：在同一个反应体系中以两 个或多个相关的DNA片断为模板进行PCR反应， 把PCR反应中常规的退火和延伸合并为一步，并 且大大缩短了反应时间（55℃，5s)。在反应过程 中，引物先与一个模板结合，进行延伸，随之进 行多次变性和短时的退火－－延伸反应循环，在 每个循环中，不同长度的延伸片断在变性时与原 先的模板分开，退火时与另一个模板结合，再进 行延伸。通过在不同的模板上交替延伸，所合成 的DNA片断中包含有不同模板上的信息，直到获 得全长的突变基因为止。
• 载体的选择 1）质粒载体：微生物细胞染色体外，闭合环状双链
DNA分子。 2）噬菌体DNA载体：由噬菌体DNA改造而成的具
有自我复制能力的载体。 3）黏粒载体：是一类人工构建的含有λDNA黏性
末端和质粒复制子的质粒载体，又称为柯斯质粒。 4）噬菌粒载体：是一类人工构建的由M13噬菌体单
链DNA的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因 载体。
第三节 酶突变基因的定向选择
• 突变基因的定Biblioteka Baidu选择基本过程
突变基因
基因载体
基因重组 突变基因文库
筛选
目的基因
一 酶突变基因文库的构建
基因重组
在体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载 体连接在一起形成重组DNA的技术过程。
酶分子定向进化
• 简称酶定向进化，是模拟自然进化过程 （随机突变和自然选择），在体外进行酶 基因的人工随机突变，建立突变基因文库， 在人工控制条件的特殊环境下，定向选择 得到具有优良催化特征的酶的突变体的技 术过程。
酶定向进化的基本过程
• 随机突变、构建突变基因文库、定向选择 • 酶定向进化的基本过程：
• （一）构建基因文库的质量要求 • 1 文库的包容性:指构建的文库必须尽可能地
包含基因的任何一种可能的突变信息。 • 2 文库的完整性：指文库中包含的DNA片
断必须尽可能完整地反应基因的结构和功 能信息，以便通过筛选得到的突变基因能 够通过表达获得完整的具有催化功能的进 化酶。
（二）构建突变基因文库的主要过程
• 在PCR技术的基础上，通过改变反应条件， 增加碱基配对错误的出现频率，就成为易 错PCR技术。
• 可以通过提高镁离子浓度、添加一定浓度 的锰离子、改变4种底物（dAMP、dTMP、 dCMP、dGMP）的浓度比等反应条件，使 DNA聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基 配对错误的出现频率，而引起基因突变。
酶基因
随机突变
反复进行
负突变基因
构建突变基因文库
筛选
正突变基因
进化酶
• 随机突变的策略 易错PCR技术(error-prone PCR) DNA改组(DNA shuflling):由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术 随机引发重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了 一种有效的新方法 交错延伸技术(StEP):由Zhao 等 提出, 是一种 简化的DNA shuffling 技术 基因家族重排技术
DNA重排技术的基本过程
两条以上正突变基因
酶切
DNA随机片断
无引物PCR
突变基因
基因重组
构建突变基因文库
酶切 （反复进行）
负突变基因
筛选
正突变基因 进化酶
• DNA重排技术将两条或多条正突变基因通过脱氧 核糖核算酶Ⅰ（DNase Ⅰ)等酶的作用，随机切割 成若干DNA片断，然后将这些随机片断在不加引 物的条件下经过多次PCR循环，使这些DNA随机 片断互为模板和引物进行扩增、延伸，再加入适 宜的引物进行PCR反应，获得全长基因。
特点
• 正突变的概率低，突变基因文库较大，文 库筛选的工作量大，一般适用于较小基因 的定向进化。
二 DNA重排技术
• 概念：又称为DNA改组技术，是从正突变 基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切 割成随机片断，经过不加引物的多次PCR循 环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基 因突变的技术过程。
• 2）随机引物体外重组技术
• 采用单链DNA为模板，配合若干条随机序 列的引物进行PCR反应，产生若干个与模板 不同部分的序列互补DNA小片断，然后除 去模板，这些DNA小片断互为模板和引物 进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获 得全长突变基因。
三基因家族重排技术
• 概念
• 又称为基因家族改组技术，是从基因家族 的若干同源基因出发，用酶(DNase Ⅰ)切割 成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环， 使DNA的碱基序列发生重新排布而引起基 因突变的技术过程。
基因家族重排技术的基本过程
基因家族若干同源基因
酶切
DNA随机片断
无引物PCR 突变基因
基因重组 突变基因文库
酶切 反复进行
负突变基因
筛选
正突变基因
进化酶
DNA家族重排技术与DNA重排技术的异同点
• 相同点：DNA家族重排技术与DNA重排技术的过 程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物 PCR等步骤以获得突变基因，然后经过构建突变 基因文库、采用高通量筛选技术筛选获得正突变 基因。
酶分子定向进化
• 天然酶的应用及局限性 酶的定向进化的思想 酶的定向进化的策略和方法 酶的定向进化技术的展望
分子定向进化
• 分子定向进化是在分子水平上进行定向进 化的过程。
• 分子定向进化首先要通过从细胞内提取或 者通过PCR等方法获得目标分子的基因，在 体外采用易错PCR 、ＤＮＡ重排、基因家 族重排等技术进行人工突变，然后进行定 向选择而获得所需突变体。
•
酶定向进化的特点
1 适应面广 2 目的性强 3 效果显著
第二节 酶基因的随机突变
• 体外随机突变的方法：PCR技术、DNA重 排技术、基因家族重排技术
• 基因随机突变方法的特点P207表8－1 • 随机突变方法可以联合使用，交叉进行，
通过多次试验，反复筛选，以完成对酶的 定向进化。
一 易错PCR技术
• 这些全长基因由于是在不加引物的条件下由DNA 随机片断互为模板和引物扩增而成的，其碱基序 列经过重新排布而形成众多的突变基因。
• 1）交错延伸PCR技术：在同一个反应体系中以两 个或多个相关的DNA片断为模板进行PCR反应， 把PCR反应中常规的退火和延伸合并为一步，并 且大大缩短了反应时间（55℃，5s)。在反应过程 中，引物先与一个模板结合，进行延伸，随之进 行多次变性和短时的退火－－延伸反应循环，在 每个循环中，不同长度的延伸片断在变性时与原 先的模板分开，退火时与另一个模板结合，再进 行延伸。通过在不同的模板上交替延伸，所合成 的DNA片断中包含有不同模板上的信息，直到获 得全长的突变基因为止。
• 载体的选择 1）质粒载体：微生物细胞染色体外，闭合环状双链
DNA分子。 2）噬菌体DNA载体：由噬菌体DNA改造而成的具
有自我复制能力的载体。 3）黏粒载体：是一类人工构建的含有λDNA黏性
末端和质粒复制子的质粒载体，又称为柯斯质粒。 4）噬菌粒载体：是一类人工构建的由M13噬菌体单
链DNA的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因 载体。