流式检测细胞周期要点
细胞周期分析偏高注意事项
细胞周期分析偏高注意事项细胞周期分析是用来研究细胞生长和分裂过程的一种实验技术，通过测量细胞在不同细胞周期阶段的比例和持续时间，可以了解细胞周期的调控机制以及细胞增殖的异常情况。
在进行细胞周期分析时，需要注意以下几个方面：1. 细胞处理：在实验开始之前，需要将细胞制备至适宜的生长状态。
通常需要使用细胞培养基培养细胞，不同类型的细胞培养需要根据具体实验要求采取不同的操作方法。
同时，需要注意细胞的数量和密度，以确保细胞可以正常生长和分裂。
2. 细胞收集：细胞周期分析通常使用流式细胞术进行，因此需要先将细胞从培养皿或培养板中收集出来。
收集细胞时，要注意不要使细胞遭受太大的损伤，避免对细胞周期的影响。
可以使用胰酶等酶来进行细胞解聚，也可以使用细胞刮刀轻轻刮取细胞。
收集的细胞应尽可能集中和纯净，以获得准确的结果。
3. 样本处理：在细胞收集完成后，需要对样本进行处理。
通常需要将细胞用PBS 缓冲液洗涤一遍，去除残余的培养基和细胞碎片。
然后，可以使用乙醇等溶剂将细胞固定，以保持其形态结构。
固定时间和温度需要根据不同类型的细胞进行调整。
4. 细胞染色：为了鉴定细胞的不同细胞周期阶段，通常需要对细胞进行染色。
常用的染色剂有荧光素-氨基酸，乙蓝溴化物等。
染色剂浓度和染色时间需要进行优化，以充分显示细胞的染色状态。
5. 流式细胞仪分析：细胞染色完成后，可以通过流式细胞仪对细胞进行分析。
在进行分析之前，需要对流式细胞仪进行校准，以确保测量的准确性。
在设置参数时，需要根据细胞样本的染色状态进行调整，以使流式细胞仪可以准确识别和区分不同细胞周期阶段的细胞。
6. 数据分析：流式细胞仪会生成一系列的图表和数据，需要将这些数据进行统计和分析。
通常，可以使用软件进行细胞周期数据的分析，比如ModFit LT和FlowJo等。
数据分析的目的是了解细胞的增殖速率、细胞周期分布以及细胞周期的调控机制。
在进行细胞周期分析时，还需要注意以下几个技术细节：1. 细胞样本的保存：实验完成后，需要妥善保存细胞样本，以备后续的实验分析。
利用流式细胞仪分析细胞存活率细胞周期ROS
利用流式细胞仪分析细胞存活率细胞周期ROS 流式细胞仪（Flow cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究领域的技术，可用于分析细胞数量、形态、存活率、细胞周期等多个参数。
下面将详细介绍如何利用流式细胞仪来分析细胞存活率、细胞周期和ROS （Reactive Oxygen Species）。
一、分析细胞存活率细胞存活率是研究细胞毒性或细胞凋亡过程中的重要参数。
在流式细胞仪中，常用细胞染色剂PI（Propidium Iodide）来评估细胞的存活率。
PI是一种能够穿透破损细胞膜并结合DNA的染色剂，可以通过荧光检测器来测量。
具体操作步骤如下：1.培养待测试的细胞，并将细胞备样。
可以使用PBS洗涤一遍，以获得单细胞悬浮液。
2. 使用细胞培养基或PBS将细胞悬浮液稀释至合适的细胞浓度，通常在1×10^6 - 1×10^7 cells/mL之间。
3.加入适量的PI染色剂到细胞悬浮液中，一般终浓度为1-10μg/mL。
4.在黑暗条件下，在4°C冷藏室中孵育15-30分钟，避免光照和温度升高。
5.使用流式细胞仪进行测量。
设置PI染色剂的激发波长和检测通道，根据实验需要选择适当的过滤器。
6. 将细胞悬浮液转移到流式细胞仪的样本管中，进行数据采集和分析。
可以设置门控（gating）策略以排除细胞碎片和颗粒物。
通过分析样本中PI染色的细胞数量，可以计算出细胞的存活率。
二、分析细胞周期细胞周期分析是研究细胞增殖和凋亡机制的一项重要实验。
在流式细胞仪中，通过DNA染色剂染色和分析可以了解细胞的周期分布情况。
具体操作步骤如下：1.培养待测试的细胞，并将细胞备样。
可以使用PBS洗涤一遍，以获得单细胞悬浮液。
2. 使用细胞培养基或PBS将细胞悬浮液稀释至合适的细胞浓度，通常在1×10^6 - 1×10^7 cells/mL之间。
3.用酒精或细胞固定液固定细胞，一般在-20°C的环境中固定20-30分钟。
细胞周期的流式检测方式技巧
细胞周期的流式检测方法细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为G0/G1期、S期、G2/M期。
在科研实践中，很多实验具有对细胞群体的周期分布进行检测的需求。
细胞群体周期测定的方法有很多种，最常用的是PI（碘化丙啶）渗入DNA进行染色，然后通过流式细胞仪检测PI从而测定细胞群体的周期分布。
因此，下面笔者主要通过BD（Becton＆Dickinson）公司生产的BD FACSCalibur流式细胞仪测定PI标记的细胞群体为例，对细胞周期的流式检测方法进行阐述。
一、PI染色步骤概略1、单细胞悬液离心，1500rpm , 5min，弃上清。
2、PBS 1ml离心，弃上清。
3、70%酒精2ml，4℃，30min，离心，弃上清液。
4、PBS 1ml离心，弃上清。
5、RNase A的PBS溶液(20ug/ml)，500ul，37℃，30min，离心弃上清。
6、PBS 1ml离心，弃上清。
7、PI的PBS溶液(50ug/ml)，500ul，室温避光孵育30min。
8、吹打混匀，300目筛网过滤至流式管中，4℃保存，待测。
