微生物知识培训

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无菌操作
• 人员
– 穿洁净实验服，露出手臂 – 热水皂液洗手；70%乙醇消毒手和手臂
• 操作
– 靠近火焰上半球操作 – 所有器具接触培养物的部分必须无菌 – 注意避免微生物污染
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培 养
• 倒置培养 • 适当的温度
– 细菌：35℃ – 霉菌、酵母：28℃ – 大肠菌群：35℃
• 保持一定的湿度
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什么是微生物
ю特点
• “短”—个体微小：（<0.1mm）需借助显微镜 观 察 • “平”—构造简单：单细胞，简单多细胞或非细 胞 • 快—繁殖快速：20分钟一代，一天内1个 10亿 • 多—种类多样：细菌、真菌、病毒、藻类、原生 动物 • 广—分布广泛：土壤、空气、水和极端环境中
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什么是微生物
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影响微生物生长的因素
• 外部因素
– 温度 – 氧气 – 相对湿度
• 内部因素
– 水分活度 – pH – 营养要求 – 抑制剂
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温 度
• 每种微生物只能在一定范围生长
– 微生物生长有最适、最低和最高温度 – 根据最适生长温度分三类
• 嗜热菌 >45 ℃ • 嗜温菌 20~45 ℃ • 嗜冷菌 <20 ℃
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Saccharomyces酿酒酵母
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Contamination photo
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其他微生物
• 寄生虫：在水中存在 – Amoeba变形虫, Cryptosporidium隐孢子菌 • 水处理系统的多重障碍可去除 • 病毒 : – 极其微小(0.02~0.3um)，需借助 电镜观察 – 分子生物，没有细胞结构 – 通过患病的人员和动物传染 – 无耐热型，消毒剂也易灭活病毒 • 不在饮料中生长的微生物，因此不是破坏饮料的因 素
• 概念:形体微小,结构简单,用肉眼难以看到,必须借助 光学显微镜或电子显微镜才能看清的低等微小生物 的统称. • 特点:体积小,结构简单,代谢旺盛,繁殖迅速,易于变 异,分布广泛. • 分类:可分三大类 • 非细胞型微生物:如病毒 • 原核细胞型微生物:如细菌,衣原体,支原体,放线菌等 • 真核细胞型微生物:如真菌,原生生物
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取 样
• 准备工作
– 取样工具：消毒，灭菌 – 一次性无菌取样袋 – 取样标签 – 样品存放容器：清洁，干燥
• 取样
– 采样均匀 – 避免污染
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取 样
• 样品的标记，保存和运送
– 标记准确，牢固 – 及时保存常温冷暗或0-5℃ – 安全运送
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无菌操作
• 工作区域准备
– 独立的无菌室或超净台 – 紫外灯消毒台面、地面 – 门窗关闭，避免扬尘 – 用70%乙醇消毒台面
霉菌孢子污染
12 10 8
每瓶孢子数
6 4 2 0
CFU / 瓶
未
24
打
开
的
托
盘
上 卸 垛
机
上 过 洗 瓶
机
前 过 洗 瓶
机
后
通
通
霉菌在饮料中生长
25
photo
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27
28
29
酵 母
• 通常是单细胞
– 个体比细菌大 – 截留孔径0.8um
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酵母
酵母在自然界中到处存在 酵母被用来制作面包，啤酒， 葡萄酒和许多有用的产品 当酵母在人们不希望它存在的 地方生长， 地方生长 ， 它将改变产品的特 性，破坏产品： 产生气体 导致胀包 即使是少量酵母也能影响饮 料的风味 若有适宜的环境，酵母在管道， 垫圈和阀门中迅速生长 不耐热
7
8
9
10 11 12
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营 养 成 分
• 食物残渣可提供各种营养
– 水分 – 碳源 – 氮源 – 维生素（生长因子） – 矿物质
• 通过有效清洗消毒程序控制
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抑 制
剂
• 抑菌剂——抑制微生物生长和繁殖
一些公认为安全的食品防腐剂
饮料防腐剂 苯甲酸（ 苯甲酸（盐） 山梨酸（ 山梨酸（盐） 对羟基苯甲酸酯 最大允许量 0.1% 0.2% 0.1% 抑制的微生物 酵母和霉菌 霉菌 酵母和霉菌
复染色法 制片→固定→染色→媒染→脱色 →复染→水洗→干燥
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革兰氏阳性杆菌
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革兰氏阳性葡萄球菌
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革兰氏阴性杆菌
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培养基制备
•
–
购买
