第三章 生物制药的基本技术

C、超声波处理法 多用于微生物材料，处理的效果与 超声波处理法：多用于微生物材料 超声波处理法 多用于微生物材料， 样品浓度、 样品浓度、使用频率有 关。用大肠杆菌制备各种酶 菌体浓度， 时，常用50~100mg/L菌体浓度，在1~10KC频率下 常用 菌体浓度 频率下 处理10~15min。操作时注意避免溶液中气泡的存在。 。操作时注意避免溶液中气泡的存在。 处理 D、加压破碎法：加气压或水压，达0.59~34.32MPa 、加压破碎法：加气压或水压， (210~350kgf/cm2)的压力时， 可使 的压力时， 可使90%以上细胞被 的压力时 以上细胞被 压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。 压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。
1、标准化方法？ 、标准化方法？ 2、如何发现或研制新药？ 、如何发现或研制新药？
对于一个新研制的生物药物，从查阅文献开始， 对于一个新研制的生物药物，从查阅文献开始，到探索实 验、条件考察（记录客观）、总结制定工艺规程、制定分析鉴 条件考察（记录客观）、总结制定工艺规程、 ）、总结制定工艺规程 定方法，再进行中试放大，全面考察工艺是否成熟， 定方法，再进行中试放大，全面考察工艺是否成熟，是否稳定 等。
3.
生化及化学法： 生化及化学法
自溶法：将新鲜的生物材料存放在一定的pH pH和 A. 自溶法：将新鲜的生物材料存放在一定的pH和 适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破 适当温度下， 坏，使细胞内含物释放出来的方法。自溶的温度， 使细胞内含物释放出来的方法。自溶的温度， 动物材料在0-4℃ ，微生物在室温下。自溶时，需 微生物在室温下。自溶时， 动物材料在0 加少量的防腐剂，甲苯、氯仿， 加少量的防腐剂，甲苯、氯仿，以防止外界细菌的 污染。 研钵、球磨机、万能粉碎机、 1.机械法：组织捣碎机、匀浆器、研钵、球磨机、万能粉碎机、 机械法 组织捣碎机、 绞肉机、击碎机、刨片机。 绞肉机、击碎机、刨片机。 动物组织多在冰冻状态绞碎、溶浆。 动物组织多在冰冻状态绞碎、溶浆。 2.物理法 2.物理法 把待破碎的样品冷至A、反复冻融法：把待破碎的样品冷至-20℃-15℃ ，使 反复冻融法 把待破碎的样品冷至 20℃ 15℃ 之凝固，然后缓慢的溶解，如此反复操作， 之凝固，然后缓慢的溶解，如此反复操作，大部分动物性 细胞及细胞内的颗粒可以破碎。 细胞及细胞内的颗粒可以破碎。 B、冷热交替法：将材料投入沸水中，在90℃左右维持数 冷热交替法：将材料投入沸水中， 90℃ 分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却， 分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部分细胞 被破坏。此法多用于细菌或病毒中提取蛋白和核酸。 被破坏。此法多用于细菌或病毒中提取蛋白和核酸。
由于自溶时间较长，不易控制， 由于自溶时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸和蛋白质
时比较少用。 时比较少用。
B. 溶菌酶处理法：溶菌酶是专一地破坏细菌细胞壁的酶。 溶菌酶处理法：溶菌酶是专一地破坏细菌细胞壁的酶。 多用于微生物，如蜗牛酶、纤维酶， 植物细胞也适用。 多用于微生物，如蜗牛酶、纤维酶， 植物细胞也适用。如 用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造DNA时，采用pH8.0的 时 采用 用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造 的 0.1mol/L Tris-0.01mol/L EDTA 制成 2 亿/ml的细胞悬液， 的细胞悬液， 的细胞悬液 的溶菌酶， 保温10min， 然后加 入100µg~1mg的溶菌酶，在37 °C保温 的溶菌酶 保温 ， 细菌胞壁即被破坏。 细菌胞壁即被破坏。 C. 表面活性剂处理法：表面活性剂的分子中，兼有亲脂 表面活性剂处理法：表面活性剂的分子中， 性和亲水性基团，能降低水的界面张力，具有乳化、分散、 性和亲水性基团，能降低水的界面张力，具有乳化、分散、 增溶作用。常用有： 增溶作用。常用有：SDS、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸 、氯化十二烷基吡啶、 钠。