二、Calibur仪器设置及数据收集1、依次打开Calibur机器电源、电脑开关和CellQuest Pro软件，按快捷键Command+B连机，按快捷键Command+1、2、3、4调出Detectors/Amps面板、Threshold面板、Compensation 面板和Status面板，软件的操作界面如图1所示。
图1. Cell Quest Pro软件操作界面2、建立实验模板，包括FSC/SSC散点图、FL2-W/FL2-A散点图和FL2-A直方图。
因为PI 在Calibur上是由488nm的激光器激发，530/30滤光片收集信号，所以选择FL2通道进行检测。
细胞周期是2N和4N的循环，所以FL2通道的Mode参数应设置为Lin模式，同时阈值（Threshold）的Primary Param参数设置为FL2-H，Four Color DDM Param参数设置为FL2，如图2、图3所示。
流式细胞术测定细胞周期
流式细胞术测定细胞周期一、实验原理碘化丙锭（PI）可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA 消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA 含量的多少。
由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。
因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M 期,并可通过Multicycle软件计算各时相的百分率。
值得注意的是, PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时,必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。
乙醇通常为终浓度为70%的冷乙醇。
二、实验准备1、试剂胰酶、PBS、纯乙醇（4℃）、RNase A、Triton X-1002、主要器材300目尼龙过滤网三、实验步骤1、每个样品细胞数不得少于100万。
2、胰酶消化，收集细胞（贴壁细胞）或1000rpm离心5分钟直接收集细胞（悬浮细胞）。
3、4℃ PBS洗一次，将细胞重悬于0.3ml 4℃ PBS，加入0.7ml 4℃的纯乙醇，将枪头伸入液面下，轻轻打入乙醇，轻柔混匀两次，4℃固定过夜。
4、1000rpm离心5分钟，去上清，加入染色缓冲液PI染色缓冲液：50 μg/ml PI0.1 mg/ml RNase A0.05% Triton X-100总体积1ml/样品，37℃孵育40分钟。
5、1000rpm 离心5分钟，小心去除上清，加入1ml PBS，轻柔混匀，300目过滤，上机检测。
流式分析细胞周期
流式分析细胞周期
最近在做加药物的细胞周期，做了好几次，出现如下图的流式拟合图，师姐们都说你这样的拟合是强行的拟合，s期不明显，需要重新做，可是做了好多次还是这样的结果。
望专家教教我是哪里出错。
做细胞周期的步骤是：
1. 先铺板，2E5/孔。
过夜培养后加药（24h）
2. 再经过24h后可以进行测量。
3. 收集上清，并用PBS洗涤，再用胰酶消化，接着用PBS再洗一遍（在15ml管子中进行）
4. 1500转离心，小心去除上清，加入1ml的预冷PBS（记得要冲洗一下管壁），混匀后吸到1.5ml管中，再次在大厅中的离心机1500转4-5min（经过这样的一遍洗涤即可）
固定
5. 用枪吸走上清，剩余50ul左右，切勿吸走细胞，随后➕300ul 预冷PBS（用左手拿着EP管小拇指抵住涡旋震荡仪，右手拿住吸有700ul的乙醇的枪）缓慢打入其中，（这个过程尽量要慢）
6. 置于-20°冰箱中20min（有的说1h），若是过夜要要置于4°（有的说4h以上）
7. 1500转离心3-5min，小心吸上清
8. 加入1ml预冷PBS，重悬
9. 1500转离心3-5min，吸取上清，轻弹
染色
10. 0.5ml/管的碘化丙锭染色液（PI）缓慢加入，并充分的混匀
11. 37°避光30min
先配好染色的溶液
12. 4°避光存放2h
13. 上流式仪。
流式细胞术的应用-周期检测
细胞周期的检测目录一、背景知识二、实验设计原则三、实验操作步骤四、实验结果分析一、背景知识1、细胞周期：G0/G1二倍体S二倍体---四倍体G2/M四倍体细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程。
共分为静止期(GO期)、DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)与分裂期(M期)。
在细胞周期的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。
通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以检测细胞周期。
2、细胞周期常用的核酸染料1.碘化丙啶(Propidium Iodide, PI) 是一种可以嵌合到双链DNA和RNA 的碱基对中，并与之结合的荧光染料，无碱基特异性。
其与双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。
细胞内的DNA被PI染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量的测定。
PI不能穿透细胞膜而被排斥在活细胞外，但是可以穿过破损的细胞膜而对核染色。
