小鼠实验胚胎技术

小鼠实验胚胎技术的应用 ----转基因动物模型的制作
转基因动物:
转基因动物(transgenic animal) 是指以实验手段导入的外源基因在其 基因组内稳定整合并能遗传给后代的 一类动物。
转基因动物模型:
转基因动物模型(transgenic animal model)是指利用转基因动物 制作手段导入的人类疾病基因在其基 因组稳定整合、遗传并表达产生类似 于人类疾病的一类动物。
核移植法特点：
• 优点：可以进行基因定点的敲除和导入
后段工作相对简单
• 缺点：技术难度大
需要昂贵仪器
感谢：
感谢陈系古教授和马芸老师提 供部分的图片!!
Thanks！ 谢谢!
一、聚合法wenku.baidu.com
1. 胚胎-胚胎：两个8细胞期~桑椹期的胚 胎去透明带后，在植物血凝素的作用下， 互相粘附融合在一起重新形成一个胚胎， 移植后发育成一个个体。
2. 胚胎-胚胎干细胞：一个8细胞期~桑椹
期的胚胎和多个胚胎干细胞在植物血凝 素的作用下，形成一个融合胚胎，移植 后发育成一个个体。
聚合法的特点：不需要昂贵仪器，但成 功率低。
显微注射仪、拉针仪、煅针仪
胚胎感染法：
将外源基因连接上逆转录病毒载体， 再让逆转录病毒载体感染着床前后的胚 胎，外源基因随机整合入受体基因组。
胚胎感染法流程图
目的基因克隆、纯化、逆转录病毒载体的构建
体外感染着床前胚胎 （共孵育或显微注射）
胚胎移植 产生个体
体内感染着床前、后胚胎 （输卵管或子宫内注射）
胚胎干细胞法特点：
• 优点：可以进行基因定点的敲除和导入 • 缺点：环节多、过程复杂
需要昂贵仪器
核移植法：
将外源基因转染胚胎干细胞或体细 胞，带有外源基因的细胞作为核供体， 通过核移植技术产生带有外源基因的转 基因个体。
核移植法流程图
目的基因克隆、纯化 胚胎干细胞或体细胞转染 阳性细胞筛选 阳性细胞提供核，进行去核卵母细胞核移植 胚胎体外培养至双细胞期 胚胎体内移植 产生克隆阳性个体 阳性个体的培育和建群
雄原核注射法流程图
目的基因克隆、纯化 显微注射至受精卵雄原核 受精卵DNA复制，外源基因整合 双细胞期胚胎假母体内移植 产生个体 外源基因阳性个体筛选 阳性个体的培育和建群
雄原核注射法特点：
• 优点：相对简单、成功率高
不需要构建特殊的载体 单纯的外源基因DNA片段 成功率可达5%～25%
• 缺点：需要昂贵的仪器设备
卵子 体外受精或单精子注射
受精卵DNA复制，外源基因整合
双细胞期胚胎假母体内移植 产生个体 外源基因阳性个体筛选 阳性个体的培育和建群
精子载体法
精体载体法特点：
• 优点：简单
不需要构建特殊的载体 单纯的外源基因DNA片段
• 缺点：成功率低
雄原核注射法：
通过显微注射的方法将外源基因 注射入受精卵的雄原核区；在受精卵 DNA复制过程中外源基因随机整合入 受体基因组。
LIM1基因敲除无脑小鼠
震颤小鼠与多发性硬化
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转基因动物、基因敲除动物制作方法和原理
克隆目的基因 构建载体
精子 载体法
雄原核 注射法
胚胎 感染法
曲细精管 注射法
胚胎 干细胞法
核移植 法
目的基因随机整合入动物个体基因组 构建的载体通过同源重组方式 整合入动物个体基因组的特定位点 目的基因转录、翻译
筛选阳性嵌合体
嵌合体之间交配
外源基因阳性纯合个体产生、筛选
外源基因阳性个体的培育和建群
胚胎感染法特点：
• 优点：感染率高
• 缺点：相对复杂
存在生物安全性问题 形成嵌合体 后期工作量大
曲细精管注射法：
将外源基因注射入雄性动物的曲细精 管内，在精原细胞分裂过程中外源基因随 机整合入受体基因组，再通过精卵受精产 生带有外源基因的个体。
小鼠实验胚胎技术与应用
眼科学实验动物中心 黄冰
提纲
一、小鼠实验胚胎技术
1、母鼠超数排卵 2、胚胎收集 3、胚胎体外培养 4、假母制备 5、胚胎体内移植
二、应用:转基因动物模型的制作
1、定义 2、制作方法和原理
小鼠实验胚胎技术
• 超数排卵：给予发情间期的母鼠一定量的
促进卵泡成熟和卵子排放的激素，母鼠可 以同时段排放比正常排卵数多一倍以上的 成熟卵子。
曲细精管注射法流程图
目的基因克隆、纯化 逆转录病毒载体的构建 雄性个体曲细精管注射 外源基因随机整合入雄性生殖细胞 雌、雄动物自然交配 产生个体 外源基因阳性个体筛选 阳性个体的培育和建群
曲细精管注射法特点：
• 优点：相对简单
不需要昂贵仪器
• 缺点：成功率较低
胚胎干细胞法：
将外源基因转染胚胎干细胞，再通 过嵌合体技术或核移植技术产生带有外 源基因的胚胎干细胞来源的转基因个体。
产生蛋白和表现功能 转基因动物
靶基因被删除或灭活
靶基因不能转录、翻译，不能产 生蛋白和表现功能 基因敲除动物
精体载体法：
将外源基因附着在精子上，通过体 外受精或单精子注射法将外源基因导入 受精卵；在受精卵DNA复制过程中外源 基因随机整合入受体基因组。
精体载体法流程图
目的基因克隆、纯化
与精子共孵育
PMSG（孕马血清促性腺激素）：促进卵泡 成熟。 HCG（人绒毛膜促性腺激素）：促进卵泡成 熟和卵子排放。
• 假母：性成熟的母鼠在与结扎公鼠交配后，
子宫内膜会处于增殖和接受胚胎着床的生 理状态。一旦有胚胎进入子宫腔内，胚胎 便可以在其子宫内着床发育成个体。 鼠类动物、兔子有此特性，其他动物 需借助激素。
二、显微注射法
1. 成体细胞：将成体细胞显微注射入囊胚期胚胎
囊腔，移植后发育成一个个体。 2. 胚胎干细胞：将胚胎干细胞显微注射入囊胚期 胚胎囊腔，移植后发育成一个个体。 显微注射法的特点：需昂贵仪器，但成功率高。
* 成体细胞不具有体外无限增殖能力，不
适于进行遗传修饰；而胚胎干细胞刚好 相反，所以普遍用于转基因动物特别是 基因敲除动物的制作。
胚胎干细胞法流程图
目的基因克隆、纯化
转染胚胎干细胞及阳性细胞筛选
受体囊胚腔注射 核移植至受体卵母细胞
胚胎移植
产生嵌合体 嵌合体之间交配 外源基因纯合阳性个体筛选
胚胎移植
产生阳性克隆个体
阳性个体的培育和建群
嵌合体动物：
组成一个动物个体的细胞来源于两 个或两个以上的动物品系或品种。
嵌合体动物制作方法：