放射性配体与受体结合分析实验(RBA)方法
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放射性配体与受体结合分析实验(RBA)方法
竞争曲线
固定的放射性配基浓度，一定量的受体和 不同浓度的未标记化合物
数学表达
此实验用于测定非标计药物与放射性配基竞争结合同一受 体的能力。通常用IC50和Ki来表示。
闪烁液
包括溶剂、闪烁剂和添加 剂 溶剂：溶解闪烁剂和放射 性样品，吸收和传递射线 能量。 闪烁剂：第一闪烁剂（吸 收受激溶剂能量，退激发 光）、第二闪烁剂（波长 转移，匹配光电倍增管光 谱；提高淬灭耐受） 添加剂：助溶剂、抗淬灭 剂
α2
M
Rauwolscine
阿托品
3H-Rauwolscine
3H-QNB（毕兹） 3H-DHA
大鼠皮层
大鼠脑去小脑/回肠
β
心得舒
鸭红细胞/大鼠脑
RBA的安全问题
β射线
天然放射现象
放射型物质发出的射线有三种：
三种射线
α射线 β射线 γ射线
α射线
根据射线的偏转方向和磁场方向的关系可以 确定，偏转较小的一束由带正电荷的粒子组成， 我们把它叫做 α 射线， α 射线由带正电的 α 粒子组 成 . 科学家们研究发现每个 α 粒子带的正电荷是电 子电荷的2倍，α粒子质量大约等于氦原子的质量. 进一步研究表明α粒子就是氦原子核. 由于α粒子的质量较大，所以α射线的穿透本 领最小，我们用一张厚纸就能把它挡住.
药理室讲座
放射性配体与受体结合分析实 验（RBA）方法
刘星华 2011-5-13
内容
实验定义与原理 实验材料与仪器 实验方法 Scatchard方程与作图（饱和与竞争实验） RBA的安全问题 实验举例
实验定义与原理
定义 放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析 （radioassay of receptors），它是应用放射性核 素标记配基与特异受体相结合，研究受体的亲和 力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法。 原理 放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细 胞，或含有受体的制剂一起温育，使受体和配基 充分结合，形成受体-配基复合物，终止反应后， 用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测 定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基 结合的受体的量。
RBA
NSB与样品的特异结合混在一起，会对样品 的测量产生影响。
特点：1）亲和力小，但容量大； 2）与生物效应无关；
除去NSB的方法： 1、设置无受体或失活受体的待测样品，通过 整个反应过程后测得的放射性测量值来作为 NSB TB管（总结合管）： *L+R+A←→*LR+*LA+*L(吸附） NSB：*L+A←→*LA+*L(吸附) SB＝TB-NSB 2、在反应系统中加入比标记配基量更多、与 受体亲和力更大的非标记配体，反应后测得的 放射性作为NSB。
注意：
①整个过程在低温下进行（0～4℃）需要 冷冻离心机。
②离心机的转速要相对稳定。 ③介质的密度，离子强度及酸碱度要严格
一致。 ④每次进行后要蛋白定量。
2、组织切片
为了保持受体的结合活性，通常都需用 冰冻切片，厚度5～50μm。
将切片粘贴于涂有明胶的玻片上，在标 本上滴加含有放射配基的缓冲液，进行 受体结合反应，然后洗净游离部分。
如果在绘制饱和曲线时，换一种方法 作图，即Scatchard作图法，以复合物 浓度[RL]为横坐标，以复合物和游离配 基的浓度比值[RL]/[L] (也即放射性比值 B/F) 为纵坐标，则对简单单位点系统来 说，将得到一条逐渐下降的直线。
配基的非特异结合（NSB）
放射性标记配基除了与受体发生特异结合外， 还可以与样品中的其他成分如蛋白质、反应容 器、分离剂等结合，这种结合即没有结构特异 性，又和生理效应无关，称非特异性结合 （non-specific binding,NSB)。
RBA的基本原理
RBA是指用放射性核素来标记配基，与相应 的受体进行特异性结合反应，对受体的性质进 行定性和定量的分析。 1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变 化来判断受体的类型，单位点或多位点结合式， 及受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协 作性等。 2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性 质的基础上，通过结合反应，给出一定量的组 织或细胞中能与该放射性配体结合的受体数及 结合的平衡解离常数或结合位点数（最大结合 容量）。
特点：1）亲和力小，但容量大； 2）与生物效应无关；
除去NSB的方法： 1、设置无受体或失活受体的待测样品，通过 整个反应过程后测得的放射性测量值来作为 NSB TB管（总结合管）： *L+R+A←→*LR+*LA+*L(吸附） NSB：*L+A←→*LA+*L(吸附) SB＝TB-NSB 2、在反应系统中加入比标记配基量更多、与 受体亲和力更大的非标记配体，反应后测得的 放射性作为NSB。
注意：
①整个过程在低温下进行（0～4℃）需要 冷冻离心机。
②离心机的转速要相对稳定。 ③介质的密度，离子强度及酸碱度要严格
一致。 ④每次进行后要蛋白定量。
2、组织切片
为了保持受体的结合活性，通常都需用 冰冻切片，厚度5～50μm。
将切片粘贴于涂有明胶的玻片上，在标 本上滴加含有放射配基的缓冲液，进行 受体结合反应，然后洗净游离部分。
如果在绘制饱和曲线时，换一种方法 作图，即Scatchard作图法，以复合物 浓度[RL]为横坐标，以复合物和游离配 基的浓度比值[RL]/[L] (也即放射性比值 B/F) 为纵坐标，则对简单单位点系统来 说，将得到一条逐渐下降的直线。
配基的非特异结合（NSB）
放射性标记配基除了与受体发生特异结合外， 还可以与样品中的其他成分如蛋白质、反应容 器、分离剂等结合，这种结合即没有结构特异 性，又和生理效应无关，称非特异性结合 （non-specific binding,NSB)。
RBA的基本原理
RBA是指用放射性核素来标记配基，与相应 的受体进行特异性结合反应，对受体的性质进 行定性和定量的分析。 1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变 化来判断受体的类型，单位点或多位点结合式， 及受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协 作性等。 2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性 质的基础上，通过结合反应，给出一定量的组 织或细胞中能与该放射性配体结合的受体数及 结合的平衡解离常数或结合位点数（最大结合 容量）。
受体配体简
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1. 单点法实验的数据处理
通常是计算饱和区的受体密度， 通常是计算饱和区的受体密度，即受体最大结合容量 （maximum binding capacity，Rmax）。 ， ）。 受体密度的表示方式有以下几种： 受体密度的表示方式有以下几种： 胞浆胞膜等的受体含量： 蛋白； ① 胞浆胞膜等的受体含量：fmol/mg蛋白； 蛋白 胞核的受体含量： ② 胞核的受体含量：fmol/mgDNA； ； 完整细胞受体的含量：结合位点/cell（site/cell）或 ③ 完整细胞受体的含量：结合位点 （ ） fmol/106细胞。 细胞。
由式（ ）整理可得： 由式（1.1）整理可得 KD ＝ [RT-RL][L] [RL] 将上式整理可得： 将上式整理可得 [RL] = [RT] － 1_ × [RL] [L] KD KD
16
