第一章 环境微生物学基础

第一章环境微生物学基础要点：回顾微生物学的主要研究对象和基本方法；对微生物在自然界物质循环中所起的作用、微生物的代谢特征和生态习性有进一步的了解。

环境生物工程的本质就是将生物技术应用于解决环境保护领域中面临的问题，改善优化人类生存环境，促进人类社会与自然环境的和谐可持续发展。

与以往的利用物理化学手段解决人类生境恶化的方式不同，生物学方法更重视环境的自然规律，手段更为温和，对环境的再破坏更小，也更为经济可行，所以环境生物工程也受到越来越多的国家政府和企业的重视，人们也越来越自发的树立起良好的环境保护意识。

在环境生物工程中所涉及到的生物学内容主要是微生物学范畴(也含有部分动植物学内容)，所应用到的生物技术主要包括基因工程、微生物工程、酶工程、细胞工程等。

与环境生物工程密切相关的生物主要是微生物，包括原核的细菌、放线菌、蓝细菌；真核的原生生物(单细胞类，如鞭毛虫，肉足纲的变形虫、太阳虫、表壳虫，纤毛虫纲的草履虫、钟虫，孢子虫纲的疟原虫；显微藻)、微型后生动物(多细胞类，如轮虫、水蚤、线虫)、真菌、部分高等植物(水生陆生)；以及病毒。

这些生物涉及到水(给排水、循环冷却水、天然水体) 处理、空气污染生物治理、污染场地的生物修复、生物可降解材料的生产、生物能源的制取、重金属的吸附和有毒有害化合物的生物降解等。

一、微生物的定义、化学组成和分类1.微生物定义：一切肉眼看不清或看不见的微小生物的总称。

2.微生物细胞的化学组成：C、H、O、N、P、S、Fe、Mg、Ca、Zn…….3.分类.国际通用生物分类法则，林奈创立的“双名法”：属名+种名加词如：金黄色葡萄球菌Stapylococcus aures巴斯德酵母Saccharomyces pastori二、微生物在自然界物质循环中的作用1. 碳素循环碳素循环主要包括空气中的CO2通过光合作用生成有机化合物，以及有机物被分解释放出CO2到大气中，这是自然界最基本的物质循环。

光能和化能自养菌把大气中的CO2固定成有机碳----活细胞组分。

其中一部分有机碳通过食物链在生态系统中转移。

食物链各营养级机体的呼吸作用释放出CO2，机体的排泄物和尸体被还原者分解而释放出CO2。

在缺氧条件下，有机物分解一般不完全，积累的有机质经地质变迁形成煤、石油等矿物燃料。

这部分有机碳从生态系统中损失，当火山爆发或矿物燃料被开采后，其中的碳大部分再转变成CO2。

矿物燃料作为化工原料时，生产出各种各样非生物性含碳化合物，这使得碳循环变得更为复杂(人工合成的有机化合物不少是抗生物降解的)。

产CH4 菌利用有机物厌氧分解中产生的H2和CO2作为底物进行代谢活动，从而使有机物继续分解；生成的CH4逸入好氧环境被甲烷氧化菌氧化为CO2。

在有氧条件下，几乎所有的碳都转变为CO2。

1.1 碳的有机化(固定)1.2 有机碳矿化(CO2再生)2. 氮素循环产程中形成的N2O也是重要的温室气体。

2.1 固氮作用2.2 氨化作用2.3 硝化作用●进行硝化作用的微生物有：2.4 反硝化作用●进行反硝化作用的微生物有：3. 硫素循环4.磷素循环三、微生物的生物地球化学循环活动对环境造成的污染和危害●亚硝酸、亚硝胺和硝酸●氮氧化物和羟胺●硫化氢●酸性矿泉水三、微生物培养技术1.微生物菌种采样、灭菌1.1 采样微生物菌种主要来源于自然界或菌种保藏机构。

自然界中的微生物是混杂生长的，直接而快速获得所需菌种可以向菌种保藏机构索取有关菌种。

如中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM)、美国标准菌种保藏中心(ATCC)、英国国家典型菌种保藏所(MCTC)荷兰真菌中心收藏所(CBS)、德国科赫研究所(RKI)、日本大阪发酵研究所(IFO)、法国里昂巴斯德研究所(IPL)等。

