分子生物学技术新进展
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分子生物学技术新进展
分子生物学技术新进展
二十一世纪医学发展的主要特点之一是对生命现象和 疾病本质的认识逐渐向分子水平深入。最近十年，分子生 物技术已成为医学领域极其有力的研究工具，基因工程技 术、人类基因组计划与核酸序列测定技术、基因诊断与基 因体外扩增技术、生物芯片技术、分子纳米技术在医学研 究中和药物研制与开发中得到广泛应用，使得分子生物医 学技术取得了突破性进展，也给医学带来了崭新的局面， 分子生物技术已经成为现代医学的前沿和热点。
分子生物学技术新进展
分子生物技术概述
分子生物技术也称之为生物工程，是现代生 物技术的主要标志，其内容包括基因工程技术、 细胞工程技术、DNA测序技术、DNA芯片技术、 酶工程技术等。重组DNA技术是现代分子生物 技术发展中最重要的成就之一，也是基因工程 (Gene Engineering)的核心技术。
分子生物学技术新进展
基本原理与过程：
1、分离纯化目的基因 2、目的基因 + vector =重组DNA分子 3、重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。 4、筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cell clone），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞 克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同 的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液 体培养基中进行扩增。 5、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞， 并选择分离重组DNA。
分子生物学技术新进展
（三）实时定量PCR (real-time PCR)技术
是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过 标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
分子生物学技术新进展
分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization and Blotting Technique 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization)原理 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分 子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一 定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之 间形成杂化双链(heteroduplex) 。
（三）DNA和RNA的微量分析
PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是 DNA和RNA微量分析的最好方法。
分子生物学技术新进展
（四）DNA序列测定 将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作 大为简化，也提高了测序的速度；
（五）基因突变分析 PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检 测的敏感性 。
分子生物学技术新进展
（二）原位PCR技术
原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片 上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特定 标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片 中核酸进行杂交，再以放射自显影的方法显示 结果。现在多用生物素酶免疫方法进行检测， 可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中 存在。
分子生物学技术新进展
重组DNA技术的发展史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 18661944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传
工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉
分子生物学技术新进展
目前原位PCR发展最快的是荧光素标记的原位 DNA杂交技术，即荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, 简称FISH技术），是利用与荧 光素分子偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针分子 特异性的结合来检测DNA序列在染色体上的位置。 此技术在病理学诊断上有广泛的实用性，包括病毒 感染的检测，特异性染色体的鉴别和肿瘤基因的检 查等。
分子生物学技术新进展
三、几种重要的PCR衍生技术
（一）逆转录PCR技术 逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将 RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术， 是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序 列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。
分子生物学技术新进展
重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）
是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体 外与基因运载体接合成具有自我复制能力的DNA 分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染 入另一细胞或生物体内，然后筛选出含有目的基 因的细胞，再进行扩增提取，获得大量重新组合 的DNA分子，也称基因克隆或 DNA克隆。 (常用的载体有：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC， YAC，PI等)。
分子生物学技术新进展
以 质 粒 为 载 体 的
DNA 克 隆 过 程
分子生物学技术新进展
重组DNA技术的目的
• 上述细胞的克隆系统可直接导入的目基 因扩增，获得足够量的目的基因来进行 结构与功能的研究。
• 重组DNA技术的另一目的是获得基因 重组后的产物——RNA，蛋白质。
• 将目的基因与表达载体重组，导入宿主 细胞进而表达出相应的基因产物（蛋 白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的 抗原和特异的抗体等。
分子生物学技术新进展
重组DNA和分子克隆的几种方法： （依目的基因的来源）
1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆 2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行 克隆 3、化学合成目的基因进行克隆 4、PCR体外扩增目的片段进行克隆
分子生物学技术新进展
PCR体系基本组成成分和步骤
•模板DNA
•特异性引物
•耐热DNA聚合酶
•dNTPs •Mg 2+
延伸 72˚C
变性 95˚C
退火 Tm-5˚C
分子生物学技术新进展
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）
Template DNA
5 5
5
Primer 1
5 Primer 2
Cycle 1
5 5
5 5
5 5
Cycle 2
5
5
5
5
分子生物学技术新进展
5 5
5 5
5 5
Cycle 3
5Baidu Nhomakorabea
5
5
5
5
5
5
5
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5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
分子生物学技术新进展
二、PCR技术的主要用途
（一）目的基因的克隆 （二）基因突变
利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片 段进行嵌和、缺失、点突变等改造。
分子生物学技术新进展
