鸟类性别鉴定方法探究及红腹滨鹬性别鉴定

鸟类性别鉴定方法探究及红腹滨鹬性别鉴定
红腹滨鹬（Calidris canutus）隶属于鸻形目(Charadriiformes)、鹬科（Scolopacidae）、滨鹬属（Calidris）。

该物种已被列入国家林业局2000年8月1日发布的《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名目》。

在鸟类中 ,雄性的染色体是同型的(ZZ 型),而雌性是异型的(ZW型)。

在大多数鸟类中,Z 染色体较大,且含有几乎所有已知的性连锁基因,SOX9,AMH , WT1,SF1,DAX1等。

性别是有性生殖物种的最重要特征，雌雄个体往往在生理、行为、生态等领域具有差别．对一些在外观上难以辨别雌雄或特殊情况下的鸟类进行性别鉴定对鸟类的全面认识、对濒危种类的保护和管理、繁殖与育种、种群结构和群体遗传分析等方面均具有重要作用。

形态学方法
主要有目测性器官或通过外科手术的方法 ( 剖腹和镜检 ) 对生殖腺直接观察 ,目测性器官是利用不同性别泄殖腔形态差异进行鉴定。

但鸟类生殖器官在体内 ,不易从外表辨别 ,鉴定时对鸟类的刺激较大 ,而且鸟类的性器官外形有很多不同形状 ,只有经过专业训练的技术人员才能成功地运用 ,主观性强。

外科技术尤其是镜检技术虽然也在不断改进 ,但对鸟类均有不同程度的伤害 ,对一些体积较小的鸟类 ,可能会导致鸟的死亡或不育 ,对于珍稀鸟类来说尤为不适合。

还有对个体的体形大小、个体高矮、头额宽度、面颊大小、跗踱长短、翅长、尾长等体尺进行测量比较来进行性别鉴定的方法,但准确性不高。

【11-13】
2.1.2细胞生物学方法
鸟类性染色体异配性别为雌性(ZW),同配性别为雄性(ZZ) ,这说明雌性有一条特异的 W 染色体,细胞学技术主要就是对W染色体进行观察,雌性的性染色体一条大(Z),一条小(W),而雄性个体两条均较大(ZZ)。

大体过程是:对羽髓或血液等样品用胶原酶处理后 ,加入培养基对细胞进行培养。

离心低渗制片染色镜检 ,镜检时要选择染色体分散 ,形态良好的中期细胞进行。

理论上用镜检技术进行性别鉴定很容易 ,准确率可达 100 %。

但在实际当中存在一些问题 ,例如 ,鸟类的染色体数量大(40～126不等),分为大染色体和小染色体 ,Z 染色体为大染色体 , W染色体为小染色体。

在检测中 ,想把染色体分散检测比较困难 ,分析性染色体需要用高质量的分裂中期的细胞,操作过程比较烦琐。

而且大与小的划分很容易造成人为的主观差错。

而且采集血样对鸟类的伤害性也比较大,不适于珍稀鸟类的性别鉴定 ,但在其他鉴定方法建立过程中可以将其作为一种有效的检验手段。

D NA含量测定法
由于W染色体比 Z 染色体小得多 ,因此每个雄性细胞的 DNA 含量比雌性的多。

这已被用来作为一种鸟类性别鉴定方法 ,即用碘化丙锭 ( EB ) 对雌性和雄性细胞核进行染色 ,再用流体细胞计进行检测。

雄性和雌性 DNA 总量的差别随鸟类的不同 ,在0. 6 %～3. 5 %之间变化【18】。

2. 2. 3随机扩增多态性DNA (RA PD )方法
AFLP可以直接扩增来自鸟类性器官组织的DNA ,然后进行测序 ,根据序列设计特异性引物进行选择性扩增PCR. 随机扩增多态性 DNA (RA PD )方法与扩增片断长度多态性(AFLP)方法相似 ,可以在不了解物种的基因组结构的情况下进行多态性分析 ,通过对比雌雄鸟PCR产物来鉴定性连锁标记物. 国外已有报道 [ 10 ] , 1999年M athias K« lliker等在研究大山雀雏鸟的性比时 ,采用RAPD 方法进行性别鉴定. 国内杨光等也利用RAPD 方法成功鉴别了3种鹤的性别[11。