以复合物浓度[RL]为横坐标，以复合物浓度和游 为横坐标， 以复合物浓度 为横坐标 离配体的浓度比值[RL]/[L]为纵坐标作图，即为 为纵坐标作图， 离配体的浓度比值 为纵坐标作图 Scatchard作图。 作图。 作图 简单单位点系统Scatchard作图为一条直线，斜 作图为一条直线， 简单单位点系统 作图为一条直线 ），横轴截距为 率为 -（1/KD），横轴截距为 （ ），横轴截距为[RT]，纵轴截距为 ，纵轴截距为[RT]/ KD（见图 ）。 （见图3）。
5
RBA的应用 的应用
神经递质 激素和药物等的作用机制 疾病的病因和发病机制 新药设计和药物筛选 受体显像与受体介导治疗
6
二、概 述
1. 受体的分类 类(class) 膜受体 核受体 亚类（subclass） 型 (type) 亚型 (subtype)
7
2. 受体与配体结合的基本特点
药理试验讲义四
℃保存备用，使用时解冻后稀释，使其蛋白浓度
为1.67mg/ml。
Байду номын сангаас 2.加样
每个测定点双复管依下表顺序加样，P2膜最后加 ———————————————————— Tris-HCl 依托啡 3H-依托啡 P2膜 总结合 0.2ml / 0.1ml 0.6ml 非特异结合 / 0.2ml 0.1ml 0.6ml ———————————————————— 加样后的样品试管30 ℃保温30min，之后冰浴 终止反应，细胞收集器过滤，3ml冷Tris-HCl洗涤两 次后取下滤膜放入闪烁杯，加5ml闪烁液、3ml无水 乙醇进行液闪测定。
实验原理4
由此我们可以得到总结合量和非 特异性结合量的计数，然后用总 结合管计数减掉非特异结合管的 计数即可得到特异性结合量，根 据clark受体理论，作Scatchard图， 即可求出最大结合量Bmax及解离 常数 KD。
材料方法
*材料：
1、3H-依托啡，25μM水溶液，按1：0.7 的比例依次稀释，配制成6个浓度. 2、制备提取吗啡受体粗膜（P2膜） 3、甲苯闪烁液3000～5000ml 4、50mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5
实验原理2
放射配基与受体制备物作用时，有 配基与受体的特异性结合和配基与 非受体分子的非特异性结合。特异 性结合亲和力高且有饱和性，非特 异性结合不易饱和。为得出特异性 结合量，必须设法在总结合量中减 去非特异结合量。
实验原理3
总结合管中包含有特异结合与非 特异结合量，同时制备的非特异 结合管中需加入大量（远远大于 标记的放射性配基）非标记特异 性配基以使受体几乎全部被非标 记配基饱和，标记配基只能与非 特异性位点结合，从而得到总结 合量和非标记结合量。
受体的放射配体结合分析法【58页】
3、 雌激素受体类 主要为雌激素（ER）。
（三） 受体亚型
受体亚型是指受体分子结构上既有部分相同，也存在 一定差别，它们对同一配体具有不同的亲和力，生物 学上具有不同的效应。
1、用药理学方法可见到，同一种受体的几种激动剂 （拮抗剂）对各亚型都有作用，但作用有相对的选择 性。如，对于α肾上腺受体，哌唑嗪对血管平滑肌收缩 的用较拮弱抗（作α用2）强，（而α1育）亨，宾对则胃相肠反道。平滑肌舒张的拮抗作 2、用放射配体结合分析法可观察到，同一种受体的某 些激动剂（拮抗剂）对各亚型都有特异性结合能力， 但是亲和力不同。
细胞核、浆 、膜 3.受体的增溶和进一步纯化
沉淀：完整细胞、核受体
图8.10 分离细胞组分的一般方法
四、温育 条件
缓冲液
通过多次预实验确定 某个受体的最适离子 强度和pH
时间与温度
最适的时间为完全平 衡时间
温度根据目的不同而 不同（0—37OC）
结合配体和游离配体的分离
目 的 ： B/F的 分 离 ， 一般RIA的分离方法可用于RBA 注意配体与受体的解离速度
5、 识别能力（Recognition）和生物效应一致性
受体与配体的特异性结合保证了受体对机体内成千上万 生物活性物质的高度识别能力。这种能力与配体引起的 生理（药理）效应相一致。表现在：（1）、在组织分 布上的一致。（2）、在浓度上的一致。受体主要存在 于相应配体发挥生理或药理效应的器管，称之为靶器管。 有的配体生理或药理效应广泛，而另一些配体的作用则 有明显的器管专一性。配体和受体结合的有效浓度通常 也应该和该配体发挥生理或药理作用的浓度一致。
图8.8 Scatchard作图中的正负协同作用 （1） 无协同作用；（2）负协同作用；（3）正协同作用
（三） 受体亚型
受体亚型是指受体分子结构上既有部分相同，也存在 一定差别，它们对同一配体具有不同的亲和力，生物 学上具有不同的效应。
1、用药理学方法可见到，同一种受体的几种激动剂 （拮抗剂）对各亚型都有作用，但作用有相对的选择 性。如，对于α肾上腺受体，哌唑嗪对血管平滑肌收缩 的用较拮弱抗（作α用2）强，（而α1育）亨，宾对则胃相肠反道。平滑肌舒张的拮抗作 2、用放射配体结合分析法可观察到，同一种受体的某 些激动剂（拮抗剂）对各亚型都有特异性结合能力， 但是亲和力不同。
细胞核、浆 、膜 3.受体的增溶和进一步纯化
沉淀：完整细胞、核受体
图8.10 分离细胞组分的一般方法
四、温育 条件
缓冲液
通过多次预实验确定 某个受体的最适离子 强度和pH
时间与温度
最适的时间为完全平 衡时间
温度根据目的不同而 不同（0—37OC）
结合配体和游离配体的分离
目 的 ： B/F的 分 离 ， 一般RIA的分离方法可用于RBA 注意配体与受体的解离速度
5、 识别能力（Recognition）和生物效应一致性
受体与配体的特异性结合保证了受体对机体内成千上万 生物活性物质的高度识别能力。这种能力与配体引起的 生理（药理）效应相一致。表现在：（1）、在组织分 布上的一致。（2）、在浓度上的一致。受体主要存在 于相应配体发挥生理或药理效应的器管，称之为靶器管。 有的配体生理或药理效应广泛，而另一些配体的作用则 有明显的器管专一性。配体和受体结合的有效浓度通常 也应该和该配体发挥生理或药理作用的浓度一致。
图8.8 Scatchard作图中的正负协同作用 （1） 无协同作用；（2）负协同作用；（3）正协同作用
放射性配体与受体结合分析实验方法
放射性配体与受体结合分析实验方法放射性配体与受体结合分析方法（Radioligand Binding Assay，RBA）是一种常用的生物化学实验方法，用于研究受体与其配体之间的结合亲和性和数量。
该方法通过标记配体的放射性同位素来实现，可以精确测定受体与配体之间的亲和力。
RBA方法的原理是将受体样品与放射性标记的配体一起孵育，使二者发生结合。
非结合的配体随后通过洗涤的步骤去除，然后测定剩余的结合复合物中的放射性信号。
根据放射性信号的强度，可以计算出受体与配体结合的比例和结合亲和力。
RBA方法需要一些实验材料和设备，包括放射性标记的配体、受体样品、未标记的配体（用于测定非特异性结合）、放射性检测设备（例如放射计或闪烁计数器）以及用于孵育和洗涤的缓冲液。
实验步骤一般包括以下几个关键步骤：1.准备标记配体：将配体与放射性同位素结合，这通常涉及到将配体与放射性同位素联结的化学反应。
常用的放射性同位素包括^3H（氚）和^125I（碘）等。
此步骤需要进行放射性安全操作。
2.孵育样品：将受体样品与标记配体一起在适当的缓冲液中孵育。
孵育条件（温度、时间等）需根据具体受体和配体的特性进行优化。
3.洗涤步骤：通过洗涤去除未结合的配体。
洗涤步骤可以进行多次，以确保只保留结合复合物。
这一步骤是为了去除非特异性结合而采取的，可以使用高浓度的未标记配体等进行竞争性结合。
4.结合复合物的测定：将洗涤后的样品放入放射性检测设备中，测定放射性信号的强度。
放射性信号的强度与结合复合物的量成正比，可以通过标准曲线或计算公式来计算受体与配体的结合亲和力。
RBA方法具有一些优点和应用前景。
首先，该方法可以在体外定量测定受体与配体之间的结合亲和力。
这对于研究生物体内的受体配体相互作用具有重要意义。
其次，该方法具有高灵敏度，能够测定非常低浓度的受体或配体。
此外，RBA方法还可以用于筛选新药物的受体结合亲和性，以及衡量药物对受体的亲和力的影响。
