基因敲除方法专题-郭..55页PPT

生物学家的梦想：随心所欲地操作基因
经典基因操作： 1. Gene trap: 化学诱变； 转座子--------海量的筛选+good Luck 2. 同源重组：一般物种几率低, 10-6 ； ES cell 10-2 难！ 3.突破性的发现： RNAi-Knockdown; 不完全敲除，临时性。
4.充满梦想却幻灭的ZFN： • 难以完全找到匹配的3连子锌指； • Off-target 严重。 美国加州大学Dave Segal教授说： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target” 5.完美基因靶向操作： 识别特异DNA序列结构+操作DNA的酶 划时代的基因靶向操作技术： TALE与 CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦
前言
Ø什么是基因？
Ø为什么要研究基因？
Ø如何研究？
位置—分类--结构—功能
原核体外表达
蛋白质功能 体外鉴定
真核过表达 转基因
基因敲除
进一步验证
定量表达 表达规律-qPCR
体内蛋白水平 验证
Western blotting
如何获取基因
Ø同源克隆： 已知基因序列比对---保守区---简并引物设计---未知物种中分离 ---RACE获得全长---结构解析---表达分析---功能比较与验证等
杆线虫(Caenorhabditis.elegans)
的par-1基因的表达以探讨该基因 的功能,结果反义RNA的确能够阻断 基因的表达,但是奇怪的是,注入正 义链RNA(sense RNA)作为对照,也 同样阻断了基因的表达。这与传统 上对反义RNA技术的解释正好相反
反义RNA技术
• 反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其它RNA互 补的RNA分子。
• 根据反义RNA的作用机制可将其分为3类：
• Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA的S D序列(ShineDalgarno sequence）和(或)部分编码区，直接抑制 翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶 Ⅲ 降解
• 由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异 性的互补结合, 即抑制了该mRNA的翻译。通过反义RNA控制 mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方 式，最早是在 E.coli 的产肠杆菌素的Col E1质粒中发现的，许多实验证明在真 核生物中也存在反义RNA。
反义RNA技术
差异性状---基于已知序列---高通量表达差异分析---确定大量关 联基因---新基因---价格昂贵---数据分析处理复杂
图位克隆
群体至关重要---工作量超大ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ--获得基因随机---仍是王道
Ø图位克隆策略
寻找性状差异 或突变体
选择父母本 杂交-F1 自交 构建群体 表型统计
差异显著（最好其他性状差异较小） 不分离 性状分离 单粒传
➢ 然而，并非只有植物学家才注意到了这种意外的现象 。意大利的Cogoni等,将外源类胡萝卜素基因导入链
孢霉(Neurosporacrassa),结果转化细胞中内源性的
类胡萝卜素基因也受到了抑制。而在真菌转基因实验 中这种共抑制现象被称为“quelling”现象。
What’s more...
• 2019年康乃尔大学的研究人员Guo 和Kemphues尝试用反义RNA (antisense RNA)去阻断秀丽新小
优点：简单，短平快 局限：过于简单，技术含量低，非新基因，文章水平相对较低
后续试验内容需增加
Ø蛋白差异分析： 性状差异---双向电泳---蛋白点分离---氨基酸组成分析---序列 端部分析---DNA信息
差异蛋白点过多，测序片段随机且过短，氨基酸→碱基序列简并 性过高
Ø高通量基因芯片（诺丁汉大学—陆春贵博士）：
RNAi技术被《Science》杂志评为2019年的十大科学进展之 一，并名列2019年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可 以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛 用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域 。 2019年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛（Craig C. Mello） 由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。
基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基 因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中 序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替 受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整 合入受体细胞的基因组中，达到定点修饰或改造 染色体上某一基因的目的。
Ø 基因敲除的方法
u同源重组敲除技术 u条件性基因敲除法 u诱导性基因敲除法 u锌指核酸酶(ZFNs)技术 uRNA干扰技术 uTALEN技术 uCRISPR-Cas9技术
分子标记
SSR等
软件分析初步定位
回交-扩大群体 近等基因系
精细定位 1-5cM甚至更小 基因组探针筛选 目标基因连锁的分子标记 叠连克隆群 染色体步移
外显子的分离、鉴定
确定基因 功能互补实验
转基因过表达、基因敲除
基因敲除专题
Ø 基因敲除概述 基因敲除(knockout)是一种遗传工程基因修
饰技术，针对某个感兴趣的遗传基因，通过一定 的基因改造过程，令特定的基因功能丧失，并研 究可能进一步对相关生命现象造成的影响，进而 推测该基因的生物学功能。
我们不再大海捞针！！！
RNA干扰技术
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高 度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱 发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。是真核生物中存在 的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控 机制，具有重大生物学意义。
一、RNAi的发现简史
➢ 90年代初，Rich Jorgensen和其同事,在对矮牵牛(petunias)进行 研究中有个奇怪的发现:将一个能产生红色素的基因置于一个强启 子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜 色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多 数花成了花斑的甚至白的。Jorgensen 将这种现象命名为 共抑制现象(cosuppression), 因为导入的基因和其相似的内源基因同时都 被抑制。开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象。