可用于区分活、死细胞。
利用这一特性，通常与Calcein-AM、Hoechst 33258或Hoechst 33342等活细胞荧光探针一起使用，同时对活细胞和死细胞染色和鉴定，用于细胞凋亡相关的研究。
也可以用作多重荧光染色的复染剂，兼容于各种细胞标记技术，包括直接或者间接的荧光抗体检测，mRNA原位杂交，细胞结构特异性的荧光探针检测法以及组织染色。
PI的单独染色也可以进行细胞周期的检测。
PI的摩尔吸光系数相对比较低，但是其具有足够大的斯托克斯频移来同时检测核酸DNA和荧光标记抗体，只需要使恰当的滤片。
PI适用于荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪以及荧光计分析。
2.7-氨基放线菌素(7-amino-actinomycinD，7-AAD) 是一种核酸染料。
它不能通过正常细胞膜。
7-AAD同PI有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。
流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程
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流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程
流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程哎呀，这可是个不简单的活儿啊！今天我们就要聊聊流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程。
话说这个方法可是科学家们研究细胞生长和分裂的重要工具呢，那咱们就好好聊聊吧！咱们得明白什么是细胞周期。
简单来说，就是细胞从一个生命周期阶段到另一个阶段的过程。
就像人一样，从出生到长大再到老去，每个阶段都有不同的特点和任务。
而细胞也是这样，它们也有自己的生命周期，从分裂开始，到分化成不同的细胞类型，再到死亡或修复损伤。
如何知道这些细胞在什么时候开始分裂、什么时候结束呢？这就需要用到流式细胞术了。
流式细胞术的原理其实很简单，就是通过激光或其他光源对细胞进行照射，然后利用特殊的摄像头捕捉不同颜色的荧光染料标记的细胞。
这些荧光染料会因为细胞内部的某些分子而发光，所以我们可以通过观察荧光的颜色和强度来判断细胞的状态和位置。
咱们就来看看流式细胞术的技术流程吧。
第一步，准备工作。
先要把待检测的细胞样本准备好，然后把它们稀释到一定浓度，这样可以让更多的地方都能看到荧光信号。
接着，要把样品放到流式细胞仪上，这里有一个小技巧：要尽量让样品均匀分布，这样才能保证检测结果的准确性哦！第二步，激光照射。
这时候要用到激光器或者其他光源对样品进行照射。
记住啊，这个过程一定要快，否则荧光信号可能会减弱或者消失。
不过不用担心，现在的流式细胞仪都设计得很聪明，能够自动调整激光功率和时间长度，以获得最佳的检测效果。
第三步，数据采集。
照射完成后，流式细胞仪就会自动记录下每个荧光信号的位置、强度和持续时间等信息。
这些数据会被传输到电脑上进行分析和处理。
别看这步骤听起来简单，实际上需要非常高的精度和速度才能做到哦！第四步，数据分析。
这一步主要是通过软件对收集到的数据进行分析和比对，找出其中的规律和异常情况。
比如说，我们可以通过观察不同细胞的荧光信号强度来判断它们的生命周期阶段；也可以通过比较不同样品之间的荧光信号差异来寻找潜在的疾病标志物等等。
整理)流式细胞检测细胞周期
流式细胞检测细胞周期一、所需试剂1、细胞周期检测试剂盒（1）PI：Propidium Iodide，碘化丙啶，是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光，如果自己买，那就10mg用200mlPBS 溶解，4℃避光保存（0.05mg/ml）（2）RNAase：PI既能与DNA结合，又能与RNA结合，所以要用RNase降解，如果自己买，那就100mg用20mlPBS溶解，200μl分装-20℃避光保存（5mg/ml）2、预冷70%-75%酒精：可用无水乙醇和纯水配制3、预冷PBS4、流式管：可以去医研中心拿二、实验步骤<一>、细胞处理1、种板处理等同功能实验（保证细胞有2-5×10*5个）2、消化细胞，离心(1000r/300g 5min)收集细胞沉淀。
3、用预冷的PBS清洗细胞1-2次。
4、离心(1000r/300g 5min)收集细胞沉淀5、固定细胞：用0.2ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入2ml预冷70-75%酒精，震荡，4℃固定过夜。
（直接向细胞加入酒精容易使细胞成团，震荡不要过猛，容易使细胞破碎）<二>、细胞染色和检测1、离心（1000r/300g 5min）收集固定的细胞2、2mL的预冷PBS洗细胞一次，离心再次获取细胞沉淀3、染色：加入50μlRNA酶和250μl-450μl PI染色剂（用量根据试剂盒说明书），避光染色5-10min（一般加300μl，保证适当细胞浓度，浓度太高检测速度太快，结果不准；浓度太低检测速度太慢，时间太长）4、上机检测三、注意事项1、流式细胞仪原理看ppt非荧光信号（1）前向角散射光（FSC Forward scatter）细胞相对大小及其表面积（2）侧向角散射光（SSC side scatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性2、PI(碘化丙啶)不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。