]同 A FLP法相比 , RAPD 法操作简单 ,样品用量少、可用较短的引物进行PCR 扩增 ,由于具有较高灵敏度 ,可用琼脂糖电泳对随机扩增产物进行对比 ,无需聚丙烯酰胺电泳、辐射性标记物和高压液态色谱纯化引物 ,因此RA PD 法优于 A FLP法. RA PD 法是鸟类性别分子鉴定最初使用的方法.但是 RA PD 方法和
A FLP 方法工作量大 ,数据处理繁琐 ,成本也很高 ,因此一般将这种方法作为发现新遗传标记的基础方法. 可以通过随机扩
增找出适合于广泛鸟类性别鉴定的通用序列进行新引物和新方法的研究 [ 10～12 ].
2.2.4DNA 印记杂交
利用W染色体 DNA 的核酸探针与 W 染色体的 DNA 进行特异性结合 ,作为鸟类性别鉴定的一种分子方法. 1989 年 U ryu等对鸡 W 染色体特异的Xho I 家族的重复序列进行了克隆和测序. [ 7 ]. 1997 年OgawaA 等利用荧光标记探针Southern杂交对几乎所有的鸟类包括平胸鸟类都进行了准确的性别鉴定 [ 8 ].利用 DNA 印记杂交技术能够清楚地鉴定性别 ,但染色体特异性 DNA 探针法一般比较费时 ,操作过程较复杂.
2.2．5性染色体特异性DNA 探针法
利用W染色体DNA的核酸探针与W染色体的DNA进行特异性结合,是鉴定鸟类性别的一种方法。

Uryu等(1989)对鸡W染色体特异的Xho I 家族的重复序列进行了克隆和测序【19】。

以带有生物素标记的0.7kb重复片段的重组质粒为探针，利用2种杂交技术，对白莱航鸡进行了性别鉴定。

但染色体特异性DNA探针法一般比较费时，操作过程较复杂。

2.2．6 PCR 法
鸟类的性别决定系统为ZW型(其中雄性为ZZ ,雌性为ZW ) ,所以凡是W染色体上的特异序
列或基因便成为人们寻找的主要目标。

截至目前,已发现W染色体上有一些基因( C HD1基因和A TP5A1 基因) 或假基因序列( EE0. 6 序列)是非常保守的,可以依此进行性别鉴
定。

2.2.6.1 HD-W 基因鉴定法【20-23】
Ellegren ( 1996 ) 克隆C了第一个定位在鸟类 W 染色体的基因 C HD1 。

C HD1 基因全称为染色体螺旋蛋白基因 ( Chro mo2helicase2DNA2Binding gene ) , 是一个功能性基因 ,它编码一个有关调节整个染色体水平上转录活性的蛋白 ,在鼠类只有 1 个同源拷贝 ,但在非平胸鸟类有2 个同源拷贝 C HD-W 和 C HD-Z ,其中 C HD-W 为W 连锁 ,C HD-Z 为 Z 连锁,两者的外显子序列和大小相似 ,内含子大小却有很大差别。

根据这个特性 ,利用内含子两侧保守序列设计特异性引物 ,可以利用 PCR 方法对 C HD-W 进行扩增 ,用于多种非平胸目鸟的性别鉴定。

由于 C HD2W 和 C HD2Z 具有一定的同源性 ,所以引物设计尤其重要，Griffit hs 等 ( 1996 ) 用 P2( 5’-T GCA TC GC TAAA TCC T T T-3’和 P3 ( 5’-GA TA T TCC GGA TC T GA TA GT GA-3’)2A引物对扩增了 C HD-W 和 C HD-Z 的部分片段 ,结果显示扩增产物大小是相同的 ,但他们发现 C HD2W扩增片段有 1 个 Hae Ⅲ酶切位点 ,而 C HD-Z 却没有 ,于是 ,在 PCR 之后先用 Hae Ⅲ处理 ,这样 ,雄性仍为 1 条带 ,而雌性为 2 条带 ,但这一引物对于平胸鸟类性别鉴定并不适用。

此外由于 P2 、引物对P3每次需要对扩增产物进行酶切 ,使得试验耗时 ,且成本高 ,于是 Griffit hs 等 ( 1998 ) 在对两个CHD基因进行比较后,对引物进一步改良,将 P3换为P8( 5’-C TCCCAAGGATGATRAAYT G-3 ,P2和P8 与C HD 基因中的外显子严格匹配 ,这两个引物间含有一段内含子序列 ,而这段序列是进化很快的 ,且在 2条性染色体上的大小不同 ,所以用此引物进行扩增 ,雌性会产生 2 条带 ,而雄性只有1条 ,这一方法不仅可以区分性别 ,同时也可作为 PCR 体系的阳性对照。

2.2.6.2 TP5A1 基因鉴定法【24】
ATP5A1 基因在鸟类 W 、Z染色体上以不同形式的序列出现 ,所以将染Z色体进行酶切并电泳后 ,通过基因中被称作 PMgl的序列作为探针进行原位杂交 ,会产生不同条带 ,进而区分性别。

但此基因的保守性不是很好 ,在不同种鸟中基因的序列有差异 ,所以在不同物种中需要不同的 A TP5A1 序列进行鉴定 ,这就给性别鉴定工作增加了很大的工作量。

但是由于平胸鸟类没有异源的染色体对 , W 染色体上主要是常染色质 ,与 Z 染色体具有相当高的同源性 ,因此 ATP5A1 基因鉴定法对于平胸鸟类的性别鉴定仍不失为一种有效的方法。