受体分析检查-检验核医学
36
❖ (4)另取一定量的样品测蛋白含量或细胞 数，即可算成一定量蛋白或一定细胞数 中RT的mol数,即为[RT]。
❖ (5) 还 可 进 一 步 将 mol 换 算 成 分 子 数 〔1 mol=6.02×1023 个 分 子 〕 ， 从 而 得 到 单 位细胞或单位蛋白的受体结合位点数。
37
RT 测量效 % ） 率 配R（ 基 的 Lc比 p标 m活 本 度 蛋m白 )ol
❖ 1、G蛋白偶联受体〔神经递质、前列腺素等〕 ❖ 2、单一跨膜区有激酶活性受体〔细胞因子〕 ❖ 3、单一跨膜区无激酶活性受体〔生长因子、
INS〕 ❖ 4、离子通道型受体〔Na+、K+、Cl-、Ca++等〕
7
8
❖ 2、核受体
❖ 受体在细胞核上，通过与细胞核内特定的DNA 结合后影响遗传信息的转录。核受体一般是 由400～1,000个氨基酸残基组成的可溶性单 体蛋白质。氨基端是高度可变区，与转录的 特异性有关。中间是DNA结合区，富含半胱氨 酸，含有两个“锌指〞结构，受体通过“锌 指〞与DNA结合；该区域部位保守性强。羧基 端为激素结合区。
❖ 数据处理是将数学模型直线化，再将测得数 据进行直线拟合，求出所需参数。计算机普 及后，人们用计算机进行曲线拟合，以减少 直线化带来的误差。
41
❖Scatchard作图 ❖简单单位点系统在Scatchard作图中
应呈一条直线。
RL RT 1 RL
L KD KD
❖以 [RL]/[L] 对 [RL] 作 图 ， 即 为 Scatchard作图。在简单单位点系统， 应得一直线。斜率是 -1/KD，而直 线与横轴的交点那么等于[RT]值。 42
RL RT 1 RL
❖ (4)另取一定量的样品测蛋白含量或细胞 数，即可算成一定量蛋白或一定细胞数 中RT的mol数,即为[RT]。
❖ (5) 还 可 进 一 步 将 mol 换 算 成 分 子 数 〔1 mol=6.02×1023 个 分 子 〕 ， 从 而 得 到 单 位细胞或单位蛋白的受体结合位点数。
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RT 测量效 % ） 率 配R（ 基 的 Lc比 p标 m活 本 度 蛋m白 )ol
❖ 1、G蛋白偶联受体〔神经递质、前列腺素等〕 ❖ 2、单一跨膜区有激酶活性受体〔细胞因子〕 ❖ 3、单一跨膜区无激酶活性受体〔生长因子、
INS〕 ❖ 4、离子通道型受体〔Na+、K+、Cl-、Ca++等〕
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❖ 2、核受体
❖ 受体在细胞核上，通过与细胞核内特定的DNA 结合后影响遗传信息的转录。核受体一般是 由400～1,000个氨基酸残基组成的可溶性单 体蛋白质。氨基端是高度可变区，与转录的 特异性有关。中间是DNA结合区，富含半胱氨 酸，含有两个“锌指〞结构，受体通过“锌 指〞与DNA结合；该区域部位保守性强。羧基 端为激素结合区。
❖ 数据处理是将数学模型直线化，再将测得数 据进行直线拟合，求出所需参数。计算机普 及后，人们用计算机进行曲线拟合，以减少 直线化带来的误差。
41
❖Scatchard作图 ❖简单单位点系统在Scatchard作图中
应呈一条直线。
RL RT 1 RL
L KD KD
❖以 [RL]/[L] 对 [RL] 作 图 ， 即 为 Scatchard作图。在简单单位点系统， 应得一直线。斜率是 -1/KD，而直 线与横轴的交点那么等于[RT]值。 42
RL RT 1 RL
7.受体放射分析
三、受体与配基结合的特性
1、可饱和性（satiability） 每个细胞所
含受体数是有限的，因此配基与受体结合的反应 曲线应该具有可饱和性，受体结合反应呈高亲和 性和低容量，而非特异结合则呈低亲和性和高容 量，后者的剂量反应曲线不呈可饱和性。 2、可逆性（reversibility） 激素、递质 和药物与特异性受体结合反应是可逆的，当受体 周围的配基浓度降低，结合反应就逆向进行，即 配基受体复合物很快解离，解离后的配基是原形 ，不起代谢变化，这跟酶与底物作用结果不同， 底物经酶作用后变成代谢产物。
四、受体的生理调节
细胞膜上受体的数量和亲和性随细胞所处的 环境而发生变化。受体的这种生理调节现象与人 体的疾病、药物作用有着密切的关系。受体的生 理调节作用可分为向上调节和向下调节。
1、向下调节（down-regulation）
细胞所处环境中某种激动剂的浓度增高或长 期作用，其结果使相应受体的数量减少，并出现 受体对此物质的敏感性下降，或耐受性增高等现 象，如哮喘病人长期服用β-激动剂产生的耐受性 增高，即药效减弱。
至今，研究受体亲和力和受体数量最基本， 最主要的方法仍然是受体的放射性配基结合分 析（radioligand binding assay of receptors，RBA），简称受体放射分析。它是 应用放射性核素标记配基与特异性的受体结合， 研究受体的亲和力和受体的数量，也是研究受 体亚型的常用方法。 迄今为止，所有已发现的受体 （receptor）都是具有特定氨基酸序列和特定 构型的蛋白质。每一种受体在细胞上都有特定 的宏观分布（器官和组织特异性）和微观分布 （细胞或细胞核）。
2、向上调节（up-regulation）
细胞所处环境中某种拮抗剂的浓度过高或 长期作用，结果会使受体数量增高，出现受体敏 感性增高，表现为增敏，或撤药后反跳现象。如 高血压病人长期服用心得安时对儿茶酚胺增敏， 若突然停药，可出现血压升高的反跳现象。由于 受体在整体条件下，随机体状态变化，会出现生 理调节，因此对受体数量和亲和性测定就成为研 究病理变化和评价药效的重要内容。
放射配基受体结合法-1 (1)
2.Scatchard作图： RL RT RL （3） （2）式变换 L K D K D RL 用 L 对（RL）作图，可得直线，其斜率为－
为（RT）。
1 KD
，横轴截距
饱和实验的Scatchard作图
3.Hill作图：
当配体受体结合反应不是简单的双分子反应时， R+nL=RLn RL L n 根据质量作用定律 RT K D L n RL 经变换有 log( RT RL )=nlog(L)-log(kD)
KD＝
( R)( L) RT RL LT RL RL ( RL)
（1）
平衡时（LT）>>(RL) (LT)≈(L) 故
RT RLL KD= RL
（2）
(LT)总配体浓度；（L）游离配体浓度；（RL）结合配体浓度； (RT)总受体浓度，即最大结合；KD平衡解离常数；KA亲和常 数 KA= 1/KD
2.放射配基的亲和力
放射配基与受体亲和力越高越好，因为测定中 可以使用较低浓度的放射配基，且非特异结合的水 平也较低。另外，亲和力越高，解离速率越慢，操 作较方便。
3.放射配基的稀释
有时，为了将一个测定管的特异活性的最大 值限制在106 计数/min（cpm），可以用非标记 配基稀释 125I放射配基，从而降低其特异活性。 另外，非标记配基应该使用非活性的含碘配基， 而不是非碘的配基，因为后者与放射配基在化 学上是不同的，可能有不同的药理学特征。
过滤法的优点是快速和方便。缺点是只有在放射配 基-受体复合物的亲和力高于10nM时才能应用。它的 主要非特异结合是与滤膜而不是与组织制备的结合。 对于放射配基与受体的亲和力在10nM-1μM范围（这 时解离可能太快）的测定，以及与滤膜的非特异结合 高得不能应用时，经常使用离心技术来代替过滤。
放射性配体与受体结合分析实验(RBA)方法
药理室讲座
放射性配体与受体结合分析实 验（RBA）方法
刘星华 2011-5-13
整理ppt
内容
实验定义与原理 实验材料与仪器 实验方法 Scatchard方程与作图（饱和与竞争实验） RBA的安全问题 实验举例
整理ppt
实验定义与原理
定义 放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析
整理ppt
实验仪器
组织匀浆机 IKA，T10B S25
漩涡混合器 WH-2
整理ppt
低温高速离心机 凯达，TGL20M