采样就是根据微生物的生态特点从自然界取样分离所需菌种的过程。

如从堆积有枯枝落叶或朽木的地方分离产纤维素酶的菌种，从果皮上、果树下的土壤中分离酒精酵母，从豆科植物根部土壤中分离根瘤菌，从油田附近土壤中分离出石油酵母，从污泥中分离得到产甲烷菌，从海洋中分离出耐盐菌和低温菌等。

土壤是微生物生长的大本营，尤以细菌和放线菌居多(水体和大气中的微生物多数是从土壤中散发出去的)。

如果事先不了解某生产菌的具体来源，一般可先从土壤中分离；1ｇ表土中含微生物约为百万至数十亿个，且种类也因土质不同而有所差异。

从土壤中采样时应该注意以下几个方面：●土壤有机质和通风状况；田园土、耕作土层有机质丰富，土壤呈团状颗粒，通气保水性能好，微生物生长旺盛数量多，适于细菌和放线菌生长。

山坡林地植被厚，有机质丰富，阴湿，适于霉菌、酵母菌生长。

沙土、无植被山地、新开垦生土微生物种类数量都偏少。

●土壤酸碱度和植被状况；中性或偏碱(pH7.0—7.5)性土壤适于细菌和放线菌生长；偏酸性(Ph7.0以下)土壤适于霉菌和酵母菌生长。

果园菜地土壤中酵母菌较多。

●地理条件；南方土壤中微生物种类数量较北方多(温度湿度都适于)。

●季节与气候；春秋季节温度湿度适于微生物生长；土壤水分过多不利于好氧微生物生长(酵母菌，霉菌，放线菌)生长。

●采样方法：土壤采样在选好地点后，用无菌小铲剔出表土，取距地表5—15㎝处的土壤几十克，装入消毒牛皮纸袋或塑料袋中，作好标记(时间、地点、环境状况等)。

根据微生物生理特点采样：如森林土及肉类加工厂、饮食店排水沟的污泥中会有许多蛋白酶产生菌；粮食(面粉)加工厂、酒厂、淀粉加工厂等场所，容易分离出产淀粉酶、糖化酶的菌株；筛选高温酶产生菌时，通常应到温度较高的地方(南方、温泉、火山口附近及北方的堆肥中)采样；大多数微生物在中温、中性pH条件下生长，能在高温、低温、酸性、碱性、高盐、高辐射强的环境下生存的微生物被称为极端微生物。

1.2 灭菌灭菌是指用理化方法杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体。

常用的灭菌方法可分为物理和化学两类，即物理法---干热(烘烧或灼烧)、湿热(常压和高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等；化学法---升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏尔、漂白粉、抗菌素、酒精等化学药品处理。

2. 传统的微生物分离、纯培养技术用微生物纯培养技术对微生物进行分离纯化，这种获得单一的微生物包括纯种分离和培养两个过程。

纯种分离的方法主要有两大类，即单细胞或单孢子分离；以及单菌落分离。

微生物纯培养技术发展至今已经得到了广泛的重视和应用，直接影响了微生物学研究领域的进步。

纯培养技术使得研究者摆脱了多种微生物共存的复杂局面，从而能够不受到干扰地对单一菌落进行研究，确保了人类对微生物形态结构、生理和遗传特性的认识。

但是，随着研究的不断拓展和深入，环境中微生物实际数量同平板菌落计数之间存在巨大差异；造成这种差异的原因之一是由于实验室难以再现微生物的自然生存条件；另一方面，大种群微生物易形成生长优势而抑制小种群的生长。

因此，传统的纯培养技术总是重复筛选到相同的微生物，而多数难以被常规实验室方法培养的微生物被称为未培养微生物或不可培养微生物(Uncultured Microorganism)。

微生物自然生存环境的复杂多变造就了微生物的自然多样性，如结构多样性、代谢多样性、行为多样性、进化多样性、生态多样性等。

有学者根据现有的数据推测微生物种类数目应该在105-106，但用传统的微生物纯培养技术对不同生境微生物可培养性的验证来看，海水中可培养微生物约占0.001%-0.1%，土壤约占0.3%，活性污泥约占1%-15%。