二十一世纪医学发展的主要特点之一是对生命现象和 疾病本质的认识逐渐向分子水平深入。最近十年，分子生 物技术已成为医学领域极其有力的研究工具，基因工程技 术、人类基因组计划与核酸序列测定技术、基因诊断与基 因体外扩增技术、生物芯片技术、分子纳米技术在医学研 究中和药物研制与开发中得到广泛应用，使得分子生物医 学技术取得了突破性进展，也给医学带来了崭新的局面， 分子生物技术已经成为现代医学的前沿和热点。
分子生物学技术新进展
分子生物技术概述
分子生物技术也称之为生物工程，是现代生 物技术的主要标志，其内容包括基因工程技术、 细胞工程技术、DNA测序技术、DNA芯片技术、 酶工程技术等。重组DNA技术是现代分子生物 技术发展中最重要的成就之一，也是基因工程 (Gene Engineering)的核心技术。
分子生物学技术新进展
基本原理与过程：
1、分离纯化目的基因 2、目的基因 + vector =重组DNA分子 3、重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。 4、筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cell clone），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞 克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同 的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液 体培养基中进行扩增。 5、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞， 并选择分离重组DNA。
分子生物学技术新进展
（三）实时定量PCR (real-time PCR)技术
是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过 标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
分子生物学技术新进展
分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization and Blotting Technique 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization)原理 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分 子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一 定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之 间形成杂化双链(heteroduplex) 。
（三）DNA和RNA的微量分析
PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是 DNA和RNA微量分析的最好方法。
分子生物学技术新进展
（四）DNA序列测定 将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作 大为简化，也提高了测序的速度；
（五）基因突变分析 PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检 测的敏感性 。
分子生物学技术新进展
（二）原位PCR技术
原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片 上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特定 标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片 中核酸进行杂交，再以放射自显影的方法显示 结果。现在多用生物素酶免疫方法进行检测， 可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中 存在。
分子生物学技术新进展
重组DNA技术的发展史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 18661944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传
工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉
分子生物学技术新进展
目前原位PCR发展最快的是荧光素标记的原位 DNA杂交技术，即荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, 简称FISH技术），是利用与荧 光素分子偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针分子 特异性的结合来检测DNA序列在染色体上的位置。 此技术在病理学诊断上有广泛的实用性，包括病毒 感染的检测，特异性染色体的鉴别和肿瘤基因的检 查等。
分子生物学技术新进展
三、几种重要的PCR衍生技术
（一）逆转录PCR技术 逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将 RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术， 是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序 列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。
分子生物学技术新进展
重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）
是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体 外与基因运载体接合成具有自我复制能力的DNA 分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染 入另一细胞或生物体内，然后筛选出含有目的基 因的细胞，再进行扩增提取，获得大量重新组合 的DNA分子，也称基因克隆或 DNA克隆。 (常用的载体有：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC， YAC，PI等)。
分子生物学技术新进展
以 质 粒 为 载 体 的
DNA 克 隆 过 程
分子生物学技术新进展
重组DNA技术的目的
• 上述细胞的克隆系统可直接导入的目基 因扩增，获得足够量的目的基因来进行 结构与功能的研究。
• 重组DNA技术的另一目的是获得基因 重组后的产物——RNA，蛋白质。
• 将目的基因与表达载体重组，导入宿主 细胞进而表达出相应的基因产物（蛋 白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的 抗原和特异的抗体等。
分子生物学技术新进展
重组DNA和分子克隆的几种方法： （依目的基因的来源）
1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆 2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行 克隆 3、化学合成目的基因进行克隆 4、PCR体外扩增目的片段进行克隆
分子生物学技术新进展
PCR体系基本组成成分和步骤
•模板DNA
•特异性引物
•耐热DNA聚合酶
•dNTPs •Mg 2+
延伸 72˚C
变性 95˚C
退火 Tm-5˚C
分子生物学技术新进展
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）
Template DNA
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Primer 1
5 Primer 2
Cycle 1
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Cycle 2
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分子生物学技术新进展
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Cycle 3
5Baidu Nhomakorabea
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25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
分子生物学技术新进展
二、PCR技术的主要用途
（一）目的基因的克隆 （二）基因突变
利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片 段进行嵌和、缺失、点突变等改造。