流式细胞仪细胞周期图详解
1
流式细胞术检测细胞周期
1. 纵坐标Cell Number：即计数到的有效细胞数；
2. 横坐标DNA Content：即DNA量，为什么用DNA量来区别各周期
3. G1、G2、S三期在上图已经用箭头标示；
4. 右侧数字含义：Mean G1=19
5.4即G1期DNA含量平均值为195.4；%G1=73.6即G1期细胞数占总数的73.6%；
①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；
② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；
②G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时
间；④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
③
3、流式细胞结果图各参数的意义：
前面讲过，常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA 含量（横坐标）来分析的：
G1期：细胞DNA复制还没有开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；
S 期：细胞开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA 的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；
G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第二个峰；
M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。
流式检测细胞周期protocol
PI染色检测细胞周期
1、HepG2细胞培养至70%左右，细胞铺板（60mm小皿），8万/皿，饥饿48小时，加药处理96h（加药组10万/皿）
2、收集培养基，2ml胰酶消化细胞，新培养基3ml重悬，收集细胞悬液，1000rpm，5min离心
3、弃去上清，加入1ml预冷的PBS充分重悬细胞，转移到1.5ml的EP管
4、混匀，4°，600g，5min离心
5、弃去上清，用250ul预冷的PBS重悬细胞，充分重悬，加入至750ul冰浴的无水乙醇，轻轻吹打混匀；
6、用封口膜封口，—20°，4h，最好过夜，可在—20°保存1w左右；
7、染色：
㈠、除去封口膜，加入500ulPBS重悬细胞，4°，600g，5min离心；
㈡、弃去上清，加入1ml预冷的PBS洗涤一次；
㈢、同上离心，弃去上清；
㈣、每管加入200ul PBS +2ul RnaseA（100µg/ml）溶液缓慢充分混匀后，室温，避光孵育30min, 再加2.5ul PI(250µg/ml)，室温避光15min；
㈤、24h内流式检测。
试剂：RnaseA，beyotime,10mg/ml,ST576
PI, beyotime,20 mg/ml,ST512。
基于流式细胞术的细胞周期分析
基于流式细胞术的细胞周期分析细胞周期是生命科学中一个非常重要的概念。
细胞周期指的是细胞在生命周期中的一次分裂过程的全过程，包括从细胞生长、DNA复制到细胞分裂等一系列过程。
细胞周期的控制与细胞的增殖和分化、肿瘤的发生和发展密切相关。
因此，研究细胞周期对于我们深入了解生命活动、疾病发生机制以及治疗等方面都有着重要意义。
细胞周期的研究手段有很多，其中流式细胞术技术是一种经典且重要的方法。
流式细胞术是一种将细胞悬浮液通过装置推进以获得细胞个体某些特征的技术，它可以同时获得大量的细胞特征信息，包括细胞的大小、形态、DNA含量等参数，并且可以对这些参数进行统计分析。
在细胞周期研究中，通过采用流式细胞术对细胞进行染色分析，可以准确测定细胞周期的各个阶段，对细胞周期的研究提供了非常有力的工具。
细胞周期可以分为四个主要阶段：G1期、S期、G2期和M期。
G1期为生长期，细胞的体积增大，蛋白质合成增加，准备进行DNA复制。
S期为DNA合成期，细胞的DNA复制分为前期和后期两部分，复制完成后，细胞核内将有两套完全相同的DNA序列。
G2期为后生长期，细胞生长和检查DNA复制的准确性。
M期为分裂期，包括前期、中期和后期三个分阶段。
其中中期时细胞染色体粘附到纺锤体纤维上并完成分离，后期时新核膜形成，染色体解缠并核质分划，两个新的细胞膜形成。
在细胞周期分析中，可以通过多种方法染色来区分不同时期的细胞。
例如，DNA染色剂如荧光素-二乙酸盐（PI）染色，可以区分G1期、S期和G2期细胞；利用蛋白质抗体标记技术可以检测细胞的分裂状态，还可以用流式细胞术探测特定分子（如细胞周期蛋白等）的表达量来分析细胞周期进程。
通过不同的染色方式，我们可以精准地区分不同的细胞周期阶段，实现对细胞周期的深入研究。
细胞周期研究的应用范围非常广泛。
在肿瘤学领域，流式细胞术被广泛应用于分析肿瘤细胞的分裂、生长特性和药物处理后的变化。
