异黄酮的生物合成及其调控

因表达受到各种光照因素的影响， 并且紫外光为最 有效光。但是随着在实验设置的紫外光处理时间范 围内（ ４， ８， １２ ｈ） 异黄酮的积累有所下 降 ， 而 ｐａｌ 基因的 ｍＲＮＡ 合 成 量 及 酶 活 性 却 在 增 加 。 这 说 明 大豆异黄酮合成过程中 ｐａｌ ｒＲＮＡ 及 ＲＮＡ 活性对异 黄酮的积累影响不大， ＰＡＬ 可能为非限速酶。 ２．３ 昼夜规则对异黄酮生物合成途径的调节
１ 异黄酮的生物合成途径
异黄酮类物质是由苯丙烷类代谢途径的一个 分支所合成的， 这个途径在整个植物界普遍存在， 它除了产生异黄酮类物质以外， 还产生另外一些 酚类化合物， 例如： 木质素、木脂素、黄酮、黄 酮醇、原花色素和花色素苷等。
如图 １ 所示， 从苯丙氨酸开始， 由苯丙氨酸 解氨酶将氨基酸的胺基脱去形成肉桂酸， 这个途
茉莉酮化合物能够诱导白羽扇豆在吸胀过程中 的种子的子叶的异黄酮含量的增加［１３］， 而且当大豆 的黄化苗受到伤害或被茉莉酮或者茉莉酸甲酯处理 后， 编码 ＣＨＳ 的基因会受到诱导［１４］。当大豆的黄化 苗受到损伤后， 黑暗的条件下培养， ８ ｈ 内， ＩＦＳ 的表达量增加了， 用茉莉酸甲酯处理黄化苗 ２ ｄ， 也 能 够 引 起 ＩＦＳ 表 达 的 逐 渐 增 加［４］。Ｃｒｅｅｌｍａｎ 等［１５］ 指出， 在植物抗病方面， 主要是依靠茉莉酸甲酯对 次生代谢产物的调节作用， 尤其体现在对查尔酮合 成 酶（ ＣＨＳ） 和 苯 丙 氨 酸 裂 解 酶（ ＰＡＬ） 基 因 的 调 节 上， 而 ＣＨＳ 是合成黄酮和异黄酮类物质的关键酶， ＰＡＬ 是 苯 丙 氨 酸 代 谢 途 径 的 关 键 酶 ， 茉 莉 酸 甲 酯 （ ＭｅＪＡ） 处理可使两者的 ｍＲＮＡ 少量增加。Ｌｏｕ 等［１６］ 对烟草的研究表明， 氮素的提供明显影响了茉莉酸 甲酯诱导的相关基因的表达： 与施低氮的条件相 比， 施高氮的条件下， 与茉莉酮诱导的相关基因能 更好的被正调节。有趣的是， 一组与酚类物质合成 的 相 关 基 因（ ＰＡＬ， Ｃ４Ｈ， ４ＣＬ） 所 表 现 出 的 调 节 形 式与酚类终产物的积累所表现出的调节形式是相反 的， 在茉莉酸甲酯的诱导下， 施高氮的条件下酚类 物 质 合 成 的 相 关 基 因（ ＰＡＬ， Ｃ４Ｈ， ４ＣＬ） 的 ｍＲＮＡ 量比在施低氮条件下高。
第 ３８ 卷 第 ５ 期 ２００７ 年 １０ 月 文章编号 １００５－ ９３６９（ ２００７） ０５－ ０６９２－ ０５
东北农业大学学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
异黄酮的生物合成途径及其调控
３８（５）： ６９２￣６９６ Ｏｃｔ． ２００７
图 １ 部分苯丙氨酸代谢途径 Ｆｉｇ． １ Ｔｈｅ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ
２ 异黄酮生物合成途径的调控
真菌诱导后， 发现黄酮类物质和异黄酮物质的 积累增加了， 这是因为合成异黄酮的基因在转录水 平上被激活。豆科和非豆科植物的代谢工程就是基 于在转录水平上对这些基因进行调节， 普遍的方法 是： 在转录水平上激活上游途径， 从而增加一系列 的中间产物， 或者是提供更多的底物， 还有很多环 境因素可以在转录水平上诱导合成异黄酮的合成— 包括生物的和非生物的因素。 ２．１ 代谢工程对异黄酮生物合成途径的调节