选择质量好的培养基，注意保质期，记录收货期
•
–
贮存
30℃以下，避光，最长三年，在保质期内使用
•
制备
1. 2. 3. 4. 5. 准确称取各组分，一次完成，不要中断 混合后，煮沸1分钟，充分溶解 分装，装量<75%容积 灭菌，按配制说明灭菌，不要超时，防止过热 4℃以下存放
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pH
• 每种微生物都有一定的pH生存范围
– 大多数细菌
• 最适pH 为6.5~7.5， • 生存范围为pH 4~10
– 致病菌不能在pH 4.6以下生长繁殖
– 霉菌和酵母
• 最适pH 为5~6， • 生存范围为pH 1.5~10
大多数软饮料的pH (<4)不适合细菌生长
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Product classification
7
饮料中微生物
• 对饮料生产的影响
腐败变质
酸、色、气、味
食源性疾病 经济损失 毁誉品牌
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饮料中微生物
三种主要的微生物
细菌 水、土壤、 土壤、 人员 霉菌 空气、木制 空气、 品、纸制品 酵母 地面、糖浆 地面、
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细 菌
• 个体小（细胞直径0.5~5um）
– 截留孔径0.45um
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细 菌
• 形态多样
• 细菌:按外形分三类
– 球菌 – 杆菌 – 螺旋菌
• 真菌:按形态分二类
– 单细胞真菌 俗称酵母菌 – 多细胞真菌俗称霉菌
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饮料中微生物
• 主要来源
• 环境（空气、墙壁、地面） • 原料（水、糖、CO2气、果汁、主剂） • 设备（生产、贮存、运输） • 包装（瓶、罐、纸箱、收缩膜） • 人员（生产、品控、运输、保洁） • 虫害（昆虫、鼠类、鸟）
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Product contaminants
(microorganism that can grow in high or low acid products)
pH ranges for Microbial Growth Escherichia coli Lactobacillus spec. Staphylococcus spec. Lactococcus lactis Molds Yeast
– 显微镜下的个体（高倍镜或油镜）
• 细胞形态 球状、杆状、弯杆状、螺旋状 • 联合形态 双球、四球、链状、葡萄状
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细 菌
• 形态多样
– 固体培养基上的菌落
颜色 形状 红 点 粉 圆 黄 丝线 橙 不规则 绿 紫
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表面 扁平 隆起 脐状 皱褶 干燥 湿润
边缘 整齐 模糊 裂片
其他 光泽度 透明度 质地 大小
• 霉菌：孢子在一些关节点可进入产品
– 原料:
– 尤其是热带水果：菠萝，西番莲子，..
– 空包装 :
– 生产时清洁，但在运输，储存时受到污染
– 盖子 :
– 生产时清洁，可能在工厂内受到环境污染
– 在灌装、封口周围的空气 :
– 产品暴露时潜在的污染点
– 冷却水 :
– 再循环利用时的污染
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在储存和加工时容器的污染
– 每一系列的测试至少需2个对照： 空气；设备及水
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膜过滤法
• 培养皿准备
– 加1.8ml液体培养基，浸湿纸垫 – 在培养皿上编号做样品标识
• 过滤设备消毒灭菌
– 121℃，15分钟
• 一次性无菌滤膜（直径47mm）
– 0.45μ：细菌总数和大肠杆菌 – 0.8μ： 霉菌和酵母
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膜过滤法
连接抽滤系统
– 霉菌和酵母的耐热性比细菌差
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温 度
• 利用温度防腐、消毒和灭菌
-18℃ ℃ 几乎所有 微生物的 生长都停 止，只有 少数能存 活。
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0~5℃ ℃ 腐败微生 物繁殖受 阻，几乎 所有致病 菌的生长 都停止。 都停止。
50~65℃ ℃ 10分钟 分钟 多数微生 物的营养 体和病毒 被杀死。 被杀死。
– 培养箱中置一杯水
Hale Waihona Puke Baidu
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培 养
• 定时查看，并做记录
– 细菌总数：培养24小时、72小时计数 – 霉菌和酵母：2天、3天、4天、 5天时计数 – 大肠杆菌：24小时后出现金属光泽
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计 数
• 计数场所洁净，明亮
– 擦净培养皿的底部
• 可借助放大镜观察 • 有霉菌生长的平皿不可打开皿盖 • 每块平皿上最佳数量为30~300
• 相对湿度(RH)=100%×水分活度(Aw)
– 绝大多数腐败细菌在Aw低于0.91就无法生长
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产品的水分活度
Aw
0.99 0.95
产品
单倍果汁 浓缩橙汁(42 浓缩橙汁(42 °Brix)
