微生物学实验原理及思考题答案

七。酵母菌形态观察及死活细胞的鉴别
原理：酵母菌是多行的，不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显分化，菌体比细菌大。美蓝是一种无毒性染料，他的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于活细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能是美蓝由蓝色的氧化型变成无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色。
酸奶制作为什么混菌发酵？
为了发酵均匀和完全
十。质粒DNA的小量制备
原理：在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭质粒DNA仍为自然状态。
将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
1.用玻璃纸法接种时，注意玻璃纸与培养基之间不能有气泡，以免影响其表面放线菌的生长。
操作过程，切勿动玻璃纸菌面上的培养物。
玻璃纸培养和观察法是否可以应用于其他微生物类群的培养和观察？为什么？
可以应用于霉菌。
镜检时，如何区别放线菌的基内菌丝和气生菌丝？
基内菌丝分枝繁茂，无色或产生水溶性或脂溶性色素而呈现黄、绿、橙、红、紫、蓝、褐、黑等各种颜色。气生菌丝颜色较深且较基内菌丝粗，直径为1～1.4μm，直形或弯曲状，有分枝，有的产生色素
染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。
哪些因素能影响鞭毛染色结果？如何控制？
选取的细菌菌种及菌龄要适宜；镀银法染色液必须现配先用；
操作要小心，防止鞭毛脱落；染色用玻片干净无油污
鞭毛染色的菌种为什么要连续传种几代，并且要采用幼龄菌种？
因为菌龄较老的细菌容易失落鞭毛。
五。细菌数量的测定
1.称药品的钥匙不要混用
称完药品应及时盖紧瓶盖，因为某些成分如蛋白胨极易吸水潮解
调PH时要小心操作，避免回调。
配制培养基应注意哪些问题？
要选定合适的培养基;培养基成分要称量准确；PH要适宜；灭菌要严格。
培养基配制完成后为什么要立即灭菌？已灭菌的培养基如何进行无菌检查？
防止细菌污染培养基
制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？
油和水之间会分层，油就不能与标本接触还有光会发生折射等等原因，这样不利于油镜观察
三。细菌的革兰氏染色法
原理：细菌先经碱性染料结晶紫染色，而经碘液媒染后用酒精脱色，在一定条件下有的细菌紫色不被脱去，为G+，有的可被脱去，为G-.
1.革兰氏染色成败的关键是乙醇脱色。脱色过度，阳性细菌被染成阴性细菌，脱色不足，阴性细菌被染成阳性细菌
细菌：为细而短的单细胞微生物（个体微小），主要形态有：球、杆、螺旋状等。（部分杆菌还可形成芽孢）
放线菌：存在分枝丝状体和菌丝体，革兰氏阳性菌，有孢子丝和孢子（球形、椭圆形、杆状、柱状）。
酵母菌：单细胞，菌体呈圆球、卵形或椭圆形，少数呈柠檬形、尖形等。菌体比细菌大几倍到几十倍，部分处于出芽繁殖过程中菌体还可观察到芽体，大多数菌体上还有芽痕。
霉菌：菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍到几十倍，在低倍镜下即可看到，并还可看到孢子囊梗、囊轴、孢子囊、包囊孢子等。
九。酸奶的制备和乳酸菌的分离
原理：乳酸菌将牛奶中的乳糖发教程乳酸使其PH降至酪蛋白等电点附近从而使牛奶形成凝胶状；其次，乳酸菌还会促使部分酪蛋白降解，形成乳酸钙和产生一些脂肪，乙醛，双乙酰和丁二酮等风味物质。发酵过程通过双菌或多菌的混合培养实现。其中杆菌先分解酪蛋白为氨基酸和小肽，由此促进了球菌的生长，而球菌产生的甲酸又刺激了杆菌产生大量乳酸和部分乙醛，此外球菌还产生了双乙酰这类风味物质，达到了稳定状态的混合发酵。
1.染液不宜过多或过少，否则再盖上盖片时菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。
盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。
美蓝染色法对酵母细胞进行死活鉴别时为什么要控制染液浓度和染色时间。
美蓝浓度高和染色时间过长都会增加酵母菌的死亡，美兰有氧化性，浓度太高会使活菌很快致死，浓度低老龄细胞与活细胞不易区分；染色时间短，活细胞还没从蓝变无色，观察到的活细胞数量会比预计的少，染色时间长，活细胞数量也会减少
涂片务必均匀，切忌过厚，以免脱色不彻底造成假阳性
要用活跃生长期的适龄菌，老龄菌因体内核算减少或菌体死亡，会使阳性菌被染成阴性菌，故不建议使用。
为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不超过24h？