通过对细胞周期阶段特异性化合物的筛选，可以发现对某些恶性肿瘤的治疗非常有效的药物。
流式检测细胞周期的原理
一．细胞周期的检测1、原理：细胞在有丝分裂的过程中DNA会加倍。
（n----2n）2、我们使用PI来标记DNA。
PI的通到是FL23、荧光信号的表示方法，有荧光的宽度（W），荧光的高度（H），和荧光信号的积分面积（A）.我们使用荧光的积分面积（A）来检测细胞周期的变化.因为，即使DNA的含量相同的两个细胞，如果细胞的形状差异较大，荧光信号的高度是不相等的。
但是积分面积一定相等。
4.接下来我以二倍体细胞为例降解，流式检测细胞周期的过程。
首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞（G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的细胞又有G1期，S期,G2期和M期。
我们来分析下各个时期DNA含量的变化。
G0期DNA数目为n.G1期细胞主要进行RNA和蛋白的合成, DNA数目为n.S期DNA开始复制，直到复制结束进入M期，DNA数目从n变为2n.G2期主要是RNA和蛋白的合成,为M期做准备 DNA数目为2nM期细胞分裂的过程，直到M结束细胞一分为二，DNA数目也是2n.从DNA的数目上，我们可以将细胞周期分为G0/G1期，s期，G2/M期.我们利用荧光强度的积分面积来检测，利用直方图来表示，如果G0/G1期处于50的位置，那么G2/M期处于100的位置。
期间的为S期。
4、但是有个问题值得我们注意。
我们的样本很容易聚集有时候两个G1期的细胞会聚集在一起形成粘连体，通过激光照射区时，其荧光强度会和G2期的相同，这就需要排除粘连体。
我们BD公司的专利技术可以使粘连体通过检测区的荧光宽度比G2期的长。
我们利用W对A的散点图分析，如果G0/G1期在50的位置，那么G2/M期在100的位置，其他的位置为粘连体和一些不符合检测的细胞及碎片等。
我们通过画门来得到我们需要检测的细胞。
5、因此我们需要三个图就可以检测到我们的细胞周期变化情况，第一个散点图，通过前向和侧向的变化，区分出我们要检测的细胞群。
第二个散点图我们出去粘连体。
第三个直方图得到我们的细胞周期变化。
细胞周期的流式检测方法
细胞周期的流式检测方法细胞周期（cell cycle ）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为G0/G1 期、S 期、G2/M 期。
在科研实践中，很多实验具有对细胞群体的周期分布进行检测的需求。
细胞群体周期测定的方法有很多种，最常用的是PI（碘化丙啶）渗入DNA 进行染色，然后通过流式细胞仪检测PI 从而测定细胞群体的周期分布。
因此，下面笔者主要通过BD（Becton＆Dickinson ）公司生产的BD FACSCalibur 流式细胞仪测定PI 标记的细胞群体为例，对细胞周期的流式检测方法进行阐述。
一、PI 染色步骤概略1、单细胞悬液离心，1500rpm , 5min ，弃上清。
2、PBS 1ml 离心，弃上清。
3、70%酒精2ml，4℃，30min，离心，弃上清液。
4、PBS 1ml 离心，弃上清。
5、RNase A 的PBS 溶液(20ug/ml) ，500ul，37℃，30min，离心弃上清。
6、PBS 1ml 离心，弃上清。
7、PI 的PBS 溶液(50ug/ml) ，500ul，室温避光孵育30min。
8、吹打混匀，300 目筛网过滤至流式管中，4℃保存，待测。
二、Calibur 仪器设置及数据收集1、依次打开Calibur 机器电源、电脑开关和CellQuest Pro 软件，按快捷键Command+B 连机，按快捷键Command+1 、2、3、4 调出Detectors/Amps 面板、Threshold 面板、Compensation面板和Status面板，软件的操作界面如图 1 所示。
图1. Cell Quest Pro 软件操作界面2、建立实验模板，包括FSC/SSC 散点图、FL2-W/FL2-A 散点图和FL2-A 直方图。
因为PI在Calibur 上是由488nm 的激光器激发，530/30 滤光片收集信号，所以选择FL2 通道进行检测。
细胞周期是2N 和4N 的循环，所以FL2 通道的Mode 参数应设置为Lin 模式，同时阈值（Threshold）的Primary Param 参数设置为FL2-H ，Four Color DDM Param 参数设置为FL2，如图2、图 3 所示。
流式细胞仪检测细胞周期原理和方法
流式细胞仪检测细胞周期原理和方法流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种现代生物学实验技术，主要用于检测和分析细胞的形态、结构、功能及其分子水平的变化。
它通过利用激光传感器探测透过细胞的激光散射或荧光信号，同时可以通过细胞的大小、荧光强度和荧光波长的变化将细胞分为不同的亚群。
流式细胞仪的使用已经广泛应用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学、生殖医学等领域。
流式细胞仪检测细胞周期的原理主要基于细胞的DNA含量不同于不同细胞周期阶段。
细胞周期通常分为G1期（细胞生长期）、S期（DNA复制期）、G2期（前期）、M期（有丝分裂期）和G0期（休止期）。
在细胞周期中，细胞会通过分子调控机制从一个阶段进入到下一个阶段。