超低温冰箱 海尔
整理ppt
数显恒温水浴锅 金燕，HH-S26S
制冰机 GELIN 型号IMS-50 automatic
ice flakes
整理ppt
电热恒温水温箱
整理ppt
实验材料与仪器
整理ppt
实验材料
动物组织（皮层、海马、纹状体等） 仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高
速离心机、电热恒温水温箱、-80℃冰箱、 制冰机、抽虑瓶、液闪仪等） 材料（ 2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪 头、微纤维滤纸等） 药品（放射性配基、各种非标计化合物等）
整理ppt
RBA的分类
RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体 进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性 和定量的分析。 1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变化 来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及 受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性 等。 2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性质 的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或 细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的 平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。
（1）总结合管：100ul膜受体 + 200ul缓冲液 + 10 ul 放射性配体 （2）非特异管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul非标记配体 + 10 ul 放射性配体 （3）受试物管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul药物溶液 + 10 ul 放射性配体
放射性配体与受体结合分析实 验（RBA）方法
刘星华 2011-5-13
整理ppt
内容
实验定义与原理 实验材料与仪器 实验方法 Scatchard方程与作图（饱和与竞争实验） RBA的安全问题 实验举例
整理ppt
实验定义与原理
定义 放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析
整理ppt
实验仪器
组织匀浆机 IKA，T10B S25
漩涡混合器 WH-2
整理ppt
低温高速离心机 凯达，TGL20M
超低温冰箱 海尔
整理ppt
数显恒温水浴锅 金燕，HH-S26S
制冰机 GELIN 型号IMS-50 automatic
ice flakes
整理ppt
电热恒温水温箱
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实验材料与仪器
整理ppt
实验材料
动物组织（皮层、海马、纹状体等） 仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高
速离心机、电热恒温水温箱、-80℃冰箱、 制冰机、抽虑瓶、液闪仪等） 材料（ 2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪 头、微纤维滤纸等） 药品（放射性配基、各种非标计化合物等）
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RBA的分类
RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体 进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性 和定量的分析。 1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变化 来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及 受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性 等。 2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性质 的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或 细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的 平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。
（1）总结合管：100ul膜受体 + 200ul缓冲液 + 10 ul 放射性配体 （2）非特异管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul非标记配体 + 10 ul 放射性配体 （3）受试物管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul药物溶液 + 10 ul 放射性配体
放射配体与受体结合分析：筛选新的先导化合物有效方法之一
放射配体与受体结合分析：筛选新的先导化合物有效方法之一朱辉
【期刊名称】《国外医药：抗生素分册》
【年(卷),期】1998(019)004
【摘要】体外配体受体结合分析作为筛选先导化合物的筛选工具有较明显的优势,通过结合分析产生的构效关系数据是配体和受体作用的直接反映.在技术上,由于此方法是靶位筛选,因此仅需极少量的样品(常不超过lmg),方法灵敏、可靠,同时成本也降低.本文着重介绍通过结合分析过筛样品寻找特异先导化合物的原理、方法和特点.
【总页数】3页(P257-259)
【作者】朱辉
【作者单位】国家医药管理局
【正文语种】中文
【中图分类】R965.1
【相关文献】
1.小鼠腹腔巨噬细胞PAF受体放射配基受体结合分析方法 [J], 彭珊瑛;欧阳雪宇;王文杰
2.合成杀藻剂先导化合物的筛选和杀藻效果分析 [J], 陈晓雯;赵良元;杨劭
3.白三烯C_4(LTC_4)放射受体结合方法的建立及二苯乙烯低聚体和LTC_4受体结合特性 [J], 侯艳宁;朱秀媛;程桂芳
4.放射性配体受体结合实验方法介绍 [J], 班婷婷;吴强恩;周志俊
5.敲减人MCHR2基因抑制CHO细胞的放射性配体受体结合能力及Ca^2＋释放[J], 袁成福;杨俊霞;刘革力;卜友泉;张琴;易发平;马永平;宋方洲
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03受体的放射配体(基)结合分析(RBA)
John Navport Langley(1852—1925) and paul Ehrlich(1854—1915) 为这一 领域的开拓者。 但这一段时间受体的研究进展甚 微，其原因是一个较长的时间内，仅 仅把受体看成是一种虚设的概念，只 是为了适应解释某些现象的需要，并 不认为需用科学的方法去证实它。
第四节受体分析原理 1、简单单位点系统的定义：
a. 受体与配基的结合只存在一个位点， 亦即各个受体分子表现出完全相同的结合 特性和生物效应。 b.R和L的结合是1：1关系结合 c.各受体分子间不表现出明显的正负合 作。
技术概念：
正、负合作的定义：在某些RL反应中，当一 部分受体与相应的配基结合后可使相邻的受 体的亲和力增高或降低，分别称正合作或负 合作现象，其本质可能系引起邻近受体分子 构型的改变。 上调或下调：如果某些因素如疾病使受体数 量或密度改变称为上调或下调 增敏和失敏：如果不仅使受体数量改变而且 亲和力也改变了称为增敏和失敏