若菌龄太老,由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应,关键在于细胞壁的通透性的改变，使结晶紫染液可以脱色透出。
1.注意提取质粒DNA的各步骤应始终在低温下进行。
每个样品重复2~3次，若两次差别太大应重测。
哪些因素会造成血细胞计数板的计数误差，应如何避免 ？
仪器的准确度和操作的规范性
所用器材均应清洁干燥，计数板的规格应符合要求或经过校正；必须一次性充满计数室，防止产生气泡。
六。放线菌的形态和结构观察
原理：放线菌细胞一般呈分枝无隔的丝状，纤细的菌丝体分为基内菌丝和气生菌丝.采用插片法观察放线菌。将盖玻片倾斜约45°角插入琼脂表面，然后将放线菌接种于盖玻片与培养基接缝处，经培养使放线菌生长在盖玻片上。观察时将盖玻片取下，贴放在载玻片上，直接镜检。
四。细菌的鞭毛染色法
原理：染色前先用媒染剂处理，让他沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。
1.镀银法染色染色液必须现配先用，不能存放。
Leifson染色法受菌种，菌龄和室温等因素的影响，且染色液须经15~20次过滤，要掌握好染色条件
细菌鞭毛极细，很易脱落，在整个操作过程中药小心，防止鞭毛脱落。
显微镜下，酵母菌有哪些特征区别于一般细菌？
酵母菌菌体呈圆形、卵形或椭圆形不同于一般细菌的形状；酵母菌菌体比一般细菌大。
八。霉菌形态的观察
原理：霉菌营养体是分支的丝状体，分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝又可分化出繁殖丝。不同霉菌的繁殖丝可形成不同的孢子。霉菌的个体比细菌和放线菌大的多，故用低倍镜即可观察，常用的观察方法有直接制片观察，载波湿室培养观察法和玻璃纸透析培养法三种。霉菌菌丝体较粗大，细胞易收缩变形，且孢子丝易飞散，故在直接制片观察时常用乳酸石碳酸棉兰染色液。其优点是：细胞既不变形，又具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间，还能防止孢子飞散。染液的蓝色能增强反差，使物象更清楚。
一旦细菌污染了培养基，由于培养基有丰富的营养物质，细菌会段时间内大量产生
这样子就会跟培养物争夺营养物质，另一方面，细菌生长过程中会产生有毒物质致使培养物死亡。放在37℃的恒温箱中一两天后，培养基上没有生长任何微生物的就可以使用（若有微生物则是以菌落出现的 肉眼可以看见）
二。细菌的单染色技术
原理：单染色法师利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
油镜便于观察的原理是什么?
用油镜观察时在油镜与载玻片之间加入了和玻璃折射率相近的香柏油，使进入透镜的光线增多，视野亮度增强，使物象明亮清晰。
1.细调节器每旋转一周使镜筒上升或下降0.1mm.
一。培养基的配制
原理：微生物的生长发育都有一定的营养需要，培养基即人工培养物，为其生长发育提供所需营养的基质。培养基配制好以后必须经过灭菌方能用于分离培养微生物实验。一次培养基的配制和灭菌是微生物实验室中最基本的操作，通过本次实验学习微生物实验室中常用培养基的配制方法和灭菌方法。
原理：镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂质或杂菌常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板。血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。
1.有压线的菌体，每格只统计上方及右方线上的细胞
因菌液在血球计数板上处于不同的空间，要在不同的焦距下才能看全，所以观察时必须不断调节细螺旋方可找全。
1.琼脂块的制作应注意无菌操作
载玻片培养时，尽可能将分散的孢子接种在琼脂块边缘，且量要少，以免培养后菌丝过于稠密影响观察。
制片时，尽可能保持霉菌自然生长状态，加盖时勿入气泡和移位。
显微镜下，细菌，放线菌，酵母菌，和霉菌的主要区别？
放线菌与细菌需要在油镜下才能观察清楚，而霉菌和酵母菌在低倍镜下即可看到。
在中性，碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易于带负电荷的细菌结合而使细菌着色。
制备染色标本时的注意事项？
选择合适菌龄的细菌；固定时避免火焰直接烘烤破坏细菌形态；染色时间要适宜；水洗时水不能直接冲在涂片处。
当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样才能保证你的操作正确，结果可靠？
找事先已知的且和未知菌形态明显不同的G+和G-分别做混合涂片，当和G+做时G+正确显紫色和当和G-做时G-正确显红色，看这个未知菌分别显什么色，若一致，则可确定此菌为G+或G-。再回过头单做此未知菌的革兰氏染色，显现正确那就证明此染色技术操作正确。