细胞在G1期，其DNA含量为单倍体（2N）。
G1/S转变时，细胞准备开始进入DNA复制期（S期），在S期中，细胞的DNA含量翻倍，达到二倍体（4N）。
接下来，细胞进入G2期，准备进入有丝分裂期（M期），在M期，细胞的DNA含量达到四倍体（8N），细胞核开始分裂。
而G0期，则代表细胞处于休眠或未分裂状态，DNA含量不变（通常是2N）。
1.细胞样本制备：首先需要制备良好的单细胞悬浮液，通常通过细胞消化酶处理细胞集落或组织样本，将细胞分散为单细胞。
同时，还要对细胞进行化学固定或冷冻处理，以保持其形态和结构的完整性。
2.细胞染色：将细胞进行荧光染色或抗体标记。
如果使用荧光染料，可以直接将染料加入到细胞悬浮液中，使其与DNA结合。
如果使用抗体标记，先将抗体与细胞混合，然后再加入荧光二抗进行染色。
3.流式细胞仪检测：将样品注入流式细胞仪仪器中。
细胞悬浮液在仪器中通过微细管道流动，激光通过细胞悬液时，细胞会散射激光，形成散射信号。
同时，荧光标记的细胞也会发出荧光信号。
4.数据分析：通过流式细胞仪仪器，可以获取每个单个细胞的散射与荧光信号。
利用仪器中的分析软件，可以对细胞的散射与荧光信号进行分析和计数。
根据荧光信号强度，可以对细胞进行不同周期阶段的区分和计数。
细胞周期检测点的流式细胞术分析
细胞周期检测点的流式细胞术分析一、概述细胞周期检测点的流式细胞术分析是一种先进的生物学研究方法，它结合了流式细胞术的高通量、高精度特点与细胞周期检测点的关键生物学意义，为研究者提供了深入理解细胞生长、增殖和分化过程的强大工具。
细胞周期是指细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的全过程，包括DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）以及细胞分裂期（M期）。
在每个周期阶段，细胞都会进行特定的生理活动，如DNA复制、蛋白质合成等。
而检测点则是细胞周期中确保各个阶段顺利进行的关键环节，它们能够监测并应对各种可能影响细胞周期进程的内外因素。
流式细胞术是一种可以对细胞进行快速、定量分析和分选的技术。
通过利用不同荧光物质标记的单克隆抗体，流式细胞术能够检测细胞周期中各个阶段的特异性标志物，从而实现对细胞周期的精确分析。
流式细胞术还具有高通量、高灵敏度和高准确性的优点，能够在短时间内处理大量样本，并获取丰富的数据信息。
细胞周期检测点的流式细胞术分析在多个领域具有广泛的应用价值。
在基础研究中，它可以帮助我们深入了解细胞周期的调控机制以及检测点在细胞周期中的作用在临床医学中，它可以用于诊断肿瘤、评估治疗效果以及预测疾病进展等在药物研发中，它可以作为筛选具有细胞周期特异性作用的药物的重要手段。
细胞周期检测点的流式细胞术分析是一种强大的生物学研究方法，它将为我们揭示细胞周期的奥秘提供有力的技术支持。
1. 细胞周期检测点的重要性细胞周期是生物体细胞生长、分裂和繁殖的基础过程，它确保了遗传信息的准确传递和细胞功能的正常维持。
在这个过程中，细胞周期检测点扮演着至关重要的角色。
检测点是细胞周期中的特定阶段，它们能够监测细胞内的各种条件和状态，确保只有在满足特定条件时，细胞才能继续其周期进程。
细胞周期检测点对于维护基因组稳定性至关重要。
在DNA复制和染色体分离的过程中，任何错误都可能导致基因突变或染色体异常，进而影响细胞的正常功能。
流式检测细胞周期要点
流式检测细胞周期要点：最关键的就是减少细胞碎片和单细胞悬液的制备！1、细胞消化要理想，资料显示最好消化时加EDTA，可使流式做的很漂亮；2、细胞消化后不可吹打过度，减少细胞破碎；以后的吹打也要注意，尤其是固定后的细胞容易破碎；3、细胞用PBS洗涤离心，转速不超过1000r/min，有文献用800r/min；可考虑在此过程中用300目的尼龙网过滤一遍细胞（有人主张用钢网，以减少细胞与尼龙网粘连的损失，本人认为钢网易损伤细胞，DNA外溢也会造成细胞粘连，所以在细胞数足够的情况下，首选尼龙网）；4、离心后的固定，标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精，而不是向细胞中加酒精，这样是为了减少细胞聚集，这一点很重要，很多人都忽视了！5、一般选择4℃固定过夜；6、加染液前的洗涤仍要注意离心转速的问题；7、关于PI染液的组成及配方，应主要以文献为主，PI（作用为DNA染色剂）的浓度从0.5μg/ml,20μg/ml，到50μg/ml都见报道，响应的求助显示都可出良好结果，RNAs酶（由于PI也可染RNA，故要去除RNA）一般浓度为50μg/ml，配方中的Triton-X-100（曲拉通）主要是通透细胞膜使PI能进入细胞核。
8、检测时细胞要达到1～2×106个细胞（实际检测是1万到2万个细胞），为了既保持初始条件相同，又可搜集到足够的细胞，应选用多孔培养板，在搜集细胞时，浓度大、抑制强的组可多搜集些孔，以保证检测的细胞数量。
如果细胞数量太低，技师为了减少对流式细胞仪的损伤，就会选择高速流（一般的检测用低速流，误差小），检测的质量就会大大下降，数据的说服力就下降了！1.收集细胞；2.3000～5000rpm离心5min，收集沉淀，重悬于200ul的PBS中，再次离心收集沉淀；3.75％冰冻乙醇（-20度保存）4度固定过夜or-20度固定1h；4.离心收集沉淀，PBS洗一次（视沉淀量可忽略）；5.沉淀重悬于200～500ul的PBS，加入Rnase A 37度水浴1h；6.400目纱布过滤至流式管，加入PI染色，4度避光30min-1h，上机器。