第三节受体、配基的作用原理
1、受体的分类（国际药学联盟）： 膜受体 其配基为水溶性，包括蛋白类，多肽及胺类激素 以一些药物，化学物等。目前又分为四大类： 1） 单跨膜区段（有酶）；2）单跨膜区段（无酶）； 3）G蛋白偶联七跨膜区段；4）配基门控离子通道 核受体 其配基均为脂溶性，如性激素、肾上腺皮质激 素及1，25—（OH）2D3，也成为胞内受体。
2）传导信号； 3）产生生物效应。
同时受体还具有如下基本特征： 1）可饱合性 2）可逆性 3）特异性 4）生理效应一致性 现代受体新概念，还需有如下补充：
1）具有蛋白的性质：强酸、强硷 2）须找到内源性配体的存在 3）具有组织专一性或特定的组织分布 4）量少但亲和力高：一般10-9M
第二节 受体研究发展史
第四节受体分析原理 1、简单单位点系统的定义：
a. 受体与配基的结合只存在一个位点， 亦即各个受体分子表现出完全相同的结合 特性和生物效应。 b.R和L的结合是1：1关系结合 c.各受体分子间不表现出明显的正负合 作。
技术概念：
正、负合作的定义：在某些RL反应中，当一 部分受体与相应的配基结合后可使相邻的受 体的亲和力增高或降低，分别称正合作或负 合作现象，其本质可能系引起邻近受体分子 构型的改变。 上调或下调：如果某些因素如疾病使受体数 量或密度改变称为上调或下调 增敏和失敏：如果不仅使受体数量改变而且 亲和力也改变了称为增敏和失敏
第三节受体、配基的作用原理
1、受体的分类（国际药学联盟）： 膜受体 其配基为水溶性，包括蛋白类，多肽及胺类激素 以一些药物，化学物等。目前又分为四大类： 1） 单跨膜区段（有酶）；2）单跨膜区段（无酶）； 3）G蛋白偶联七跨膜区段；4）配基门控离子通道 核受体 其配基均为脂溶性，如性激素、肾上腺皮质激 素及1，25—（OH）2D3，也成为胞内受体。
2）传导信号； 3）产生生物效应。
同时受体还具有如下基本特征： 1）可饱合性 2）可逆性 3）特异性 4）生理效应一致性 现代受体新概念，还需有如下补充：
1）具有蛋白的性质：强酸、强硷 2）须找到内源性配体的存在 3）具有组织专一性或特定的组织分布 4）量少但亲和力高：一般10-9M
第二节 受体研究发展史
受体的放射配体结合分析法
简单单位点系统在Scatchard作图中应呈一条直线。将：
移项并稍加整理可得：
（8.5）
以[RL]/[L]对[RL]作图，即为Scatchard作图。在简单单位点系统，应得一直线。斜率是 -1/KD，而直线与横轴的交点则等于[RT]值（图8-4）。当KD相同而[RT]不同时，应得到相互平行但与横轴交于不同位置的直线（图8-5a）。当[RT]相同而KD不同时，各直线斜率不同但与横轴交于同一点（图8-5b）。
本类受体在细胞核上，与细胞核内特定的DNA结合，通过这种结合影响遗传信息的转录。核受体一般是由400～1,000个氨基酸残基组成的可溶性单体蛋白质，不含糖基，无酶活性。氨基端是一个高度可变区，大约由25～603个氨基酸残基组成，与转录的特异性有关，具有转录激活作用。中间是DNA结合区，约由66～68个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸，含有两个“锌指”结构，受体通过“锌指”与DNA结合；该区域部位保守性强，同种激素的受体在不同种属间有完全相同的DNA结合部位。羧基端为激素结合区，大约由220～250个氨基酸残基组成，相同激素的受体在此区种属差异较小，而不同激素的受体即使是同一种属，差异性也较明显，因而决定了受体的特异性。与受体结合的染色体的DNA序列称为激素反应元件（hormoneresponse element,HRE）, HRE一般位于受调控基因启动子上游，一个基因的上游通常有多个HRE。根据受体与HRE结合的特征，将核受体分为两类：
饱和曲线趋向水平则说明大部分受体已与配体结合。
饱和曲线的形状和KD有关。KD越小，即亲和力越高，曲线起始上升的越快，后续部分越早趋向水平（图8-2）。
如KD相同而[RT]不同，则各曲线的形状相似但高度不同（图8-3）。
图8-2KD对饱和曲线的影响图8-3[RT]对饱和曲线影响
移项并稍加整理可得：
（8.5）
以[RL]/[L]对[RL]作图，即为Scatchard作图。在简单单位点系统，应得一直线。斜率是 -1/KD，而直线与横轴的交点则等于[RT]值（图8-4）。当KD相同而[RT]不同时，应得到相互平行但与横轴交于不同位置的直线（图8-5a）。当[RT]相同而KD不同时，各直线斜率不同但与横轴交于同一点（图8-5b）。
本类受体在细胞核上，与细胞核内特定的DNA结合，通过这种结合影响遗传信息的转录。核受体一般是由400～1,000个氨基酸残基组成的可溶性单体蛋白质，不含糖基，无酶活性。氨基端是一个高度可变区，大约由25～603个氨基酸残基组成，与转录的特异性有关，具有转录激活作用。中间是DNA结合区，约由66～68个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸，含有两个“锌指”结构，受体通过“锌指”与DNA结合；该区域部位保守性强，同种激素的受体在不同种属间有完全相同的DNA结合部位。羧基端为激素结合区，大约由220～250个氨基酸残基组成，相同激素的受体在此区种属差异较小，而不同激素的受体即使是同一种属，差异性也较明显，因而决定了受体的特异性。与受体结合的染色体的DNA序列称为激素反应元件（hormoneresponse element,HRE）, HRE一般位于受调控基因启动子上游，一个基因的上游通常有多个HRE。根据受体与HRE结合的特征，将核受体分为两类：
饱和曲线趋向水平则说明大部分受体已与配体结合。
饱和曲线的形状和KD有关。KD越小，即亲和力越高，曲线起始上升的越快，后续部分越早趋向水平（图8-2）。
如KD相同而[RT]不同，则各曲线的形状相似但高度不同（图8-3）。
图8-2KD对饱和曲线的影响图8-3[RT]对饱和曲线影响
核医学受体的放射性配基结合分析讲课文档
，但对心肌则是抑制的。 配体可以是神经递质、激素、某些药物等。
第十三页，共63页。
四、受体与配基结合的特性
1、可饱和性(saturability) ： 每种受体在一个细胞上的量有一定限度，所以如 果不断增加细胞周围配基的浓度，结合到细胞上 的配基将渐趋饱和。
第十四页，共63页。
2、可逆性：
如果在放射配基与受体结合后将受体周围多余的放
③ D区:主要作用是受体在核内的定位。 ④ E区:与配基结合的区，并有转录激活作用。
第九页，共63页。
受体的亚型
➢ 受体亚型：在分子结构上既有相似之处，又存在一 定的差别，对一定的配基具有不同的亲和力，在生 物学上具有不同的效应。
➢ 在药理实验等研究中发现，许多受体存在着两种 或两种以上的亚型。只有内源性配基相同而氨基 酸序列同源性很高的受体才可列为同一型的不同 亚型。
由于受体在整体条件下，随机体状态变化，会出现生 理调节，因此对受体数量和亲和性测定就成为研究病理 变化和评价药效的重要内容。
第十九页，共63页。
六、受体与疾病
遗传缺陷与免疫异常为受体性疾病的常见原因
1、基因突变致使受体异常，引发功能障碍，绝大多数是功能降低或完
全丧失，有家族史，病情严重。如睾酮受体基因突变致该受体缺陷引起 睾丸完全雌性化病。
射性(total binding, TB)，必需先减去非特异结合(NSB)，才能得 到特异结合(specific binding, SB)的放射性。
第三十一页，共63页。
NSB主要来自杂蛋白，反应器壁，分离材料的吸附，它的 特点是，容量很大，而亲和力低，因此在一般情况下不被饱 和，也就是随着配基浓度的升高，它不呈饱和曲线，而是一 条上升的直线。
2、机体对受体产生自身抗体，激动（如Graves综合症患者产生TSH受 体抗体，直接持续激动甲状腺TSH受体）或阻断（如重症肌无力患者产生N-
第十三页，共63页。
四、受体与配基结合的特性
1、可饱和性(saturability) ： 每种受体在一个细胞上的量有一定限度，所以如 果不断增加细胞周围配基的浓度，结合到细胞上 的配基将渐趋饱和。