第三章 生物制药基本技术
3.生化制药的六个阶段 生化制药的六个阶段 1. 原料的选择和预处理 2. 原料的粉碎 3. 提取：从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工 提取：从原料中经溶剂分离有效成分， 艺过程。 艺过程。 4. 纯化：粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、 纯化：粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、 透析、 膜分离、 透析、超离心 、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺 过程。 过程。 5. 浓缩、干燥及保存 浓缩、 6. 制剂：原料药（精制品）经精细加工制成片剂、针 制剂：原料药（精制品）经精细加工制成片剂、 冻干剂、粉剂等供临床应用的各种剂型。 剂、冻干剂、粉剂等供临床应用的各种剂型。
第三章 生物制药的基本技术
Chapter 3 Basic Technique For Biopharmacon
第三章 生物制药基本技术 生物制药是把生物体内的具有生物活性的基本物质， 生物制药是把生物体内的具有生物活性的基本物质， 是把生物体内的具有生物活性的基本物质 保持原来的结构和功能，又能在含有多种物质的液相 保持原来的结构和功能，又能在含有多种物质的液相 或固相中较高纯度的分离出来。它是一项严格、细致、 或固相中较高纯度的分离出来。它是一项严格、细致、 的分离出来 复杂的工艺过程，涉及物理、化学、生物学、 复杂的工艺过程，涉及物理、化学、生物学、工程等 方面的知识和操作技术。 方面的知识和操作技术。 中心的问题 1. 中心的问题：
预处理方法： 预处理方法 1、动物组织先要剔除结缔组织、脂肪组织等非活性部分； 动物组织先要剔除结缔组织、脂肪组织等非活性部分； 植物种子去壳除脂；微生物要进行菌体与发酵液分离等 植物种子去壳除脂； 基本操作。便于贮存和运输。 基本操作。便于贮存和运输。 2、冷冻法预处理：有些材料要冷冻保存或低温保存，以便 冷冻法预处理：有些材料要冷冻保存或低温保存， 抑制微生物和酶的作用。 抑制微生物和酶的作用。 3、有机溶剂除去部分水分：用丙酮或乙醇进行脱水和脱脂， 有机溶剂除去部分水分：用丙酮或乙醇进行脱水和脱脂， 有利于贮存。 有利于贮存。
℃
四、分离纯化Separation and Purification 分离纯化 1、盐析法 利用不同的蛋白质在高浓度盐溶液中， 利用不同的蛋白质在高浓度盐溶液中，溶解度不同程度 的降低来进行分离纯化。在低盐浓度下， 的降低来进行分离纯化。在低盐浓度下，溶解度随着盐浓 度升高而增加，称盐溶作用；当盐浓度不断升高时， 度升高而增加，称盐溶作用；当盐浓度不断升高时，不同 蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出沉淀， 蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出沉淀，称盐 析作用。 析作用。 优点：设备和条件要求低，安全应用范围广泛。 优点：设备和条件要求低，安全应用范围广泛。在高盐情况 下，蛋白质不易发生变化，一般在室温下操作。 蛋白质不易发生变化，一般在室温下操作。 缺点：分级分离能力不高。 缺点：分级分离能力不高。 常用的中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠 常用的中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠。
一. Raw Material Selecting and Pretreatment 原料选择和预处理 原料选择和预处理 原料选择的基本准则： 原料选择的基本准则： 1、在大量的信息资料和实践经验的基础上，选择目标原料。 、在大量的信息资料和实践经验的基础上，选择目标原料。 2、选择有效成分含量高的新鲜材料； 、选择有效成分含量高的新鲜材料； 3、来源丰富易得； 、来源丰富易得； 4、制造工艺简单易行； 、制造工艺简单易行； 5、成本比较低； 、成本比较低； 6、原料的采集不破坏生态环境, 选择对环境友好的原材料资 、原料的采集不破坏生态环境 源，防止生物入侵。 防止生物入侵。