流式细胞术检测细胞周期的技术流程
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流式细胞仪检测细胞周期操作技巧步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。
↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析——Flowjo软件分析图片拷贝：直接Ctrl+CFCM-DNA量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S、G2M。
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流式检测细胞周期要点：最关键的就是减少细胞碎片和单细胞悬液的制备！1、细胞消化要理想，资料显示最好消化时加EDTA，可使流式做的很漂亮；2、细胞消化后不可吹打过度，减少细胞破碎；以后的吹打也要注意，尤其是固定后的细胞容易破碎；3、细胞用PBS洗涤离心，转速不超过1000r/min，有文献用800r/min；可考虑在此过程中用300目的尼龙网过滤一遍细胞（有人主张用钢网，以减少细胞与尼龙网粘连的损失，本人认为钢网易损伤细胞，DNA外溢也会造成细胞粘连，所以在细胞数足够的情况下，首选尼龙网）；4、离心后的固定，标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精，而不是向细胞中加酒精，这样是为了减少细胞聚集，这一点很重要，很多人都忽视了！5、一般选择4℃固定过夜；6、加染液前的洗涤仍要注意离心转速的问题；7、关于PI染液的组成及配方，应主要以文献为主，PI（作用为DNA染色剂）的浓度从0.5μg/ml,20μg/ml，到50μg/ml都见报道，响应的求助显示都可出良好结果，RNAs酶（由于PI也可染RNA，故要去除RNA）一般浓度为50μg/ml，配方中的Triton-X-100（曲拉通）主要是通透细胞膜使PI能进入细胞核。
8、检测时细胞要达到1～2×106个细胞（实际检测是1万到2万个细胞），为了既保持初始条件相同，又可搜集到足够的细胞，应选用多孔培养板，在搜集细胞时，浓度大、抑制强的组可多搜集些孔，以保证检测的细胞数量。
如果细胞数量太低，技师为了减少对流式细胞仪的损伤，就会选择高速流（一般的检测用低速流，误差小），检测的质量就会大大下降，数据的说服力就下降了！1.收集细胞；2.3000～5000rpm离心5min，收集沉淀，重悬于200ul的PBS中，再次离心收集沉淀；3.75％冰冻乙醇（-20度保存）4度固定过夜or-20度固定1h；4.离心收集沉淀，PBS洗一次（视沉淀量可忽略）；5.沉淀重悬于200～500ul的PBS，加入Rnase A 37度水浴1h；6.400目纱布过滤至流式管，加入PI染色，4度避光30min-1h，上机器。
1、Q：要做胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？A：我做过乳腺细胞的DNA含量测定，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。
我就是这样做的，保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%.2、实验中想用PI分析细胞周期及凋亡率，请教几个问题：Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。
Q：（2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的，不用担心。
Q：（3）Triton－x－100是固定剂吧，用了70％的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton－x －100固定了？A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75％的乙醇于-20度固定。
Q：（4）还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？A：对照肯定是需要的，这个根据自己的需要进行设置。
Q：（5）不用试剂盒行不行啊？A：完全可以不用试剂盒。
以下提供一个自己的实验步骤供参考：（1）200×g离心10min收集细胞；（2）弃去上清，PBS漂洗一次，将细胞重悬于预冷的80%乙醇中，-20°C固定24h以上；（3）进行流式细胞仪检测前，200×g离心10min收集固定后的细胞；（4）PBS洗涤一次，200×g离心10min收集细胞；（5）将细胞重悬于含100ug/ml RNase A和50ug/ml PI的PBS中，室温孵育30min；（6）将经PI染色和RNase A消化后的细胞悬液用300目的尼龙膜过滤后即可利用流式细胞仪进行细胞周期分布和凋亡细胞定量的分析。
3、Q：流式检测细胞周期时加RNA酶所需的温度？A：其实有关RNA酶在凋亡检测制样过程中使用的必要性问题尚有人持不同意见，该观点的人认为RNA酶在环境中无所不在，常规制样过程中所接触的试剂和环境中的RNA酶已足以降解样品中的RNA，所以为了简便实验操作，也有人不加RNA酶或如你所参考的方法将其与PI染液一起使用。