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东北农业大学学报
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用 。Ｙｕ［１０］ 等 将 玉 米 的 ＣＲＣ 转 录 因 子（ 之 所 以 称 此 转录因子为 ＣＲＣ 是因为： 插入一个 Ｒ 蛋白的融合 蛋白位于 Ｃ１ 的 ＤＮＡ 结合和激活区域中） 转入大豆 中， 收获 Ｒ４ 代重量接近 １５０ 和 ２５０ ｍｇ 的种子， 用 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ 分析， 发现 ＰＡＬ， Ｃ４Ｈ， ＣＨＩ， ＣＨＲ， Ｆ３Ｈ 和 ＤＦＲ 的表达量在含有 ＣＲＣ 转录因子的种子 中增加了。与对照相比， 含有 ＣＲＣ 转录因子的大 豆 中 ＩＦＳ 的 ｍＲＮＡ 含 量 在 种 子 发 育 的 两 个 阶 段 都 是相似的， 与其结果相似的是， 用蛋白质印迹技术 分析， ＩＦＳ 蛋白的总量在种子发育的两个阶段都没 有变化， 但是在含有 ＣＲＣ 转录因子的种子中两个 阶 段 ＣＨＳ 蛋 白 的 含 量 都 很 高 。ＩＦＲ 的 表 达 在 幼 嫩 的种子中没有被检测到， 只在比较成熟的种子中有 少许增加。在含有 ＣＲＣ 转录因子的种子中染料木 黄酮的含量减少， 而黄豆苷的含量增加了， 从而 使总异黄酮的含量增加了。在许多含有 ＣＲＣ 转录 因子的大豆中， 染料木黄酮的含量几乎为零， 并 且这种总异黄酮的含量增加伴随染料木黄酮含量 减少的现象能够稳定遗传。黄酮的产生途径和异 黄酮的产生途径是竞争性途径， 因此 Ｙｕ 等［１０］导入 了一个抑制 Ｆ３Ｈ 的表达基因， 抑制 Ｆ３Ｈ 与 ＩＦＳ 竞 争底物柚皮素， 从而阻断黄酮类物质的合成， 但 是这种方法并没有明显增加异黄酮的含量。但是， 抑制 Ｆ３Ｈ 的表达和 ＣＲＣ 转录因子的共同作用可以 使异黄酮含量比野生型大豆中的异黄酮含量提高 ４ 倍。 ２．２ 光照对异黄酮生物合成途径调节
在植物中合成异黄酮， 需要另外一种细胞色素 Ｐ４５０ 单加氧酶－ 异黄酮合酶（ ＩＦＳ） ， 它是一个形成各 种异黄酮类化合物的关键代谢酶。ＩＦＳ 将 ＣＨＩ 催化 形成的柚皮素转化形成产物染料木黄酮和黄豆苷。 黄豆苷和染料木黄酮可以和葡萄糖苷或丙二酰葡萄 糖苷相结合， 它们还有游离状态的， 都储存在液泡 当中。
物， 这可能是由于表达系统和试验分析条件的不 同所导致的［６］。Ｄｈａｕｂｈａｄｅｌ 等［７］报道了 ＩＦＳ２ 更容易 被病源菌所诱 导 ； Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ 等［８］发 现 ＩＦＳ１ 启 动 子在根的特异表达， 特别是在根毛和表皮细胞中 与 ＩＦＳ１ 酶共同作用参与异黄酮的合成， 从而促进 根瘤的形成。
代谢工程最明确的方法就是： 使一种限速酶过 量表达， 从而导致终产物含量的增加。目前还没有 有效的方法来确定苯丙烷类代谢途径中（ 包括异黄 酮代谢途径） ， 哪一个酶是限制催化速率的， ＰＡＬ， ＣＨＳ， ＩＦＳ 都是异黄酮合成途径的关键酶。玉米 Ｃ１