三、提 取 Extraction 提取：也称抽提、萃取， 提取：也称抽提、萃取，就是利用一种溶剂对物质的不同溶 解度，从化合物中分离出一种或几种组分的过程。 解度，从化合物中分离出一种或几种组分的过程。分为固 体处理（ 体处理（液—固萃取）和液体处理（液—液萃取）。 固萃取）和液体处理（ 液萃取）。 提取条件的选择： 提取条件的选择： 1、溶剂:常用水、稀盐、稀酸、稀碱，有机溶剂如乙醇、 溶剂:常用水、稀盐、稀酸、稀碱，有机溶剂如乙醇、 丙酮、氯仿、四氯化碳、丁醇等。丁醇提取的pH、 丙酮、氯仿、四氯化碳、丁醇等。丁醇提取的pH、温度范 pH 围较广（pH340℃）。适用于动植物和微生物原 围较广（pH3-6, -2-40℃）。适用于动植物和微生物原 料。 与溶解度和稳定性有很大关系， 2、pH : 与溶解度和稳定性有很大关系，一般选择在 的两侧。 pI 的两侧。
二、原料的粉碎Comminution of Raw Material 原料的粉碎：在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适度的 原料的粉碎 在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适度的 粒度，或将细胞破碎，使胞内活性物质充分释放到溶液中， 粒度，或将细胞破碎，使胞内活性物质充分释放到溶液中， 有利于提取或吸附。 有利于提取或吸附。 动物脏器组织：常用绞肉机机械法粉碎； 动物脏器组织：常用绞肉机机械法粉碎； 植物肉质组织：常用磨碎法； 植物肉质组织：常用磨碎法； 微生物：常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声、 微生物：常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声、加压等 处理方法。 处理方法。
第三章 生物制药基本技术
2. 基本制造方法 1、提取法(Extraction) 2、发酵法（ Zymotechnics） 3、化学合成（Chemical synthesize） 4、组织培养法（Tissue culture 4 Tissue culture） 5、现代生物技术(Modern Biotechnics): Gene engineering, Enzyme engineering, Cell engineering , protein Engineering, Fermentation engineering
3、温度：一般在5 温度：一般在5
以下，但对温度耐受力较大的药物， ℃ 以下，但对温度耐受力较大的药物，可 提
适当的提高温度，使杂蛋白变性分离，有利于提取和纯化。 适当的提高温度，使杂蛋白变性分离，有利于提取和纯化。 如胃蛋白酶、酵母醇脱氢酶及多肽激素类，选择37-50 如胃蛋白酶、酵母醇脱氢酶及多肽激素类，选择3737 取，效果较好。 效果较好。 影响提取的因素： 影响提取的因素： 1、被提取物质溶解度的大小：一般极性对极性；非极性 被提取物质溶解度的大小：一般极性对极性； 对非极性；酸对碱；碱对酸；高温；远离等电点。 对非极性；酸对碱；碱对酸；高温；远离等电点。 2、扩散作用的影响：扩散方程式 G=DF*ΔC/ΔX*t 扩散作用的影响： 3、分配作用的影响：分配定律 分配作用的影响： (C1/C2)恒温、恒压=K (C1/C2)恒温、恒压=K 恒温
盐析时应注意的几个问题： 盐析时应注意的几个问题： （1）盐饱和度：由于蛋白质的结构和性质不同，盐析 盐饱和度：由于蛋白质的结构和性质不同， 要求的饱和度也不同。要按工艺要求，正确计算饱和度。 要求的饱和度也不同。要按工艺要求，正确计算饱和度。 值的选择：蛋白质在pI时的溶解度最小。因此， pI时的溶解度最小 （2）pH 值的选择：蛋白质在pI时的溶解度最小。因此， 进行盐析时的pH，要选择在被分离蛋白质的pI 附近。 进行盐析时的pH，要选择在被分离蛋白质的pI 附近。 pH （3）蛋白质浓度：在相同条件下，蛋白质浓度越大越 蛋白质浓度：在相同条件下， 易沉淀，使用盐的饱和度极限也愈低。蛋白质浓度愈高， 易沉淀，使用盐的饱和度极限也愈低。蛋白质浓度愈高， 其他蛋白质共沉作用也愈强，这是不希望的。 其他蛋白质共沉作用也愈强，这是不希望的。选择适当的 蛋白质浓度，可避免共沉的干扰。 蛋白质浓度，可避免共沉的干扰。