放射性配体与受体结合分析实验(RBA)方法
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化合物每次实验做两复管，进行两次单独 实验。
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8、各种指标
IC50：半数抑制浓度 KD：平衡解离常数（mol/L），物理意义为
受体有一半结合配基时所需要的配基浓度。 Bmax：受体最大结合容量（fmol /mg蛋白
质） nH：Hill系数
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25
Scatchard方程与作图 （饱和实验）
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4
实验材料与仪器
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5
实验材料
动物组织（皮层、海马、纹状体等） 仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高
速离心机、电热恒温水温箱、-80℃冰箱、 制冰机、抽虑瓶、液闪仪等） 材料（ 2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪 头、微纤维滤纸等） 药品（放射性配基、各种非标计化合物等）
试剂： 甲苯、PPO 、POPOP
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22
6、 测定结合型放射配体每分钟放射计数
采用放射性计数仪，测定各测试管中结合 型放射配体每分钟放射计数
注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器： 液闪仪 试剂： 无
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7、数据处理
按以下公式计算各化合物ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ同位素配基结 合的抑制率百分率：
抑制率(I %)=（总结合管cpm—化合物cpm）/ （总结合管cpm—非特异结合管cpm）×100%
试管、EP管等 试剂：无水乙醇、超纯水、Tris 、抗血酸、优降
宁、HCl 、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2 、 DMSO 、甲苯、PPO 、POPOP、Methysergide 、 Butaclamol及5HT 等
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18
2、制备膜受体
大鼠断头取脑 分离出目标组织 加10倍体积（V / W）冰冷的缓冲液 用组织匀浆机匀浆3次，每次数秒钟，制成组织匀浆液 组织匀浆液用低温高超离心机离心（12000转/分）3次，
循环水式多用真空泵
液闪测定计数仪 HIDEX， 425-034型
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实验材料
2ml离心管
6ml一次性软试管
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11
枪头
200ul
1ml
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10ul
12
Tris
PPO与POPOP
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13
过滤装置
砂芯过滤装置（抽滤 瓶）
1000ml
Whatman GF/C玻璃 微纤维滤纸
40mm
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14
放射性化合物
放射性配体 低温保存
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15
实验方法流程
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16
实验方法流程
1、制备受体样品； 2、加样、温育进行结合反应； 3、终止反应，分离结合物与游离物 4、测定结合物的放射性； 5、数据处理。
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实验具体操作（D1、D2、5-HT）
1、配制各种缓冲液及试剂 按处方配比配制各种缓冲液贮备液 配制各种非标记配体溶液 配制各种受试药物溶液 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、
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6
实验仪器
组织匀浆机 IKA，T10B S25
漩涡混合器 WH-2
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7
低温高速离心机 凯达，TGL20M
超低温冰箱 海尔
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8
数显恒温水浴锅 金燕，HH-S26S
制冰机
GELIN 型号IMS-50 automatic
ice flakes
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9
电热恒温水温箱
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3
RBA的分类
RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体 进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性 和定量的分析。 1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变化 来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及 受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性 等。 2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性质 的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或 细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的 平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。
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5 、分离游离及结合的放射性配体
上述各管在反应结束后，分别倒入抽滤装 置进行过滤，并用5-10ml冰冷的缓冲液冲 洗滤膜2次。滤膜放入85度烘箱中烘干，随 后放入测试管中，关加入一定体积的闪烁 液，浸泡过夜。
注意：该项操作所需试剂或仪器
仪器： 抽滤器、烘箱、滤纸、移液枪、液 闪杯
（radioassay of receptors），它是应用放射性核 素标记配基与特异受体相结合，研究受体的亲和 力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法。 原理 放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细 胞，或含有受体的制剂一起温育，使受体和配基 充分结合，形成受体-配基复合物，终止反应后， 用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测 定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基 结合的受体的量。
药理室讲座
放射性配体与受体结合分析实 验（RBA）方法
刘星华 2011-5-13
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1
内容
实验定义与原理 实验材料与仪器 实验方法 Scatchard方程与作图（饱和与竞争实验） RBA的安全问题 实验举例
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2
实验定义与原理
定义 放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析
（1）总结合管：100ul膜受体 + 200ul缓冲液 + 10 ul 放射性配体 （2）非特异管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul非标记配体 + 10 ul 放射性配体 （3）受试物管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul药物溶液 + 10 ul 放射性配体
注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：移液枪、烧杯、量筒、EP管等 试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液
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4、 受体配体结合反应
以上各管在加完放射性配体后，立即放入 37度的水浴锅中，孵育20分钟。20分钟后 把各管放入冰中终止反应。
注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：恒温水浴锅，制冰机 试剂：无
每次20分钟 弃上清液，沉淀（膜受体）放-80度超低温冰箱保存备用 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低
温高超离心机 试剂：超纯水
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3、加样
取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定 浓度的膜受体溶液。