第十四页，共63页。
2、可逆性：
如果在放射配基与受体结合后将受体周围多余的放
③ D区:主要作用是受体在核内的定位。 ④ E区:与配基结合的区，并有转录激活作用。
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受体的亚型
➢ 受体亚型：在分子结构上既有相似之处，又存在一 定的差别，对一定的配基具有不同的亲和力，在生 物学上具有不同的效应。
➢ 在药理实验等研究中发现，许多受体存在着两种 或两种以上的亚型。只有内源性配基相同而氨基 酸序列同源性很高的受体才可列为同一型的不同 亚型。
由于受体在整体条件下，随机体状态变化，会出现生 理调节，因此对受体数量和亲和性测定就成为研究病理 变化和评价药效的重要内容。
第十九页，共63页。
六、受体与疾病
遗传缺陷与免疫异常为受体性疾病的常见原因
1、基因突变致使受体异常，引发功能障碍，绝大多数是功能降低或完
全丧失，有家族史，病情严重。如睾酮受体基因突变致该受体缺陷引起 睾丸完全雌性化病。
射性(total binding, TB)，必需先减去非特异结合(NSB)，才能得 到特异结合(specific binding, SB)的放射性。
第三十一页，共63页。
NSB主要来自杂蛋白，反应器壁，分离材料的吸附，它的 特点是，容量很大，而亲和力低，因此在一般情况下不被饱 和，也就是随着配基浓度的升高，它不呈饱和曲线，而是一 条上升的直线。
2、机体对受体产生自身抗体，激动（如Graves综合症患者产生TSH受 体抗体，直接持续激动甲状腺TSH受体）或阻断（如重症肌无力患者产生N-
体外放射配基结合分析及临床应用
受体的免疫组织化学
Immunohistochemistry
优点：
强特异性（单个氨基酸水平） 高敏感性 高分辨力
缺点：
半定量 无法测定亲和力
RBA相关的基本慨念
受体(receptor,R) 配基(ligand,L)：
激动剂、激动剂、内源性配基
受体与配基结合反应的质量作用定律
K1V1
9/14
1/12
------------------------------------------------------------
总有效率
128/235(54.5%) 7/176(4%)
____________________________________________________________
(100nM)
↑
2nM
尾状核
29
丁克吗
↑
被壳
(100nM)
↑
[3H]-阿朴 3.2nM
尾状核
7
丁克吗
→
被壳
(1uM)
→
侧坐核
3
→
颞皮质
→
ADTN＝2-氨-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢萘
PET脑受体研究
多巴胺受体
11C-N-甲基螺环哌丁苯、11C-Nomifensine、11CSCH23390
帕金森氏病
帕金森氏病患者脑中受体的变化
受体的种类
纹状体
黑质
多巴胺D1受体 多巴胺D2受体 未治疗例
左旋多巴治疗
↑／＝ ↑ ↓／＝
mACh受体
↑／↓
5-HT受体
＝
GABA受体
＝
↓
脑啡肽受体
↓（只有被壳↑）
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试管、EP管等 试剂：无水乙醇、超纯水、Tris 、抗血酸、优降
宁、HCl 、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2 、 DMSO 、甲苯、PPO 、POPOP、Methysergide 、 Butaclamol及5HT 等
精品课件
18
2、制备膜受体
大鼠断头取脑 分离出目标组织 加10倍体积（V / W）冰冷的缓冲液 用组织匀浆机匀浆3次，每次数秒钟，制成组织匀浆液 组织匀浆液用低温高超离心机离心（12000转/分）3次，
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4
实验材料与仪器
精品课件
5
实验材料
动物组织（皮层、海马、纹状体等） 仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高
速离心机、电热恒温水温箱、-80℃冰箱、 制冰机、抽虑瓶、液闪仪等） 材料（ 2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪 头、微纤维滤纸等） 药品（放射性配基、各种非标计化合物等）
（1）总结合管：100ul膜受体 + 200ul缓冲液 + 10 ul 放射性配体 （2）非特异管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul非标记配体 + 10 ul 放射性配体 （3）受试物管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul药物溶液 + 10 ul 放射性配体
化合物每次实验做两复管，进行两次单独 实验。
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24
8、各种指标
IC50：半数抑制浓度 KD：平衡解离常数（mol/L），物理意义为
受体有一半结合配基时所需要的配基浓度。 Bmax：受体最大结合容量（fmol /mg蛋白
质） nH：Hill系数
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25
Scatchard方程与作图 （饱和实验）
试剂： 甲苯、PPO 、POPOP
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22
6、 测定结合型放射配体每分钟放射计数
采用放射性计数仪，测定各测试管中结合 型放射配体每分钟放射计数
注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器： 液闪仪 试剂： 无
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23
7、数据处理
按以下公式计算各化合物对同位素配基结 合的抑制率百分率：
抑制率(I %)=（总结合管cpm—化合物cpm）/ （总结合管cpm—非特异结合管cpm）×100%
每次20分钟 弃上清液，沉淀（膜受体）放-80度超低温冰箱保存备用 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低
温高超离心机 试剂：超纯水
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19
3、加样
取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定 浓度的膜受体溶液。
取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度 按以下顺序及比例加入各种反应液。
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6
实验仪器
组织匀浆机 IKA，T10B S25
漩涡混合器 WH-2
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7
低温高速离心机 凯达，TGL20M
超低温冰箱 海尔
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8
数显恒温水浴锅 金燕，HH-S26S
制冰机
GELIN 型号IMS-50 automatic
ice flakes
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9
电热恒温水温箱
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3
RBA的分类
RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体 进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性 和定量的分析。 1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变化 来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及 受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性 等。 2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性质 的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或 细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的 平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。
循环水式多用真空泵
液闪测定计数仪 HIDEX， 425-034型
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10
实验材料
2ml离心管
6ml一次性软试管
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11
枪头
200ul
1ml
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10ul
12
Tris
PPO与POPOP
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13
过滤装置
砂芯过滤装置（抽滤 瓶）
1000ml
Whatman GF/C玻璃 微纤维滤纸
40mm
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14
放射性化合物
放射性配体 低温保存
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15
实验方法流程
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16
实验方法流程
1、制备受体样品； 2、加样、温育进行结合反应； 3、终止反应，分离结合物与游离物 4、测定结合物的放射性； 5、数据处理。
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实验具体操作（D1、D2、5-HT）
1、配制各种缓冲液及试剂 按处方配比配制各种缓冲液贮备液 配制各种非标记配体溶液 配制各种受试药物溶液 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、
药理室讲座
放射性配体与受体结合分析实 验（RBA）方法
刘星华 2011-5-13
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1
内容
实验定义与原理 实验材料与仪器 实验方法 Scatchard方程与作图（饱和与竞争实验） RBA的安全问题 实验举例
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2
实验定义与原理
定义 放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析
（radioassay of receptors），它是应用放射性核 素标记配基与特异受体相结合，研究受体的亲和 力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法。 原理 放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细 胞，或含有受体的制剂一起温育，使受体和配基 充分结合，形成受体-配基复合物，终止反应后， 用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测 定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基 结合的受体的量。
注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：移液枪、烧杯、量筒、EP管等 试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液
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20
4、 受体配体结合反应
以上各管在加完放射性配体后，立即放入 37度的水浴锅中，孵育20分钟。20分钟后 把各管放入冰中终止反应。
注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：恒温水浴锅，制冰机 试剂：无
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21
5 、分离游离及结合的放射性配体
上述各管在反应结束后，分别倒入抽滤装 置进行过滤，并用5-10ml冰冷的缓冲液冲 洗滤膜2次。滤膜放入85度烘箱中烘干，随 后放入测试管中，关加入一定体积的闪烁 液，浸泡过夜。
注意：该项操作所需试剂或仪器
仪器： 抽滤器、烘箱、滤纸、移液枪、液 闪杯
宁、HCl 、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2 、 DMSO 、甲苯、PPO 、POPOP、Methysergide 、 Butaclamol及5HT 等
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2、制备膜受体
大鼠断头取脑 分离出目标组织 加10倍体积（V / W）冰冷的缓冲液 用组织匀浆机匀浆3次，每次数秒钟，制成组织匀浆液 组织匀浆液用低温高超离心机离心（12000转/分）3次，
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4
实验材料与仪器
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5
实验材料
动物组织（皮层、海马、纹状体等） 仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高
速离心机、电热恒温水温箱、-80℃冰箱、 制冰机、抽虑瓶、液闪仪等） 材料（ 2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪 头、微纤维滤纸等） 药品（放射性配基、各种非标计化合物等）
（1）总结合管：100ul膜受体 + 200ul缓冲液 + 10 ul 放射性配体 （2）非特异管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul非标记配体 + 10 ul 放射性配体 （3）受试物管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul药物溶液 + 10 ul 放射性配体
化合物每次实验做两复管，进行两次单独 实验。
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8、各种指标
IC50：半数抑制浓度 KD：平衡解离常数（mol/L），物理意义为
受体有一半结合配基时所需要的配基浓度。 Bmax：受体最大结合容量（fmol /mg蛋白
质） nH：Hill系数
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Scatchard方程与作图 （饱和实验）