有研究表明99%的微生物遗传多样性由于纯培养的困难而丢失，目前尚难以预测这些未培养微生物对人类的贡献。

因此，发现，认识和开发这一巨大的微生物资源对人类具有重大意义。

对获取未培养微生物的研究主要集中在两个方面：从DNA水平上通过分子生物学手段来研究它们在环境中的功能、分布和变化情况；其次是改进纯培养的培养方法，力图培养出尽可能多的微生物类群。

如①利用贫营养培养基取代富营养培养基，可抑制生长较快的微生物的大量繁殖，从而获得特殊的微生物；②模拟构建自然环境，如构建细胞微囊，尽可能模仿微生物在自然环境中的生存情况；③在培养基中加入微生物相互作用的信号分子，简单地模拟微生物间的相互作用，满足微生物生长繁殖的要求；④提供新型电子供体和受体。

提供微生物需要的特殊底物有助于新陈代谢反应的进行及微生物的正常生长。

⑤分散微生物细胞。

自然界生长着的微生物常常聚集形成絮体或颗粒，用超声波适度处理微生物使细胞分散后再行培养，可以使更多微生物接触到培养甚而是得到培养；⑥利用琼脂替代物(如古兰糖胶)作为固化剂，可以增加微生物的可培养性。

微生物的纯种分离技术是微生物学中重要的基本技术之一；从混杂的微生物群体中获得单一菌株纯培养的方法称为分离。

①固体培养基上的分离：主要有平板表面划线法、平板表面涂布法、琼脂培养基浇注法、组织分离法(主要用于分离高等真菌和某些植物病原菌。

取一小块植株或器官组织用体积分数为0.1%的升汞—HgCl2溶液进行表面消毒3—5分钟，然后用无菌水洗涤数次，移置到培养基中适温培养；3—5天后，病变组织内潜伏的微生物可向组织块周围扩散生长，经菌落特征和细胞特征观察确认后，即可由菌落边缘挑取部分菌种转入斜面，对于能产生弹射孢子的高等真菌而言，可将消过毒的菌盖剪成黄豆大的小块，悬挂在装有PDA培养基的三角瓶内，从而能较快地获得纯培养)、选择培养基分离法。

②液体培养基中的分离：主要是液体稀释法，首先将待分离的材料接种于培养液中，经培养测定或估计单位容积中的含菌数目，然后进行稀释，使稀释后的一定容积液体中大约只含1个微生物个体；其次则将巳稀释好的菌液1滴(0.05ml)接种于含液体培养基的试管中，摇匀，静置培养24—48小时后，观察如果管底只出现1个菌落，它可能就是由一个细胞繁殖而来，该法适于细胞较大的微生物。

2.1 微生物的培养方法可分为实验室固体(好氧、厌氧)培养和液体(好氧、厌氧)培养以及生产实践固体和液体培养。

液体培养法：①在常压常温(20℃)达到平衡时，氧在水中的溶解度为 6.2ml/L(0.28 mmol/L)；这些氧只能保证氧化8.3㎎(0.046 mmol/L)葡萄糖，仅相当于培养基中常用葡萄糖浓度的1‰。

因此对好氧菌而言，生长的限制因子几乎总是氧的供应；在进行液体培养时一般可通过增加液体与氧的接触面或提高氧分压来提高溶氧速率。

如浅层液体培养、摇床三角瓶振荡培养、液体深层培养器底部通入加压无菌空气培养、液体机械搅拌培养。

②液体深层厌氧培养时，一般采用加有机还原剂(巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C或庖肉等)或无机还原剂(铁丝等)，在其上封以凡士林—石蜡层以保证氧化还原电位(Eh)达到-150～-420mV。

1. 称取新鲜除脂肪和筋膜的碎牛肉500g，加蒸馏水1000mL和1mol/L氢氧化钠溶液25mL，搅拌煮沸15min，充分冷却，除去表层脂肪，澄清，过滤，加水补足至1000mL。