取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度 按以下顺序及比例加入各种反应液。
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8、各种指标
IC50：半数抑制浓度 KD：平衡解离常数（mol/L），物理意义为
受体有一半结合配基时所需要的配基浓度。 Bmax：受体最大结合容量（fmol /mg蛋白
质） nH：Hill系数
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Scatchard方程与作图 （饱和实验）
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实验材料与仪器
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实验材料
动物组织（皮层、海马、纹状体等） 仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高
速离心机、电热恒温水温箱、-80℃冰箱、 制冰机、抽虑瓶、液闪仪等） 材料（ 2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪 头、微纤维滤纸等） 药品（放射性配基、各种非标计化合物等）
试剂： 甲苯、PPO 、POPOP
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6、 测定结合型放射配体每分钟放射计数
采用放射性计数仪，测定各测试管中结合 型放射配体每分钟放射计数
注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器： 液闪仪 试剂： 无
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7、数据处理
按以下公式计算各化合物ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ同位素配基结 合的抑制率百分率：
抑制率(I %)=（总结合管cpm—化合物cpm）/ （总结合管cpm—非特异结合管cpm）×100%
试管、EP管等 试剂：无水乙醇、超纯水、Tris 、抗血酸、优降
宁、HCl 、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2 、 DMSO 、甲苯、PPO 、POPOP、Methysergide 、 Butaclamol及5HT 等
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2、制备膜受体
大鼠断头取脑 分离出目标组织 加10倍体积（V / W）冰冷的缓冲液 用组织匀浆机匀浆3次，每次数秒钟，制成组织匀浆液 组织匀浆液用低温高超离心机离心（12000转/分）3次，
循环水式多用真空泵
液闪测定计数仪 HIDEX， 425-034型
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实验材料
2ml离心管
6ml一次性软试管
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枪头
200ul
1ml
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10ul
12
Tris
PPO与POPOP
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过滤装置
砂芯过滤装置（抽滤 瓶）
1000ml
Whatman GF/C玻璃 微纤维滤纸
40mm
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放射性化合物
放射性配体 低温保存
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实验方法流程
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实验方法流程
1、制备受体样品； 2、加样、温育进行结合反应； 3、终止反应，分离结合物与游离物 4、测定结合物的放射性； 5、数据处理。
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实验具体操作（D1、D2、5-HT）
1、配制各种缓冲液及试剂 按处方配比配制各种缓冲液贮备液 配制各种非标记配体溶液 配制各种受试药物溶液 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、
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实验仪器
组织匀浆机 IKA，T10B S25
漩涡混合器 WH-2
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低温高速离心机 凯达，TGL20M
超低温冰箱 海尔
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数显恒温水浴锅 金燕，HH-S26S
制冰机
GELIN 型号IMS-50 automatic
ice flakes
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电热恒温水温箱
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RBA的分类
RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体 进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性 和定量的分析。 1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变化 来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及 受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性 等。 2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性质 的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或 细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的 平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。
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5 、分离游离及结合的放射性配体
上述各管在反应结束后，分别倒入抽滤装 置进行过滤，并用5-10ml冰冷的缓冲液冲 洗滤膜2次。滤膜放入85度烘箱中烘干，随 后放入测试管中，关加入一定体积的闪烁 液，浸泡过夜。
注意：该项操作所需试剂或仪器
仪器： 抽滤器、烘箱、滤纸、移液枪、液 闪杯
（radioassay of receptors），它是应用放射性核 素标记配基与特异受体相结合，研究受体的亲和 力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法。 原理 放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细 胞，或含有受体的制剂一起温育，使受体和配基 充分结合，形成受体-配基复合物，终止反应后， 用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测 定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基 结合的受体的量。
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放射性配体与受体结合分析实 验（RBA）方法
刘星华 2011-5-13
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1
内容
实验定义与原理 实验材料与仪器 实验方法 Scatchard方程与作图（饱和与竞争实验） RBA的安全问题 实验举例
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实验定义与原理
定义 放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析
（1）总结合管：100ul膜受体 + 200ul缓冲液 + 10 ul 放射性配体 （2）非特异管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul非标记配体 + 10 ul 放射性配体 （3）受试物管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul药物溶液 + 10 ul 放射性配体
注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：移液枪、烧杯、量筒、EP管等 试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液
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4、 受体配体结合反应
以上各管在加完放射性配体后，立即放入 37度的水浴锅中，孵育20分钟。20分钟后 把各管放入冰中终止反应。
注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：恒温水浴锅，制冰机 试剂：无
每次20分钟 弃上清液，沉淀（膜受体）放-80度超低温冰箱保存备用 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低
温高超离心机 试剂：超纯水
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3、加样
取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定 浓度的膜受体溶液。
取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度 按以下顺序及比例加入各种反应液。