微生物学实验指导

常用培养基的配制、分装和灭菌一、实验目的了解细菌、放线菌、真菌通用培养基制作的一般方法和操作步骤。

了解微生物培养基的原理。

二、实验内容1. 牛肉膏蛋白陈培养基的配制。

2．高氏1 号培养基的配制。

3．PDA培养基的配制。

三、实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、马铃薯、1mol/L NaOH、lmol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O。

试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH 试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。

四、操作步骤（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是培养异养细菌最常用的是牛肉膏蛋白胨培养基，为天然培养基。

牛肉膏是牛肉浸液的浓缩物，含有丰富的营养物质，不仅为微生物提供碳源、氮源，还含有多种维生素。

蛋白胨是酪蛋白、大豆蛋白、鱼粉等经蛋白酶水解后的中间产物，含有、胨和氨基酸等丰富的含氮素营养物，因此能完全满足大多数异养细菌对营养的需要。

其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10 g，Nacl 5 g，琼脂15～20 g，水1000 mL，pH 7.4～7.61．称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。

牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片。

蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。

2．加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。

若配制试管斜面固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。

若是在平皿中制成平板固体培养基，则将称好的琼脂放入三角瓶中，放入高压灭菌锅灭菌，灭好菌后再倒入平皿。

3．调pH 检测培养基的pH，若pH 偏酸，可滴加l mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH 试纸检测，直至达到所需pH 范围。

若偏碱，则用l mol/L HCl 进行调节。

pH 的调节通常放在加琼脂之前。

应注意pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。

4．过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用 4 层纱布趁热过滤，以利培养的观察。

但是供一般使用的培养基，这步可省略。

5．分装按实验要求，可将配制的培养基分装入三角瓶内。

做试管斜面分装入试管时，将已煮好的培养基趁热分装于试管中，分装装置可用带铁环和漏斗的分装架，分装时，试管垂直桌面，注意不要使培养基残留在试管口附近，以免污染。

一般培养基装量为试管长度的1/5～1/4，塞上乳胶塞。

分装量：固体培养基约为试管高度的l/5，灭菌后制成斜面。

分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。

6．加试管塞试管口和三角瓶口塞上试管塞。

7．包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿试管塞。

若培养基分装于试管中，则应以5 支或7 支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。

然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。

8．灭菌将上述培养基于121.0℃湿热灭菌20min。

如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。

9．摆斜面灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使之自然冷却，凝固成斜面，斜面的长度约为试管长的1/2，斜面摆好后，在培养基凝固以前，不宜再移动。

10．无菌检查将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24 h～48 h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。

（二）高氏l 号培养基的配制高氏1 号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。

其配方如下：可溶性淀粉20 g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂15～20g，水1000 mL，pH 7.4～7.6。

l．称量和溶解先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。

再加入其他成分依次溶解。

对微量成分FeSO4·7H2O 可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在1000mL 中加入1g 的FeSO4·7H2O，配成浓度为0.01g/mL 的贮备液，再在1000 mL培养基中加入以上贮备液1mL 即可。

待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

2．pH 调节、分装、包扎及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

（三）PDA培养基的配制PDA培养基是用于培养真菌常用的培养基，其配方如下：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 mL，pH自然。

1．配制：将去皮的马铃薯切成小块，加水1000毫升，煮沸15－20分钟，用四层纱布过滤，取其滤液，加入琼脂用文火使其溶化（若使用琼脂条可先剪成小段，煮琼脂时要多搅拌，直至完全溶化），最后补足水分至1000 mL。

搅拌均匀。

2．pH 调节、分装、包扎及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15 mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。

五、注意事项称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。

调pH 时要小心操作，避免回调。

不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。

六、实验报告记录本实验配制培养基的名称、数量，指明要点。

本组做了高氏1 号培养基30个要点：溶解药品时，一定要变加热边溶解；还有，溶解淀粉时，用少量水溶解，然后在加大量水。

七、问题和思考l．配制培养基有哪几个步骤? 培养基中加琼脂的作用是什么？琼脂融化要注意什么？配置培养基的步骤：计算→称量→溶化→调节pH→分装→加棉塞→包扎→灭菌→搁置斜面加琼脂的作用：充当固化剂，起支持作用。

琼脂融化注意：温度不能太高也不能太低；受热均匀；加热完后，在合适的温度倒平板，防止凝固。

2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?很明显，培养基里含有丰富的氮源，碳源，微量元素等等。

如果不立即灭菌，那么，就会长菌。

你可能会认为再灭菌不就可以了？！但是，很多的微生物，特别是真核微生物在生长的时候会改变溶液的PH，同时灭菌后细胞破碎，带入新的氨基酸，蛋白等，这些都是试验不稳定的因素。

如果不能立刻灭菌，应该在配置培养基的时候直接称取粉末，不加入水溶解，可在室温保存。

如果加入的是液体的，已经配置好的培养基，应该在4度并保存，但时间不宜过长。

已经灭菌的培养基灭菌时残留有生命力的孢子或在贮存时有可能被杂菌污染，所以在使用该培养基时要进行无菌检查通常是放在37℃的恒温箱中一两天后培养基上没有生长任何微生物的就可以使用（若有微生物则是以菌落出现的肉眼可以看见的）土壤中微生物的分离、纯化——微生物的纯培养一、实验目的了解微生物分离和纯化的原理；掌握常用的分离纯化微生物的方法。

二、实验原理从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。

平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。

其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。

因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。

值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。

因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。

因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

三、实验器材3.1 培养基淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，PDA培养基。

3.2 溶液或试剂盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。

3.3 仪器或其它用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，土样，显微镜。

四、实验步骤4.1 稀释涂布平板法1．取土壤取表层以下5—10cm 处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。

2．制备稀释液(要无菌操作)(1)制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的 49.5 mL 无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡5～10 min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。

(2)稀释：用无菌移液管吸10-2 的土壤悬液0.5 mL，放入4.5 mL 无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-8 的稀释液。

注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸 3 次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。

3. 混菌法测定菌落数的方法(1)细菌：取10-7、10-6、10-5三管稀释液各1mL，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。

然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底高1.5～2mm 为宜)，迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。

倒平板时要注意无菌操作。

（2）放线菌：分别取10-5、10-4、10-3三管稀释液1mL 加入相应标号的平皿中，选用高氏1 号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板。

（3）霉菌：取10-2、10-3、10-4两管稀释各1mL，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。

选用融化的PDA培养基中，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌的平板。

4．培养将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28～30℃中恒温培养，细菌培养1～2d，放线菌培养5～7d，霉菌培养3～5d。

观察生长的菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。

4.2 平板划线分离法1. 倒平板按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和划线。