试剂： 甲苯、PPO 、POPOP
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6、 测定结合型放射配体每分钟放射计数
采用放射性计数仪，测定各测试管中结合 型放射配体每分钟放射计数
注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器： 液闪仪 试剂： 无
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7、数据处理
按以下公式计算各化合物对同位素配基结 合的抑制率百分率：
抑制率(I %)=（总结合管cpm—化合物cpm）/ （总结合管cpm—非特异结合管cpm）×100%
每次20分钟 弃上清液，沉淀（膜受体）放-80度超低温冰箱保存备用 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低
温高超离心机 试剂：超纯水
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3、加样
取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定 浓度的膜受体溶液。
取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度 按以下顺序及比例加入各种反应液。
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实验仪器
组织匀浆机 IKA，T10B S25
漩涡混合器 WH-2
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低温高速离心机 凯达，TGL20M
超低温冰箱 海尔
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数显恒温水浴锅 金燕，HH-S26S
制冰机
GELIN 型号IMS-50 automatic
ice flakes
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9
电热恒温水温箱
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3
RBA的分类
RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体 进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性 和定量的分析。 1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变化 来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及 受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性 等。 2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性质 的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或 细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的 平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。
循环水式多用真空泵
液闪测定计数仪 HIDEX， 425-034型
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实验材料
2ml离心管
6ml一次性软试管
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11
枪头
200ul
1ml
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10ul
12
Tris
PPO与POPOP
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13
过滤装置
砂芯过滤装置（抽滤 瓶）
1000ml
Whatman GF/C玻璃 微纤维滤纸
40mm
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14
放射性化合物
放射性配体 低温保存
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实验方法流程
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实验方法流程
1、制备受体样品； 2、加样、温育进行结合反应； 3、终止反应，分离结合物与游离物 4、测定结合物的放射性； 5、数据处理。
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实验具体操作（D1、D2、5-HT）
1、配制各种缓冲液及试剂 按处方配比配制各种缓冲液贮备液 配制各种非标记配体溶液 配制各种受试药物溶液 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、
药理室讲座
放射性配体与受体结合分析实 验（RBA）方法
刘星华 2011-5-13
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1
内容
实验定义与原理 实验材料与仪器 实验方法 Scatchard方程与作图（饱和与竞争实验） RBA的安全问题 实验举例
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2
实验定义与原理
定义 放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析
（radioassay of receptors），它是应用放射性核 素标记配基与特异受体相结合，研究受体的亲和 力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法。 原理 放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细 胞，或含有受体的制剂一起温育，使受体和配基 充分结合，形成受体-配基复合物，终止反应后， 用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测 定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基 结合的受体的量。
注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：移液枪、烧杯、量筒、EP管等 试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液
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20
4、 受体配体结合反应
以上各管在加完放射性配体后，立即放入 37度的水浴锅中，孵育20分钟。20分钟后 把各管放入冰中终止反应。
注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：恒温水浴锅，制冰机 试剂：无
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5 、分离游离及结合的放射性配体
上述各管在反应结束后，分别倒入抽滤装 置进行过滤，并用5-10ml冰冷的缓冲液冲 洗滤膜2次。滤膜放入85度烘箱中烘干，随 后放入测试管中，关加入一定体积的闪烁 液，浸泡过夜。
注意：该项操作所需试剂或仪器
仪器： 抽滤器、烘箱、滤纸、移液枪、液 闪杯