基因通过与许多苯丙烷类代谢途径基因的启动子中 共同的顺式元件相结合， 调节种子糊粉层特定组织 的花色素苷的生物合成。Ｃ１ 是一个 ｍｙｂ 类转录因 子， 通过和另外一个螺旋－ 环－ 螺旋结构的转录因 子 Ｒ 一 起 识 别 一 段 保 守 序 列“ＣＡＡＣＣＡＣＣ”激活了 整个途径的转录。并且 Ｃ１ 的同类物质形成了一个亚 族， 在许多物种中， 它们特定地调节花色素苷的形 成（ 激活或抑制） ， 例如： Ａｈａｒｏｎｉ 等［９］克隆和鉴定了 一个参与草莓果实黄酮类代谢途径的转录因子 ＦａＭＹＢＩ， 该转录因子抑制黄酮类合成的下游一些 步骤； ＦａＭＹＢＩ 基因在烟草中的超表达引起了花青 素和黄酮类化合物减少； 相反， 抑制或降低 ＦａＭＹＢＩ 就 会 增 加 花 青 素 和 黄 酮 类 化 合 物 的 积 累 。 除此以外， 一类抗病诱导 的 Ｍｙｂ 类 转 录 因 子 已 经 被报道， 它们属于比高度保守 Ｃ１ 亚族更多样性的 一个亚族， 它们在调节抗病的反应中起更重要的作
转录和转录后水平对异黄酮的生物合成进行调控， 在转录水平上诱导它的生物合成的因素包括代谢工程的方法、
光照、昼夜规则、茉莉酮化合物等。在豆科植物中提高异黄酮的产量和在非豆科植物中产生异黄酮将对农业和食
品业产生重大的影响。
关键词： 异黄酮； 生物合成途径； 关键酶； 调控
中图分类号： Ｑ９４６
文献标识码： Ａ
ＩＦＳ 是一个非常值得关注的酶， 因为它是进入
第５期
马君兰等： 异黄酮的生物合成途径及其调控
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异黄酮合成途径的第一个酶， 并且， 它催化两种 不 同 的 反 应 。 Ｋｉｍ 等 ［４］已 经 从 不 同 的 大 豆 品 种 中 克 隆 出 ＩＦＳ１ 和 ＩＦＳ２ 两 个 异 黄 酮 合 酶 的 基 因 。 用 酵 母 表 达 系 统 测 试 时 ， 发 现 ＩＦＳ１ 和 ＩＦＳ２ 利 用 相 同 的 底 物 ［５］， 但 是 ， 用 昆 虫 表 达 系 统 表 达 ＣＹＰ９ ３Ｃ１ｖ２ 蛋 白 时 ， ＩＦＳ１ 和 ＩＦＳ２ 选 择 的 是 不 同 的 底
柚皮素是黄酮类和异黄酮类化合物途径的一个 重要的， 而且是共同的底物， 对柚皮素的进一步修 饰形成了各种各样黄酮类化合物。最典型的一个反 应 是 以 柚 皮 素 为 底 物 ， 在 类 黄 酮 ３－ 羟 化 酶（ Ｆ３Ｈ， 它是一个 ２－ 酮戊二酸依赖的双加氧酶） 的催化下， 形成二氢黄酮醇， 在 ３ 碳位置的修饰对产生花色素 苷和缩合型单宁有着重要的作用， 这些反应需要二 氢黄酮醇 ４－ 还原酶（ ＤＦＲ） 、类黄酮 ３－ Ｏ－ 葡糖基转 移酶等。
异黄酮的生物合成途径是苯丙烷类代谢途径的 一个分支， 它是一类酚类次级代谢物， 可以调节复 杂的植物—微生物的相互作用， 主要是在豆科植物 中合成。大豆中， 异黄酮吸引根瘤菌并诱导 ｎｏｄ 基 因的表达， 从而诱导根瘤的形成。一些异黄酮化合 物有抗真菌的活性， 是主要的植物抗毒素的前体， 有的异黄酮本身就是植物抗毒素。异黄酮还对人的 身 体 健 康 起 到 了 重 要 的 作 用 ： 缓 解 更 年 期 症 状［１］； 降低一些与激素有关的癌症的发生［２］； 对其它的一 些生理学过程起到积极的影响， 如神经生物学活动 ［３］。因此， 研究异黄酮的生物合成途径及其调控方 式， 对生产更多的异黄酮具有重要的意义。