2.2.6.3 EE0.6 序列鉴定法
该序列从鸡的 W 染色体克隆而来 ,长度 0. 6kb ,含有 Eco R 片段 ,是一段单一序列,包含了一段类似于外显子的序列ET15 ,很可能是一个假基因 ,它在目前已被检测过的鸟类中都是保守的 ,虽然在W 、Z上有一段同源序列 ,但它们在大部分序列上却存在差异 ,可以通过选择合适的引物对 W 染色体上的特异性片段进行扩增 ,结果雄性不被扩增 ,而雌性会产生一条扩增带 ,因此得以区别。

但是该方法可能会在 PCR 反应中由于 PCR 扩增条件或加样错误等人为操作因素导致无条带产生故而认为是雄性 ,从而导致假性结果 ,还需要另外设计阳性对照条带来作为参照才能进行准确鉴定。

2.2.7扩增片断长度多态性(AFLP)方法
扩增片断长度多态性(AFLP)是利用随机引物扩增来鉴别鸟类性别的最常见的方法 ,在国外已有报道[28],这种方法可以从已知性别的鸟中扩增出三种类型的标记物. 这些标记物大多数是单型 ,只有第二种类型标记物是多态的 ,且在雌雄个体之间不同. 第三种类型标记被限制在单一性别中. 一旦标记物被发现 ,就能对鸟类进行性别鉴。

RAPD 可以在不了解物种基因组结构的情况下进行多态性分析，具有样品用量少、灵敏度高和检测容易等优点，但RAPD 方法工作量大，数据处理烦琐，成本也很高，因此一般将这种方法作为发现新遗传标记的基础方法。

可以通过随机扩增找出适合于广泛鸟类性别鉴定的通用序列进行新引物和新方法的研究。

与其他鸟类性别鉴定方法相比，PCR 方法具有以下一些优点：可以采用非损伤性取样法，采样材料为再生能力很强的羽毛，对鸟造成的应激反应较小；DNA 鉴定可以实现对性别的早期鉴定。

尤其是CHD-W 基因鉴定法，操作简便，周期短，大量的样品可以同时检测，更为重要的是通过双阳性结果来判断雌雄，排除了假阴性的可能，确保了结果的可靠性，是到目前为止最为简单快捷、准确可靠的鸟类性别鉴定的途径。

目前鸟类性别鉴定的方法主要分形态学方法、细胞生物学方法和分子生物学方法。

形态学方法费时、或费力或有较大的伤害性 ,精确度不高,而且需要专业技术人员。

对于珍稀鸟类来说尤为不适合。

细胞生物学方法主要利用Z、W 染色体在形态上的差别 ,通过判断组织培养细胞性染色体是Z 还是 W 来鉴定鸟的性别。

其准确率可达 100 %。

但是，分析性染色体需要用高质量的分裂中期的细胞 ,取材比较困难 ,操作过程比较繁琐。

而且对鸟类的伤害性比较大 ,不适用于生产实际。

分子生物学方法是近来发展起来的一种利用性染色体连锁基因探针或 PCR 扩增技术鉴别鸟类性别的新方法。

尤其是PCR法，是一种快速扩增特定DNA片段的方法，具有快捷方便，采样量少，鉴定精度高等特点。

因此，本研究采用分子生物学方法。

虽然已经有很多种性别鉴定引物被设计出来对鸟类进行性别鉴定，如P2/P8
sex1/sex2, 2550F/2718R, 2376F/2718R等。

P2/P8，sex1,sex2为鸡型目通用引物，本实验室已经做过环颈珩，天鹅，扩增CHD-Z和CHD-W的PCR产物大小十分相似，琼脂糖电泳很难区分，结果均为一条带，因此不能鉴定，推测不适用于水鸟，因此没有选择；2550F/2718R【27】，本实验室已经做过红隼，黑鹇，但实验结果并不是雌性为两条带，雄性为一条带，而是雌性和雄性具有不同大小的条带，雌性为一条450bp条带，雄性为一条600bp条带。

这可能是因为较短的CHD1W内含子优先扩增，导致雌性个体中检测不到CHD1Z产物。

另外，该引物在PCR扩
增反应条件中退火温度不是很稳定，部分样品采用梯度条件才检测出性别，增加了实验的重复检测次数。

Wu-Yi Liu等【29】发现引物2550F与CHD-Z基因有两个位点不匹配，2550F为5’端的T和3’端的A。

引物3’端位点对于PCR来讲是至关重要的，因为它会使得在较高的退火温度的情况下，引物和目标序列结合不稳定，从而使得PCR结果不稳定。

这也解释了本实验室红隼，黑鹇性别鉴定中出现的PCR结果不稳定的情况.因此选2376F/2718R，得到预期效果。

DL2000 DNA marker（从上到下条带大小依次为2000bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp）。