可生长的微生物
细菌，酵母， 细菌，酵母，霉菌 细菌，酵母， 细菌，酵母，霉菌 酵母， 酵母，霉菌 霉菌
0.90 饮料主剂 (≈ 50 °Brix) 0.85 浓缩果汁(> 62 °Brix) 浓缩果汁(>
in high acid: • yeast • moulds • lactobacillus (effect on health are limited) in low acid: • wide range of bacteria (heavy effect on health)
0
1
2
3
4
5
6 pH
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微生物试验方法
• 显微技术 • 染色技术 • 灭菌和消毒 • 培养基制备 • 取样 • 无菌操作 • 培养 • 计数
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光 学 显 微 镜
• 结构
– 光学放大系统 – 机械装置
• 使用方法
– 固定→调光→粗调→微调 – 低倍→高倍→油镜
• 保养
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染 色
单染色法 涂片→固定→染色→水洗→干燥
细 菌
• 繁殖迅速
– 二分裂快速繁殖 – 1~2天使饮料变质
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稳定期
细 胞 数 的 对 数
死亡期 对数期
期
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细 菌
• 适应性强
– 有些种类能产生 芽胞，耐热、耐 酸碱
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Bacteria: Smaller Than the Eye Can See
Photo of a surface with bacteria
121℃ ℃ 15分钟 分钟 所有微生 物（包括 芽胞） 芽胞）均 被杀死。 被杀死。
氧 气
• 根据对氧的需求把微生物分三类
– 好氧菌
• 霉菌好氧，受高浓度CO2(5~8%)抑制
– 厌氧菌 – 兼性厌氧菌
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相对湿度和水分活度
• 细菌要求的相对湿度比酵母霉菌高
– 细菌最适相对湿度 ≥92% – 酵母最适相对湿度 ≥90% – 霉菌最适相对湿度 85~90%
Photo of a cleaned and sanitized surface without bacteria
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Bacteria
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霉 菌
• 多细胞微生物
– 由直径30~300um管状细胞组成
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霉菌
• 生长曲线呈直线型，无对数生长期 : – 霉菌生长速度比细菌和酵母慢 • 霉菌产生孢子，其中有些是耐热的 • 霉菌生长过程可用肉眼观察 • 一些霉菌能产生真菌毒素： – Patulin棒曲霉素: Penicilium expansum展开青霉, 某些 Aspergillus曲霉 – Aflatoxin黄曲霉毒素, Ochratoxin 赭曲毒素
• 真空泵—缓冲瓶—集液瓶—抽滤器 抽滤系统 真空泵—缓冲瓶—集液瓶—
– 真空泵—缓冲瓶—集液瓶—三联 抽滤 （六联）抽滤器
饮料微生物知识
1
内容
• • • • • 微生物概论 饮料中微生物 影响微生物生长的因素 微生物试验方法 审核中发现的问题
2
微生物概论
• 什么是微生物 • 饮料中的微生物 ——来源、种类、对饮料的影响 • 影响微生物生长的因素 ——如何控制微生物污染
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什么是微生物
ю极微小的生物体的总称(Microorganism)
– 若无菌生长，则记录为<1 – 若>300，则可估读数
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饮料微生物检测方法
• 膜过滤法 • 标准平板计数法 • 显微直接计数法 • 平板接触法 • 棉拭法 • 快速微生物检测法
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膜过滤法
• 何种情况下使用
– 可以过滤的样品 – 样品含菌量相对较少≤300cfu/ml
• 可富集微生物，更灵敏 • 使用对照
(according to pH)
Low acid teas Milk Tea+milk Coffee+milk Flavoured milk Ice Tea Sport drinks Apple juice Orange juice CSD 0 1 2 3 4 pH 5 6 7 8
High acid product Low acid product
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霉菌:长什么样 ?
Rhizopus根霉
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霉菌产生三种孢子
孢子类型
Conidia 分生孢子 Chlamydospores 厚垣孢子 Ascospores 子囊孢子
耐热度 最高存活温度
低温 中温 高温
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71°C 90°C > 100°C
霉菌的分生孢子
Penicillium青霉
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霉菌的破坏性