不过经典的方法还是“先加RNA酶37度孵育30min，然后加PI 4度孵育30min”。
至于染色时使用4度，是因为低温可减弱分子运动，增强荧光染料结合的稳定性和减少可能的荧光损耗。
上流式前细胞用75％乙醇固定行吗？4、Q：我养肿瘤细胞，测周期。
看到帖子说70％乙醇必须用PBS和乙醇配，用水配细胞会碎裂，有帖子说PBS和乙醇配会出现絮状物。
上流式前细胞用75％乙醇固定，就用买来的现成的瓶装75％乙醇，行吗？必须那么严格吗？A：先用冷PBS悬浮细胞，大约1-2ml，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。
之后缓慢加入无水乙醇，终浓度为70-75%乙醇。
不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。
乙醇固定之后没有细胞沉淀。
5、Q：我要做流式分析细胞周期，我大概收集了10的6次方细胞，但细胞在乙醇固定之后，还看到有细胞沉淀的，但PBS洗涤两次之后，就基本没什么细胞沉淀了，上机发现就发现不了细胞了。
这是怎么回事啊？怎么解决这个问题啊？A：很可能是洗细胞的过程中丢失了，解决办法有：（1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机（2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留1mm左右的水膜，不要吸完。
（3）离心的转速或时间可稍微增加一点儿（4）每次加抗体时，吸头最好不要接触液面；混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。
6、Q：流式细胞PI单染中为什么用RNAse？A：在测细胞周期时，因为已经在细胞膜打孔了，PI很容易透过细胞膜和DNA结合，但RNA也是核酸，也会被染色，为避免干扰染色前需用RNAse降解RNA。
这样PI只染DNA，能精确以荧光强度反映DNA的含量。
7、最近做了几次流式细胞仪检测细胞周期，发现有几个问题：Q：（1）我所用的是肿瘤细胞，但是同样的细胞类型，同样的处理因素，虽然两次独立实验作出来的结果总体趋势都是在某种药物干预后，S期比例下降，但两次结果S期比列具体数值相差很大，同样，G2/M期在干预前后无变化，但两次独立实验数值却相差很大，那么可以说，做流式是每次细胞状态不一样，结果也会相差很大，是不是细胞密度会对结果产生很大影响，那么如果细胞密度在60-70%时和细胞已经长满（90%以上）也会导致各期数值的差异？如果是这样，长满的细胞（不再增殖）是表现的G1或S 或G2/M上升还是下降？A：应该是两批细胞在实验时本身所出周期不同所致，可以在实验前进行细胞的同步化处理，减少批间差异。
实验细胞应处于对数生长期，而不能是完全长满，一般在50～80％比较好。
自然状态下，不增殖的细胞应该处于G0/G1期。
Q：（2）其次就是结果分析，细胞周期特异性药物如抗代谢药作用后主要表现的是S期比例下降，细胞被阻滞在G1期，自然G1期比列升高。
而有些植物药如长春碱类或紫杉醇类，主要作用于M期，那么结果是否表现为G2期比例升高，还是S期也相应升高？还有就是细胞经抗肿瘤药物作用后反而出现的S期升高，可能是那些原因，如何分析？A：周期特异性药物阻滞哪一期，哪一期就升高，不会使其它阶段细胞增多。
8、Q：我用流式做胃癌细胞周期分析时不出现S、G2/M峰？什么原因呢？自己分析可能为PI没染上色，是不是染色时间太短呢？A：你用了多少PI染色多久呢？一般来说30分钟够了.我觉得可能是打孔或者rna没有处理掉没有成功，染色时间并不是关键。
9、Q：做流式细胞时，PI 染色，PI的浓度应该是多少?还有就是400目的筛网是什么？不用可以吗？谢谢。
A：100ug/ml，一般用400目的筛网是用来将粘在一起的细胞团滤掉的，否则会出现人为的多倍体干扰，分析的时候需要的是单个的细胞，不过如果经验丰富也可以gate掉的。
如果你没有条件，建议在染色之前将细胞弹的很散，再进行染色10、Q：流式细胞仪观察细胞周期样品怎样准备？A：给你介绍一下我的实验方法，我做的是周期检测，要做平行样，六孔板做的。
（1）收集先弃液，将你要实验（你已经处理好的）的细胞PBS洗两次，加胰酶消化（注意：如果要是加药物或者其他处理过的细胞，弃液和PBS洗液均收集）；（2）加培养基终止消化，打匀在分别收到各自离心管中（注意，收集过程中及后续过程中枪头不要混用，要不平行样也就没意思了）；（3）离心，1000rpm，5min弃液；（4）4度PBS（1到2ml）洗两次，离心，1000rpm，5min弃液；（5）加入负20度70%酒精（1到2ml）打匀，固定，至少半个小时以上，（不做的话，可放入4度冰箱保存2-3周问题不大）；（6）离心，1000rpm，5min弃酒精；（7）4度PBS（1到2ml）洗，离心1000rpm，5min弃液；（8）4度PBS（1到2ml）洗，打匀后，将细胞悬液用100 目的纱布直接过滤到流式检测管中；（9）离心，1000rpm，5min弃液；（10）加PI染液染色（浓度为50ug/ml），PBS32.4ml ，PI 2.5mg，Rnase 0.5mg，（Triton-X-100 0.25ml，枸橼酸钠50mg，这两我没加也效果不错）加PBS至50ml，4度避光保存数月。
106细胞中加入1ml PI染液，振荡器振匀，避光染色至少30 min，上机检测；（11）统计分析。