Ｋｉｍ 等［４］测 定 了 短 日 照 条 件（ １０ ｈ 光 照 和 １４ ｈ 黑暗， 然后再释放连续的光照） ， 对大豆叶片中的 ＣＨＩ， Ｆ３Ｈ， ＩＦＳ 的 ｍＲＮＡ 含 量 进 行 测 定 ， 发 现 ＩＦＳ， ＣＨＩ， Ｆ３Ｈ 都 表 现 出 了 受 昼 夜 规 则 控 制 的 现 象， 这三种 酶 的 ｍＲＮＡ 的 含 量 上 下 浮 动 的 现 象 是 很明显的： ＩＦＳ 的 ｍＲＮＡ 在人工的白天时达到最大 值， 然而 Ｆ３Ｈ 的 ｍＲＮＡ 含量在人工的黑夜时达到 最大值， 由于 ＣＨＩ 的 ｍＲＮＡ 含量的周期性表现 的 很短， 因此， ＣＨＩ 的 ｍＲＮＡ 的最大值不是很明显。 但是， 它的最低值不是出现在 Ｆ３Ｈ 或 ＩＦＳ 出现最大 值的时候， ＩＦＳ 和 Ｆ３Ｈ 的 ｍＲＮＡ 不是同时达到最大 值， 这样可以降低它们对底物柚皮素的竞争作用。 ２．４ 其它因素对异黄酮生物合成途径的调节
径的许多细胞色素 Ｐ４５０ 单加氧酶－ Ｃ４Ｈ（ 肉桂酸－ ４－ 羟化酶） 催化将肉桂酸加上一个羟基形成 Ｐ－ 香豆酸， 在 ４－ 香豆素辅酶 Ａ 连接酶（ ４ＣＬ） 作用下在 ３ 碳链上 连接了一个辅酶 Ａ， 进一步激活 Ｐ－ 香豆酰辅酶 Ａ， 由查尔酮合酶（ ＣＨＳ） 将 Ｐ－ 香豆酰 ＣＯＡ 与 ３ 分子的 苹果酰 ＣＯＡ 缩合， 形成 １５ 个碳的黄酮类化合物的 骨 架 。 在 许 多 物 种 中 ， 这 个 化 合 物 是 ４， ２′， ４′， ６′－ 四羟基查尔酮， 这个由查尔酮合成的化合物在 查尔酮异构酶（ ＣＨＩ） 的作用下形成柚皮素。
Ｋｒｅｕｚａｌｅｒ 等［１１］对欧芹（ Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ ｈｏｒｔｅｎｓｅ） 的 研究表明： 紫外灯的照射会诱导基因表达许多苯丙 烷类代谢途径的酶。与异黄酮合成途径有关的酶 （ 包括 ＰＡＬ， ４ＣＬ， ＣＨＳ， ＣＨＩ 等） 的含 量 和 活 性 可 以受到光照的调节， 其中 ＰＡＬ 和 ＣＨＳ 是最重要光 调 节 步 骤 。 谢 灵 玲 等［１２］发 现 在 持 续 白 光 条 件 下 大 豆 ｐａｌ 基因 ｍＲＮＡ 合成比黑暗条件下多， 不同单色光 处理的大豆 ｐａｌ 基因 ｍＲＮＡ 合成量也比黑暗条件下 高， 其中紫光处理的 ｐａｌ 的 ｍＲＮＡ 合成比红光和蓝 光处理的要高， 红光和蓝光效应相似。经过紫外光 不同时间的处理后， ｐａｌ 基因 ｍＲＮＡ 的合成随着时 间的延长有所递增， 无论是在光暗条件下或在单色 光条件下， 表达量的多少都与品种有关， 种子中异 黄酮含量低的品种比异黄酮含量高的品种差异显 著， 即低异黄酮品种对光照反应表现敏感。ｐａｌ 基
收稿日期： ２００６－ ０４－ １３ 基金项目： 黑龙江省教育厅资助课题； 黑龙江省农垦总局博士后 资助课题 作者简介： 马君兰（ １９８２－ ） ， 女， 辽宁人， 硕士研究生， 研究方 向为植物生物化学与分子生物学。Ｅ－ ｍａｉｌ： ｍａｊｕｎｌａｎ８２９６＠１６３．ｃｏｍ ＊ 通讯作者 Ｅ－ ｍａｉｌ： ｙｕｅｚｈａｏ２００５＠ｈｏｔｍａｉｌ． ｃｏｍ
马君兰１， Fra Baidu bibliotek 成１， 魏 颖１， 李 莉１， 赵 越１，２＊
（ １． 东北农业大学生命科学学院， 哈尔滨 １５００３０； ２． 黑龙江省农垦总局， 哈尔滨 １５００００ ）
摘 要： 异黄酮是一类次级代谢产物， 大多存在于豆科植物中， 是苯丙烷类代谢途径的一个分支。异黄酮生
物合成的关键酶包括苯丙氨酸解氨酶（ ＰＡＬ） 、查尔酮合酶（ ＣＨＳ） 、查尔酮异构酶（ ＣＨＩ） 、异黄酮合酶（ ＩＦＳ） ， 能够在